一种狄斯瓦螨唾液混合物及其制备方法和应用
【技术领域】
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[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种狄斯瓦螨唾液混合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
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[0002]养蜂业是我国的特色产业，也是我国的传统产业。目前我国饲养的蜜蜂种类主要是意大利蜜蜂(Apismellifera)和中华蜜蜂(Apis cerana)。我国蜜源植物丰富,蜂产品种类繁多，是世界最大的蜂产品生产国和出口国。现有蜂群数达700万群，占世界蜜蜂总数的12%左右。年产蜂蜜28万吨，占世界产蜜量的20%之多，蜂王浆年产3000吨左右，占世界贸易量的95%以上，另外，年产蜂花粉3500?4000吨，蜂胶300?350吨，蜂蜡4000吨，出口雄蜂蛹40吨以上，全国有加工、流通企业达2000多个。蜂业年总产值80亿元左右(李位三，2009)。中国的蜂产品70%用于出口，日本、美国、欧盟各占约三分之一左右。蜂业被誉为“甜蜜的事业”。
[0003]狄斯瓦螨(Varroa destructor Anderson&Trueman) 一直是世界养蜂业最主要的危害之一，目前全球范围内仅澳大利亚未发现(周婦,2005 ；Rosenkranz et al., 2010)。狄斯瓦螨吸食蜜蜂成蜂或幼虫的体液，造成蜜蜂体质下降，同时降低蜜蜂的认知能力与方向感(Kralj et al., 2007),降低出勤蜂返巢率,缩短蜜蜂的寿命(Dainat et al., 2012),蜂群群势衰弱。最主要的是狄斯瓦螨还传播蜜蜂细菌和病毒病害(Tentcheva et al.，2004 ；Yan et al.，2009 ；Prisco et al.，2011，Ai et al.，2012)，并通过抑制宿主免疫抑制反应激活这些潜伏病毒(Yang&Cox-foster, 2005 ；Santillan-Galicia et al., 2008)。在美国、希腊等国出现的蜜蜂蜂群崩溃失调病(CXD)造成世界恐慌，引起科学家的高度重视，经研究其发病原因与蜂螨的危害有关(Cox-Foster et al., 2007)。每年我国养蜂业仅蜂螨造成的直接损失就达到几亿人民币，而且因防治蜂螨使用药物造成蜂产品污染(王强等，2006 ;吴杰等，2007 ;周婷等，2007)和狄斯瓦螨抗药性及药物残留对环境的影响更是无法估量(胡福良等，2004 ;黄文诚，2005 ；Satta et al.，2005 ;曾志将等，2007 ；Adamczyk et al.，2010 ；Damiani et al., 2011 ；GonzaIez-Gomez et al., 2012)。
[0004]值得注意的是，作为原始寄主的中华蜜蜂与狄斯瓦螨在长期相互适应的过程中产生耐受性，即使被狄斯瓦螨寄生也不会造成蜂群毁灭性的破坏。有数据表明，中华蜜蜂将狄斯瓦螨种群控制在800只/箱以内，则可以维持蜂群的稳定(Peng et al.，1987a, b ；Delfinado-Baker & Peng, 1995 ；Rath, 1999)。研究表明，影响中蜂群内狄斯瓦螨种群大小的因素主要有三个方面:狄斯瓦螨繁殖力(Reproduct1n)，中华蜜蜂的抗螨行为以及狄斯瓦螨的自然死亡。影响狄斯瓦螨繁殖力的因素有:1)雌螨的生育力；2)蜜蜂蛹的封盖历期；3)蜜蜂幼虫的吸引力；4)巢房大小。中华蜜蜂的抗螨行为有理毛行为(grooming behav1ur)和清洁行为(Hygienic behav1ur) (Rath, 1999)。早期文献(Rothenbuhler, 1964)对清洁行为的定义是比较狭隘的，单纯指中蜂“打开房盖并移走受感染的病虫”。但是这种开盖及移走行为不是专门针对瓦螨的，而是普通的清理行为，针对所有的外来物质或者受微生物危害的幼虫。后来，Rath(1999)对此进行了补充，把清洁行为定义为“开盖，移走及埋葬幼虫”的行为。蜜蜂能够很快移走工蜂房中的死幼虫而雄蜂房中的死幼虫则很难被移走，中蜂的工蜂让死亡的雄蜂幼虫留在房内而不去开盖(雄蜂房有厚厚的茧也不容易打开)，从而埋葬了受狄斯瓦螨感染或患病致死的雄蜂幼虫。
[0005]狄斯瓦螨是否对中华蜜蜂有毒性作用呢？这里，被大家忽略的一个细节是狄斯瓦螨吸食蜜蜂血淋巴的行为过程。为了吸食蜜蜂的血淋巴，狄斯瓦螨必需刺破蜜蜂的表皮和体壁形成一个小孔，然后维持这个小孔开放方便其重复吸食及其后代吸食(Kanbar&Engels, 2003，2005)。而通常情况下，当昆虫的表皮及上皮组织受到损伤时，会激活昆虫的免疫反应以及修复损伤反应从而阻止病原的侵染和血淋巴的流失(Th印old etal.，2002 ；Dushay, 2009)。但是，狄斯瓦螨吸食蜜蜂形成的孔并不会马上愈合。相同情况下，姬小蜂(Eulophus pennicornis)寄生于宿主是依靠于其幼虫的分泌物破坏宿主血细胞并且抑制宿主的免疫反应(Richards and Edwards, 2002)。其他节肢动物(如蚊子，采采蝇等)吸食脊椎动物体液则是通过唾液分泌物抑制宿主反应从达到吸食目的(Ribeiro，1995 ；Kariithi et al.，2011)。狄斯瓦螨是否在吸食过程中也分泌唾液呢？研究表明，狄斯瓦螨在吸食过程中分泌唾液并通过抑制血细胞凝集而阻止宿主伤口愈合(Richards etal.，2011)。
【发明内容】
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[0006]本发明的第一个目的是提供狄斯瓦螨的唾液在制备致死蜜蜂预蛹制剂中的应用。
[0007]本发明的第二个目的是提供一种具有致死蜜蜂预蛹活性的狄斯瓦螨唾液混合物，该狄斯瓦螨唾液混合物是通过以下方法制备的:
[0008]收集狄斯瓦螨唾液，用TC-100培养基溶解，离心取上清，上清上B1-Gel P6凝胶柱，洗脱用0.0lM pH7.68Tris-HCl缓冲液，流速为1.5mL/min,收集第一个蛋白洗脱峰，即为狄斯瓦螨唾液混合物。
[0009]本发明的第三个目的是提供上述狄斯瓦螨唾液混合物在制备致死蜜蜂预蛹制剂中的应用。
[0010]本发明首次发现，狄斯瓦螨的唾液对中蜂工蜂预蛹具有致死作用，进一步纯化分析，纯化后的狄斯瓦螨唾液混合物仍然对中蜂工蜂预蛹具有致死作用。因此两者都可以用于制备致死蜜蜂预蛹制剂。纯化后的狄斯瓦螨唾液混合物含有能致死中蜂工蜂预蛹的活性物质。本发明为在基础科学研究狄斯瓦螨危害蜜蜂的机理创造了条件。
【附图说明】
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[0011]图1是狄斯瓦螨唾液过B1-Gel P6 (B1-Rad, N0.732-4502)凝胶柱的