一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种和栽培种远缘杂交后代的方法_2
)幼胚挽救离体诱导培养:在无菌条件下，将步骤(3)得到的胚珠接种到MS诱导培养基中，在温度28?30°C、光周期16h/d和光照强度15001UX条件下培养25d?30d，诱导胚芽萌发(见图1);所述幼胚诱导培养基是在MS基本培养基中加入0.5mg 6-BA，0.3mg/L GA3, 30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;
[0044](5)幼胚萌发的分化培养:将步骤(4)得到的萌发幼胚接种到分化培养基中，在温度28?30°C、光周期16h/d和光照强度15001uX条件下分化培养25?30d，观察萌发的幼胚在不同的分化培养基中出现从生芽的情况，直至幼胚发育成杂种F1幼苗(见图2、图3);所述分化培养基为:在MS基本培养基中添加0.3mg/L IBA,0.5mg/L AgNO3,30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;
[0045](6)杂种F1植株的获得、繁殖与保存:在无菌条件下，从培养基中取出杂种F #力苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养20?30d，直至形成完整植株后保存在人工气候培养箱；将幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中进行扩繁，直至诱导分化出顶芽后，再将顶芽接种到生根培养基中培养直至形成完整植株保存在人工气候培养箱；所述生根培养基为:在MS基本培养基中添加0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;所述增殖培养基为:在MS基本培养基中添加1.5mg/L6-BA、lmg/L IAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;
[0046](7)杂种？』直株移栽:将步骤(6)得到的根系发育良好的杂种F ^直株在室内自然光下开瓶炼苗2?3d，取出杂种F1植株并洗净附着在其表面的培养基，将其移栽到泥炭:珍珠岩:蛭石=I: I: I的穴盘中，置于27±2°C温度、保持60?70%相对湿度培养30d后带土移栽，即下地种植，正常管理。
[0047]采用分子鉴定法鉴定本实施例杂交得到的杂种？:植株的真实性，具体包括如下步骤:
[0048](I)取野生种“野芝5号”(S.radiatum，2n = 64)与栽培品种“中芝14”(2n = 26)及杂种株叶片，采用CTAB法分别提取DNA。
[0049](2)利用野生种“野芝5号” (S.radiatum, 2n = 64)与栽培品种“中芝14” (2n =26)及杂种匕植株的特异标记SSR引物HS073进行PCR反应，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，具体步骤如下:
[0050]A.PCR 反应体系为如下:DNA 模版 50ng/ml 2 μ L，10 X Buffer I μ L，25mM 的Mgcl20.6 μ L，1mmol.L MNTPs 0.2 μ L，10 μ g.L 1SSR 引物 HS0732 μ L，5UTaq DNApolymerase 0.1 μ L，加入无菌超纯水至终体积1yL ;将上述成分混合后离心，加一滴矿物油覆盖，防止水份蒸发；进行PCR扩增:扩增在B1-RAD基因扩增仪上进行；扩增程序为:95°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，33个循环后72°C延伸1min ；
[0051]B.反应结束后向PCR扩增产物中加入10 μ L Loading Buffer,混匀，取2.5 μ L所得样液，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，电泳电压为200V，电泳时间2.0h左右；胶显影、银染将染色后的胶在凝胶成像仪上观测照相，根据特异标记HS073在杂种匕的带型上有无亲本的特异扩增条带，可以在早期鉴定F1杂种植物的真实性。
[0052]其中上述SSR引物HS073为:正向引物序列为:5’ -CCGAAGGGATAGATCGACAT-3’ ；反向引物序列为:5’ -ATCTTCCCTCCCTTTTCTGC-3’。
[0053]本实施例杂交获得的杂种F1植株的鉴定结果见图4，从图中可以看出，杂种F灌株的带型上出现了母本栽培种的特异性扩增条带190bp、父本野生种的特异性扩增条带170bp，因此，鉴定结果表明了该F1杂种植物为真杂种。
[0054]采用细胞学进一步鉴定杂种匕植株的真实性，具体操作步骤如下:分别取父本野生种“野芝5号”(S.radiatum，2n = 64)与母本栽培品种“中芝14” (2n = 26)及杂种F1植株的根尖，将其用0.002mol/L 8-羟基喹啉液预处理4h，卡诺氏固定液固定，固定时频繁更换固定液直至材料褪色完全，放置4°C冰箱中保存备用；制片时，取出固定好的根尖，用lmol/L的盐酸，60°C水浴处理4.5min进行水解，解离后放入蒸馏水中漂洗3次，用改良石炭酸品红染色Smin至子房呈紫红色，压片，选取有丝分裂中期相较好的细胞在Olympus显微镜下观察，统计其染色体的数目，进一步鉴定杂种匕真实性。
[0055]染色体数目确定结果表明:父本野生种“野芝5号”(S.radiatum, 2n = 64)与母本栽培品种“中芝14”(2n = 26)种间杂交F1植株有丝分裂染色体制片显示为45条染色体(见图5)，因此，进一步鉴定杂种匕植株是真杂种。同时，亲本和杂种F i植株的外观形态见图6，从外观形态来看，杂种F1植株也属于真杂种。
[0056]实施例2
[0057]本实施例所述利用幼胚挽救技术获得野生种芝麻与栽培种芝麻远缘杂交后代的方法与实施例1大体相同，不同点在于:(I)所述幼胚诱导培养基为:在MS基本培养基中添加0.5mg/L赤霉素、lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;所述分化培养基为:在MS基本培养基中添加0.6mg/L IBA,0.8mg/L AgN03、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ; (2)所述幼胚挽救离体诱导培养和幼胚分化培养的条件均为:温度28?30°C、光周期8h/d、光照强度20001ux ; (3)所述生根培养基为:在MS基本培养基中添加0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;所述增殖培养基为:在MS基本培养基中添加、3mg/L6-BA、2mg/L IAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0058]对本实施例杂交获得的杂种F1植株，采用分子鉴定和细胞学方法鉴定其真伪性，鉴定的具体操作步骤同实施例1，鉴定的结果表明，杂种匕植株为真杂种。
[0059]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1.一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种与栽培种远缘杂交后代的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)亲本材料准备:母本选用芝麻栽培品种(2n=26)，父本选用芝麻野生种(5:rai/iaiiM?，2n=64)，精选无病饱满的父母本籽粒以备种植； (2)远缘杂交:当父母本均开花时，摘掉母本露白的花冠和雄蕊，用父本授粉杂交； (3)胚珠的剥取:取步骤(2)杂交授粉后生长发育了10?18天的幼蒴，用清水将幼蒴表面冲洗干净，然后在超净工作台上对幼蒴表面进行消毒并用无菌水漂洗，最后在无菌条件下切开幼蒴，轻轻剥出胚珠； (4)幼胚挽救离体诱导培养:在无菌条件下，将步骤(3)得到的胚珠接种到幼胚诱导培养基中，在温度28?30°C、光周期8?16h/d、光照强度1500?2000 Iux条件下离体诱导培养，胚珠萌发得到幼胚； (5)幼胚的分化培养:将步骤(4)得到的幼胚接种到分化培养基中，在温度28?30°C、光周期8?16h/d、光照强度1500?2000 Iux条件下分化培养直至幼胚发育成杂种F-力苗； (6)杂种F1植株的获得、繁殖与保存:在无菌条件下，从培养基中取出杂种Fi幼苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养直至形成完整的杂种匕植株后放在人工气候培养箱中保存；将幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中进行扩繁，直至诱导分化出顶芽后，再将顶芽接种到生根培养基中培养直至形成完整的杂种F1植株并保存。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述取杂交授粉后生长 发育了 12d~18d的幼蒴。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼胚诱导培养基为:在MS基本培养基中添0.3?0.5mg/L赤霉素、0.5?I mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化培养基为:在MS基本培养基中添加0.3?0.6 mg/L IBA,0.5?0.8mg/L AgNO3'30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为 5.8o5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述离体诱导培养的培 养时间25d?30d ;步骤(5)所述分化培养的时间为25?30d。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基为:在MS基本培养基中添加0.2mg/L?0.5 mg/L NAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基为:在MS基本培养基中添加1.5?3 mg/L 6-ΒΑ、1?2 mg/L IAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养至形成完整的杂种F1植株的时间为20d~30d。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中扩繁直至诱导分化出顶芽的时间为14d?20d。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂种F!植株的移栽种植方法为:将步骤(6)得到的杂种F1植株在室内自然光下开瓶炼苗2?3d，取出杂种F ^直株并洗净附着在其表面的培养基，将其移栽到泥炭:珍珠岩:蛭石=1:1:1的穴盘中，置于27?30°C温度、保持60?70%相对湿度培养30d后带土移栽，即下地种植。
【专利摘要】本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种和栽培种远缘杂交后代的方法，具体包括如下步骤：母本选用芝麻栽培品种(2n＝26)，父本选用芝麻野生种(2n＝64)；父母本进行远缘杂交，取杂交授粉后10～18天的幼蒴，剥取胚珠；将胚珠接种到幼胚诱导培养基中，培养诱导胚芽萌发得到幼胚；再将幼胚接种到分化培养基中，培养直至幼胚发育成杂种F1幼苗；杂种F1幼苗经增殖扩培后得到完整的杂种F1植株。本发明利用幼胚挽救技术克服了芝麻野生种与芝麻栽培种远缘杂交时容易发生幼胚败育而无法获得杂种F1植株的问题，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，可以有效改良芝麻栽培品种的种质。
【IPC分类】A01H4/00, A01H1/02
【公开号】CN105104186
【申请号】CN201510404011
【发明人】杨敏敏, 赵应忠, 刘红艳, 周婷, 郝国存, 周芳
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月10日
[0044](5)幼胚萌发的分化培养:将步骤(4)得到的萌发幼胚接种到分化培养基中，在温度28?30°C、光周期16h/d和光照强度15001uX条件下分化培养25?30d，观察萌发的幼胚在不同的分化培养基中出现从生芽的情况，直至幼胚发育成杂种F1幼苗(见图2、图3);所述分化培养基为:在MS基本培养基中添加0.3mg/L IBA,0.5mg/L AgNO3,30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;
[0045](6)杂种F1植株的获得、繁殖与保存:在无菌条件下，从培养基中取出杂种F #力苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养20?30d，直至形成完整植株后保存在人工气候培养箱；将幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中进行扩繁，直至诱导分化出顶芽后，再将顶芽接种到生根培养基中培养直至形成完整植株保存在人工气候培养箱；所述生根培养基为:在MS基本培养基中添加0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;所述增殖培养基为:在MS基本培养基中添加1.5mg/L6-BA、lmg/L IAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;
[0046](7)杂种？』直株移栽:将步骤(6)得到的根系发育良好的杂种F ^直株在室内自然光下开瓶炼苗2?3d，取出杂种F1植株并洗净附着在其表面的培养基，将其移栽到泥炭:珍珠岩:蛭石=I: I: I的穴盘中，置于27±2°C温度、保持60?70%相对湿度培养30d后带土移栽，即下地种植，正常管理。
[0047]采用分子鉴定法鉴定本实施例杂交得到的杂种？:植株的真实性，具体包括如下步骤:
[0048](I)取野生种“野芝5号”(S.radiatum，2n = 64)与栽培品种“中芝14”(2n = 26)及杂种株叶片，采用CTAB法分别提取DNA。
[0049](2)利用野生种“野芝5号” (S.radiatum, 2n = 64)与栽培品种“中芝14” (2n =26)及杂种匕植株的特异标记SSR引物HS073进行PCR反应，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，具体步骤如下:
[0050]A.PCR 反应体系为如下:DNA 模版 50ng/ml 2 μ L，10 X Buffer I μ L，25mM 的Mgcl20.6 μ L，1mmol.L MNTPs 0.2 μ L，10 μ g.L 1SSR 引物 HS0732 μ L，5UTaq DNApolymerase 0.1 μ L，加入无菌超纯水至终体积1yL ;将上述成分混合后离心，加一滴矿物油覆盖，防止水份蒸发；进行PCR扩增:扩增在B1-RAD基因扩增仪上进行；扩增程序为:95°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，33个循环后72°C延伸1min ；
[0051]B.反应结束后向PCR扩增产物中加入10 μ L Loading Buffer,混匀，取2.5 μ L所得样液，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，电泳电压为200V，电泳时间2.0h左右；胶显影、银染将染色后的胶在凝胶成像仪上观测照相，根据特异标记HS073在杂种匕的带型上有无亲本的特异扩增条带，可以在早期鉴定F1杂种植物的真实性。
[0052]其中上述SSR引物HS073为:正向引物序列为:5’ -CCGAAGGGATAGATCGACAT-3’ ；反向引物序列为:5’ -ATCTTCCCTCCCTTTTCTGC-3’。
[0053]本实施例杂交获得的杂种F1植株的鉴定结果见图4，从图中可以看出，杂种F灌株的带型上出现了母本栽培种的特异性扩增条带190bp、父本野生种的特异性扩增条带170bp，因此，鉴定结果表明了该F1杂种植物为真杂种。
[0054]采用细胞学进一步鉴定杂种匕植株的真实性，具体操作步骤如下:分别取父本野生种“野芝5号”(S.radiatum，2n = 64)与母本栽培品种“中芝14” (2n = 26)及杂种F1植株的根尖，将其用0.002mol/L 8-羟基喹啉液预处理4h，卡诺氏固定液固定，固定时频繁更换固定液直至材料褪色完全，放置4°C冰箱中保存备用；制片时，取出固定好的根尖，用lmol/L的盐酸，60°C水浴处理4.5min进行水解，解离后放入蒸馏水中漂洗3次，用改良石炭酸品红染色Smin至子房呈紫红色，压片，选取有丝分裂中期相较好的细胞在Olympus显微镜下观察，统计其染色体的数目，进一步鉴定杂种匕真实性。
[0055]染色体数目确定结果表明:父本野生种“野芝5号”(S.radiatum, 2n = 64)与母本栽培品种“中芝14”(2n = 26)种间杂交F1植株有丝分裂染色体制片显示为45条染色体(见图5)，因此，进一步鉴定杂种匕植株是真杂种。同时，亲本和杂种F i植株的外观形态见图6，从外观形态来看，杂种F1植株也属于真杂种。
[0056]实施例2
[0057]本实施例所述利用幼胚挽救技术获得野生种芝麻与栽培种芝麻远缘杂交后代的方法与实施例1大体相同，不同点在于:(I)所述幼胚诱导培养基为:在MS基本培养基中添加0.5mg/L赤霉素、lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;所述分化培养基为:在MS基本培养基中添加0.6mg/L IBA,0.8mg/L AgN03、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ; (2)所述幼胚挽救离体诱导培养和幼胚分化培养的条件均为:温度28?30°C、光周期8h/d、光照强度20001ux ; (3)所述生根培养基为:在MS基本培养基中添加0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8 ;所述增殖培养基为:在MS基本培养基中添加、3mg/L6-BA、2mg/L IAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0058]对本实施例杂交获得的杂种F1植株，采用分子鉴定和细胞学方法鉴定其真伪性，鉴定的具体操作步骤同实施例1，鉴定的结果表明，杂种匕植株为真杂种。
[0059]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1.一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种与栽培种远缘杂交后代的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)亲本材料准备:母本选用芝麻栽培品种(2n=26)，父本选用芝麻野生种(5:rai/iaiiM?，2n=64)，精选无病饱满的父母本籽粒以备种植； (2)远缘杂交:当父母本均开花时，摘掉母本露白的花冠和雄蕊，用父本授粉杂交； (3)胚珠的剥取:取步骤(2)杂交授粉后生长发育了10?18天的幼蒴，用清水将幼蒴表面冲洗干净，然后在超净工作台上对幼蒴表面进行消毒并用无菌水漂洗，最后在无菌条件下切开幼蒴，轻轻剥出胚珠； (4)幼胚挽救离体诱导培养:在无菌条件下，将步骤(3)得到的胚珠接种到幼胚诱导培养基中，在温度28?30°C、光周期8?16h/d、光照强度1500?2000 Iux条件下离体诱导培养，胚珠萌发得到幼胚； (5)幼胚的分化培养:将步骤(4)得到的幼胚接种到分化培养基中，在温度28?30°C、光周期8?16h/d、光照强度1500?2000 Iux条件下分化培养直至幼胚发育成杂种F-力苗； (6)杂种F1植株的获得、繁殖与保存:在无菌条件下，从培养基中取出杂种Fi幼苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养直至形成完整的杂种匕植株后放在人工气候培养箱中保存；将幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中进行扩繁，直至诱导分化出顶芽后，再将顶芽接种到生根培养基中培养直至形成完整的杂种F1植株并保存。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述取杂交授粉后生长 发育了 12d~18d的幼蒴。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼胚诱导培养基为:在MS基本培养基中添0.3?0.5mg/L赤霉素、0.5?I mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化培养基为:在MS基本培养基中添加0.3?0.6 mg/L IBA,0.5?0.8mg/L AgNO3'30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为 5.8o5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述离体诱导培养的培 养时间25d?30d ;步骤(5)所述分化培养的时间为25?30d。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基为:在MS基本培养基中添加0.2mg/L?0.5 mg/L NAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基为:在MS基本培养基中添加1.5?3 mg/L 6-ΒΑ、1?2 mg/L IAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养至形成完整的杂种F1植株的时间为20d~30d。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中扩繁直至诱导分化出顶芽的时间为14d?20d。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂种F!植株的移栽种植方法为:将步骤(6)得到的杂种F1植株在室内自然光下开瓶炼苗2?3d，取出杂种F ^直株并洗净附着在其表面的培养基，将其移栽到泥炭:珍珠岩:蛭石=1:1:1的穴盘中，置于27?30°C温度、保持60?70%相对湿度培养30d后带土移栽，即下地种植。
【专利摘要】本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种和栽培种远缘杂交后代的方法，具体包括如下步骤：母本选用芝麻栽培品种(2n＝26)，父本选用芝麻野生种(2n＝64)；父母本进行远缘杂交，取杂交授粉后10～18天的幼蒴，剥取胚珠；将胚珠接种到幼胚诱导培养基中，培养诱导胚芽萌发得到幼胚；再将幼胚接种到分化培养基中，培养直至幼胚发育成杂种F1幼苗；杂种F1幼苗经增殖扩培后得到完整的杂种F1植株。本发明利用幼胚挽救技术克服了芝麻野生种与芝麻栽培种远缘杂交时容易发生幼胚败育而无法获得杂种F1植株的问题，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，可以有效改良芝麻栽培品种的种质。
【IPC分类】A01H4/00, A01H1/02
【公开号】CN105104186
【申请号】CN201510404011
【发明人】杨敏敏, 赵应忠, 刘红艳, 周婷, 郝国存, 周芳
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月10日
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0访客 来自[中国] 2022年08月22日 15:44我发现了一株野生芝麻苗，已结果，有研究价值吗18371230519
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