一种黄瓜棒孢叶斑病抗性鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及内容为黄瓜棒孢叶斑病离体抗性材料的鉴定方法，属于植物保护
技术领域。
[0002]
【背景技术】
[0003] 由多主棒抱（引起的黄瓜棒抱叶斑病（Corynespora leafspot)是近年来黄瓜生产中危害较为严重的一种病害，该病害主要侵染黄瓜的叶片、 茎和果实。1906年欧洲首次报道黄瓜棒孢叶斑病，1957年美国北卡来罗纳州报道该病发 生，1960年我国戚佩坤等报道了该菌在我国黄瓜上的寄生为害，随后自2005年开始在我国 许多黄瓜栽培地暴发，给农民的生产带来巨大的损失，成为黄瓜生产中的主要病害，据不完 全统计对农民造成的经济损失超过2亿。
[0004] 对于黄瓜棒孢叶斑病的防治包括抗病品种选育、化学防治和生态防治等多方面， 抗病品种选育是最经济、有效、环保的措施。抗病性鉴定贯穿于抗病育种的全过程，是抗源 挖掘利用、抗病育种、抗性监测等工作中重要一环。因此，准确有效的抗病性鉴定方法是决 定抗病育种成败的关键。
[0005] 在对黄瓜棒孢叶斑病抗性材料鉴定中，主要采用苗期人工接种的方法。苗期人工 接种鉴定在应用过程中接种苗龄、接种方法、培养环境的不同及调查方式的不可控性，鉴定 结果往往具有差异。多主棒孢菌能够产生寄主选择性的毒素蛋白，该毒素溶液接种黄瓜叶 片可以直接感染产生病斑，因此可以其代替病原菌作为选择压力来鉴别和筛选抗病品种。 [0006]目前，多主棒孢毒素在橡胶棒孢叶斑病的抗病性鉴定中起到了很好的应用，但在 黄瓜棒孢叶斑病的抗病性鉴定中应用较少。目前，仅陆海宁、吴利民等在毒素对黄瓜抗、感 病品种的生理指标影响、细胞壁损伤和相关抗性酶活性指标变化上有过相关报道，而未形 成系统的以其应用于黄瓜棒孢叶斑病的抗病性鉴定的方法 本发明对多主棒孢菌液体培养物经提取纯化后获得其特异性的粗毒素滤液，在此基础 上建立黄瓜棒孢叶斑病离体抗性材料快速鉴定方法。
【发明内容】
[0007] 鉴于现有的黄瓜棒孢叶斑病苗期抗性鉴定方法的不足，以多主棒孢毒素在橡胶抗 病性鉴定中的应用为参考，本发明提供一种操作鉴定、成本低、速度快、准确性强、重复性 好、适应于黄瓜抗病育种中的黄瓜棒孢叶斑病抗病性鉴定方法，以加速黄瓜棒孢叶斑病抗 病育种工作的开展。
[0008] 为了实现上述目的，本发明"一种黄瓜棒孢叶斑病抗性鉴定方法"，包括以下步 骤： 以新鲜、健康、完整的黄瓜真叶作为侵染鉴定材料，该鉴定材料叶龄为黄瓜3片真叶时 期植株上的第2片真叶的离体叶片； 以无菌的多主棒孢（ca^iicoJa)毒素滤液为接种体，该接种体的获得通 过以下步骤： 将活化的多主棒孢接种于Czapek液体培养基中，120rpm/min，摇床培养21d后，采用双 层纱布过滤培养液，除去菌丝体，回收滤液，将回收到的滤液离心5000rpm/min，30min后， 收集上清液，采用〇. 45ym微孔滤膜进行过滤除菌，回收无菌滤液作为抗病性鉴定的接种 体； 将配得的无菌毒素滤液无损伤悬滴接种于新鲜、健康、完整的黄瓜离体叶片上，具体操 作是：在每个不同品种的离体叶片上无损伤悬滴接种4点，每点接种20ul的毒素滤液，并每 个待鉴定品种均以无损伤悬滴接种20ul无菌水为对照； 接种后，将叶片放置于培养托盘中保湿培养，在培养托盘底部平铺两层用15ml无菌水 浸湿的滤纸，并将黄瓜离体叶片的叶柄基部用被无菌水浸湿的医用脱脂棉包裹，最后将塑 料托盘用保鲜袋覆盖保湿； 将接种后的叶片25°C下培养3d后，观察多主棒孢毒素对离体叶片的侵染情况，采用十 字交叉法测量接种叶片上的病斑直径，通过叶片上侵染病斑的平均大小鉴定不同黄瓜品种 对多主棒孢的抗性。
[0009] 黄瓜棒孢叶斑病的抗性鉴定标准如下： 免疫（I)，侵染点无侵染； 高抗（HR)，侵染点发生侵染，出现褪绿变黄的小点，病斑直径小于5_ ; 中抗（MR)，侵染点发生侵染，出现褪绿变黄的小点，病斑直径5~10mm; 中感(MS)，侵染点发生侵染，出现褪绿变黄圆形病斑，病斑直径10~15mm; 高感（HS)，侵染点发生侵染，出现褪绿变黄圆形病斑，病斑直径大于15_。
[0010] 目前对于黄瓜棒孢叶斑病抗性鉴定常用的方法为苗期人工接种鉴定，在应用过程 中该方法常因接种苗龄、接种方法、培养环境的不同及调查方式的不可控性，导致鉴定结果 具有一定的差异，而且鉴定结果的重复性低，不同批次间差异性较大。
[0011] 本发明所涉及的黄瓜棒孢叶斑病抗性鉴定方法克服了以上不足，鉴定结果只需3d 即可完成；且在光照培养箱中进行，对温度、湿度均可进行控制，环境因素影响小；操作方 法鉴定，可重复性高。该方法可实现高通量、快速鉴定不同品种黄瓜对棒孢叶斑病抗性的目 的。
[0012]
【具体实施方式】
[0013] 以下通过实施例形式对本发明的内容作详细的说明，给出了详细的实施方式和具 体的操作过程，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0014] 实施例1，不同商业黄瓜品种对黄瓜棒孢叶斑病的抗性鉴定 发明施例中选择的黄瓜抗棒孢叶斑病鉴定材料为：津优3号，津优38号为商业黄瓜品 种，购于天津市科润黄瓜研究所；中农5号，中农8号为商业黄瓜品种，购于中国农业科学院 蔬菜花卉研究所。
[0015] 抗性鉴定方法如下： ①侵染鉴定材料的准备：将供试的4个黄瓜品种播种于温室营养钵(营养钵直径12cm， 基质成分为草炭：蛭石=1:2)中。当黄瓜幼苗长至3片真叶时期，取每株第2片真叶，作为 本发明方法应用的鉴定材料。然后，对取走叶片的植株进行苗期人工接种鉴定。
[0016] ②以无菌的多主棒孢（毒素滤液的制备：将活化的多主 棒孢接种于Czapek液体培养基中，120rpm/min，摇床培养21d后，采用双层纱布过滤培养 液，除去菌丝体，回收滤液，将回收到的滤液离心5000rpm/min，30min后，收集上清