一种解淀粉芽孢杆菌制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌制剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 玉米大斑病又称条斑病、煤纹病、枯叶病、叶斑病等。主要为害玉米的叶片、叶鞘和 苞叶。叶片染病先出现水渍状青灰色斑点，然后沿叶脉向两端扩展，形成边缘暗褐色、中央 淡褐色或青灰色的大斑。后期病斑常纵裂。严重时病斑融合，叶片变黄枯死。潮湿时病斑 上有大量灰黑色霉层。下部叶片先发病。在单基因的抗病品种上表现为褪绿病斑，病斑较 小，与叶脉平行，色泽黄绿或淡褐色，周围暗褐色，有些表现为坏死斑。
[0003] 玉米大斑病的防治方法主要有种植抗病品种、加强农业防治和药剂防治。药剂防 治方面主要以化学药剂为主，而化学药剂存在污染环境，持效期短，病原菌容易产生抗药性 等问题，并且现有生物菌剂只是针对防治病原菌，不能起到玉米增产的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是要解决现有防治玉米大斑病中化学药剂对环境污染，对人畜不安 全，病菌易产生抗药性，且对玉米增产效果不明显的问题，提供了一种解淀粉芽孢杆菌制剂 及其应用。
[0005] 1、本发明一种解淀粉芽孢杆菌制剂按质量分数包含0.01~0.02 %硫酸 锌，0. 01~0. 02 %硼酸、0. 1~0. 2 %吐温20和余量的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol发酵液，其中制备解淀粉芽孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl_01发酵液的发酵培养基每1升的组分含量为：葡萄糖0. 1%、黄豆 粉0.4%、蛋白胨0. 1%、酵母膏0.05%、磷酸二氢钾0. 12%、硫酸镁0.024%和余量的水； 发酵条件为：温度32°C，pH7. 0~7. 2,转速170r/min，培养时间48h，接种量2%。
[0006] 本发明的一种解淀粉芽孢杆菌制剂的应用是指在抑制玉米大斑病菌的同时增加 玉米产量上的应用。
[0007] 本发明以解淀粉芽孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol制备成高效、 广谱、无毒、无污染的生态型生防微生物菌剂，该菌剂对环境友好，不会使病原菌产生抗药 性，并通过田间药效测定，抽雄后40d对玉米大斑病的防效为80. 8%，显著高于药剂（多菌 灵）对照60.1%，另外可通过解淀粉芽孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl_01菌 群快速繁殖占领位点，分泌多种抗生物质，可预防多种病害发生；该菌剂在玉米上的应用效 果表明，在常规农技措施条件下，玉米喷施微生物菌剂后能够明显促进玉米植株生长和穗 产量的提高，减少突尖率，与喷施空白对照相比穗长、行粒数和百粒重分别增加I. 4cm、l. 8、 2. 4g，玉米增产率为18. 26 %。在使用该菌剂14d，第二次14d，抽雄后20d，抽雄后40d，对玉 米大斑病的防治效果良好，说明该菌剂持效期长。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0008] 一：本实施方式一种解淀粉芽孢杆菌制剂按质量分数包含 0.01~0.02 %硫酸锌，0.01~0.02 %硼酸、0. 1~0. 2%吐温20和余量的解淀粉芽 孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol发酵液，其中制备解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)KBl-Ol发酵液的发酵培养基每1升的组分含量为：葡萄糖 0. 1%、黄豆粉0.4%、蛋白胨0. 1%、酵母膏0.05%、磷酸二氢钾0. 12%、硫酸镁0.024%和 余量的水；发酵条件为：温度32°C，pH7. 0~7. 2,转速170r/min，培养时间48h，接种量2%。
[0009] 本发明以解淀粉芽孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens) KBl-Ol制备成高效、广 谱、无毒、无污染的生态型生防微生物菌剂，该菌剂对环境友好，不会使病原菌产生抗药性。
【具体实施方式】 [0010] 二：本实施方式与一不同的是解淀粉芽孢杆菌制剂 按质量分数包含〇. 02%硫酸锌，0. 02%硼酸、0. 1%吐温20和99. 86%的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol发酵液，其他与一相同。
【具体实施方式】 [0011] 三：本实施方式与一或二不同的是：所述的解淀粉芽 孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl_01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2014年09月12 日，保藏编号为CGMCC No. 9649,其他与一或二相同。
[0012] 本实施方式解淀粉芽孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol的筛选方法 为：从黑龙江省农垦哈尔滨、红兴隆、牡丹江、九三、绥化、北安、宝泉岭七个分局采集玉米根 际土壤样品15份。
[0013] 将从采集的土样自然风干。每份土样称取10g，放入盛有90ml无菌水和玻璃珠的 三角瓶中，在摇床上剧烈振荡30min后用无菌水进行梯度稀释后涂布PDA平板，于25°C培养 箱内培养24h左右，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。
[0014] 以玉米大斑病菌为靶标菌，采用平板对峙法筛选所分离的细菌。将供试病原真菌 菌饼（7mm)移至平板中央，，在距离细菌两侧25mm处，划线接种拮抗菌，以只接病原菌为对 照，每处理3皿。置于25°C培养箱培养4~6天，选出1182株对靶标菌生长有抑制作用的 菌株进入复筛。每个菌株4次重复，同样的方法培养并测量抑菌圈半径（细菌菌落中心至 病原菌菌丝边缘）的大小，筛选出抑菌圈半径较大，被抑病原菌丝边缘平齐且拮抗作用持 久的菌株，通过复筛，得到菌株KB1-01，其平均抑菌带为12. 8mm，抑菌率达到81. 91 %。
[0015] 采用平板对峙生长法培养之后，菌株KB1-01对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、马 铃薯早疫病菌、番茄枯萎病菌、禾谷镰刀菌尖孢镰刀菌和链格孢的抑制作用如表1所示，由 表1可知，菌株KB1-01对不同的病原真菌表现出广谱的拮抗作用，但菌株KB1-01对不同病 原菌表现出的拮抗强度有所差别，这可能是由于不同的病原真菌的菌丝体构造等有所不同 所造成的。
[0016] 表 1
[0017]
[0018] 筛选得到的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol的细胞形态 和理化实验结果如表2所示：
[0019] 表 2
[0022] 对筛选得到的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl_01进行分子 鉴定，按以下方法进行：
[0023] 采用CTAB方法提取菌株KBl-Ol的DNA ;采用通用引物对KBl-Ol的DNA进行 扩增和测定；PCR产物纯化后进行测序，经测序，待鉴定的样品16S rDNA片段大小为 1382bp。将此序列与NCBI数据库中的数据进行序列同源性比对，发现该菌株与解淀粉芽 孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)的亲缘关系最近，并最终命名为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)KB1-01〇
【具体实施方式】 [0024] 四：本实施方式与一至三之一不同的是：所述的解淀 粉芽孢杆菌（Bacillusa myloliquefaciens)KBl-Ol发酵