一种短距槽舌兰快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种珍稀濒危兰科植物的繁殖方法，特别涉及一种短距槽舌兰的快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域。
【背景技术】
[0002]i^^^tiMolcoglossumflavescensGchltr.) Z.H.Tlsi)为兰科(Orchidaceae')槽舌兰属(HolcoglossirnVam。产于福建北部(武夷山、建阳)、湖北西南部(利川)、四川西南部(攀枝花)、云南北部(宾川、永胜)。生于海拔1200?2000米的常绿阔叶林中树干上。短距槽舌兰为兰科中的珍品，其形态优雅，花色艳丽，并散发出芳香。可用蕨根等附植置于浅盆中，或悬挂，十分典雅。槽舌兰属植物共有12种，分布于东南亚至越南、老挝、泰国、缅甸、印度东北部，我国有8种。由于过度采集、走私出境猖獗、生态环境破坏严重等原因，近十几年来野生槽舌兰属植物的数量急剧减少，分布区逐渐萎缩，不少种类已经到了灭绝的边缘。针对野生野生槽舌兰因受掠夺性采挖和贸易，而导致该类群植物迅速减少甚至灭绝的状况，目前，槽舌兰属植物已被《中国物种红色名录》列为珍稀濒危物种。
[0003]短距槽舌兰每一花枝有花朵I至数朵，花梗纤细，长1.5?2厘米，花苞片阔披针形，长3?5毫米，花色为白色，中萼片和花瓣相似，倒卵状长圆形。由于短距槽舌兰生长分布区域狭窄，且原始生态环境又受损严重，致使野生短距槽舌兰种质已变得极为稀少，同时，短距槽舌兰的种子与大多数兰花种子一样，没有胚乳，在自然环境下极难萌发。槽舌兰属植物若仍然采用传统兰花分株技术，即起苗、洗根、分株、消毒等步骤进行繁殖，则增殖困难、系数较低，使短距槽舌兰的有效繁殖形成一道屏障，难以达到保护及开发的要求。
【发明内容】
[0004]为有效繁殖短距槽舌兰，本发明提供一种短距槽舌兰的快速繁殖方法，通过对培养基、培养路径等的筛选、集成创新，使短距槽舌兰的增殖系数到达5倍以上，成苗率达95%，移栽成活率达85%以上，实现了短距槽舌兰的保护及开发。
[0005]本发明通过如下技术方案实现:一种短距槽舌兰的快速繁殖方法，其特征在于经过下列各步骤:
(1)种子萌发:以生长健壮、无病虫害的植株为母株，按常规对短距槽舌兰进行人工授粉，授粉120天后，将蒴果成熟、无病、未破裂的完整果实进行常规灭菌后，切开果实取出种子，将种子接种于下列诱导萌发培养基中:Ms + 0.03?0.05mg/L 6-BA + 10?15%体积比的椰乳+ 80?100g/L的新鲜香蕉泥+30?35g/L的土豆泥+花宝I号I?3g/L+3?5g/L的活性炭+ 30g/L的蔗糖+6%质量比的琼脂，pH值为5.2?5.4，并进行暗培养至种子萌发，转入温度为22?24°C、光照时间为2?3小时/天、光照强度为100Ix的条件下培养30天，得到幼胚；
(2)原球茎的诱导:将步骤(I)所得幼胚转接到下列液体培养基中:l/2Ms+0.03?0.05mg/L的6-BA +0.1?0.3mg/L的TDZ+体积浓度10?15%的椰乳+80?100g/L的新鲜香蕉泥+50?55g/L的土豆泥+2?4g/L花宝I号+3?5g/L活性炭+30g/L的鹿糖，pH值为5.2?5.4 ;并在温度为22?24°C、光照时间为8?10小时/天、光照强度为ΙΟΟΟΙχ、转速为120r/min的条件下进行摇床下培养35天，且每10天更换一次新的上述液体培养基，之后用无菌筛网过滤后，得诱导后的体细胞胚；体细胞胚在解剖镜下观察，呈现类似于球状的细胞集合体，在原球茎的顶端有类似于芽尖组织出现；
(3)分化培养:将步骤(2)诱导出的体细胞胚转接到下列液体分化培养基上:l/4Ms+0.5 ?1.0mg/L 的 6-BA+0.1 ?0.3mg/L 的 NAA+ 体积浓度 10 ?15% 的椰乳 +80 ?85g/L的新鲜香蕉+50g/L的土豆泥+2?3g/L花宝I号+1?3g/L花宝2号+3?5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6%质量比的琼脂，pH值为5.2?5.4 ;并在温度为22?24°C、光照时间为8?10小时/天、光照强度为20001x的条件下培养90?120天，每20天更换一次新的上述液体分化培养基，直至培养出的膨大原球茎上分化出短距槽舌兰小苗；
(4)壮苗培养:切下步骤(3)的短距槽舌兰小苗，放置于下列壮苗培养基上:l/4Ms+0.5 ?1.0mg/L 的 6-BA+0.3 ?0.5mg/L 的 NAA+ 体积浓度 10 ?15% 的椰乳 +80 ?85g/L的新鲜香蕉+50?55g/L的土豆泥+1?3g/L花宝I号+3?5g/L花宝2号+3?5g/L活性炭+30g/L的蔗糖，pH值为5.2?5.4 ;并在温度为22?24°C、光照时间为8?10小时/天、光照强度为20001x的条件下培养，直至短距槽舌兰小苗长至2cm以上的高度，并具有2片及2片以上伸长叶片，即得壮苗；
(5)生根培养:从步骤(4)的壮苗基部黄褐色部位切下苗段，转接到下列生根培养基上:1/4MS+0.1 ?0.3mg/L 的 6-BA+1.0 ?3.0mg/L 的 NAA+体积浓度 10 ?15% 的椰乳 +100 ?120g/L的新鲜香蕉+50?55g/L的土豆泥+3?5g/L的活性炭+30g/L的鹿糖+6%质量比的琼脂，PH值为5.2?5.4 ;并在温度为22?24°C、光照时间为8?10小时/天、光照强度为20001x的条件下培养，直至壮苗高度达4?5cm，具有2片以上叶片，且根长3cm以上，即得生根植株；该生根植株在植株的基部有肉质、绿色根，且根长至3cm以上，每植株生根3条以上；
(6)炼苗移栽:每年进入3月后，将步骤(5)所得生根植株置于自然光下，在遮阴度为30%的条件下炼苗7?10天，然后洗净生根植株，将生根植株整株捆绑至潮湿树皮上，生根植株的基部包裹苔藓，保持基部的水分为80%，空气湿度为90%以上，并通风，即得炼苗后的组培短距槽舌兰，按常规移栽至树皮和兰石按3:1混合所得的基质中，即完成短距槽舌兰的快速繁殖。
[0006]所述步骤(I)的人工授粉是在每年的5?6月份，即短距槽舌兰开花的季节，待开花后5?7天，选取健康无病植株于晴朗无雨的上午10?12点进行授粉自交，自交前I天及自交后I天不对植株进行水喷淋。这样的人工授粉，能在授粉后90天蒴果成熟，外表转为褐色，即得饱满、健康、无开裂的蒴果。
[0007]所述步骤(I)的常规灭菌是将短距槽舌兰的蒴果经流水冲洗30min后，在超菌工作台上用体积浓度为70%的酒精擦拭蒴果表面，然后依次用无菌水洗涤3次、用质量浓度为0.1%的升汞灭菌lOmin、无菌水洗涤3次，再用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡lOmin，最后用无菌水洗涤3次，用无菌纸吸干蒴果表面的水分。
[0008]所述步骤(6)的洗净生根植株是用1/1000倍的多菌灵浸泡生根植株的全株10分钟。
[0009]本发明具有下列优点和效果:本发明填补了珍稀濒危兰科植物一一短距槽舌兰无性繁殖的技术空白，从根本上解决了短距槽舌兰的资源保护问题及产业化开发应用的难题。本发明与传统分株方法相比，短距槽舌兰的增殖系数提高5倍以上，成苗率达95%，移栽成活率达85%以上，同时具有增值系数大、分蘖能力强、生长速度快、植株健壮、褐变率低、移栽成活率高、培养基配制简单、成本低等问题，能适应大规模工业化生产。
【具体实施方式】
[0010]下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0011]实施例1
(1)种子萌发:以生长健壮、无病虫害的植株为母株，按常规对短距槽舌兰进行人工授粉，即在每年的5?6月份，即短距槽舌兰开花的季节，待开花后5?7天，选取健康无病植株于晴朗无雨的上午10?12点进行授粉自交，自交前I天及自交后I天不对植株进行水喷淋；授粉120天后，将蒴果成熟、无病、未破裂的完整果实进行常规灭菌，即将短距槽舌兰的蒴果经流水冲洗30min后，在超菌工作台上用体积浓度为70%的酒精擦拭蒴果表面，然后依次用无菌水洗涤3次、用质量浓度为0.1%的升汞灭菌lOmin、无菌水洗涤3次，再用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡lOmin，最后用无菌水洗涤3次，用无菌纸吸干蒴果表面的水分；切开果实取出种子，将种子接种于下列诱导萌发培养基中:Ms + 0.03mg/L 6-BA + 10%体积比的椰乳+ 80g/L的新鲜香蕉泥+30g/L的土豆泥+花宝I号lg/L+3g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6%质量比的琼脂，pH值为5.2，并进行暗培养至种子萌发，转入温度为22°C、光照时间为2小时/天、