一种滇池金线鲃精子超低温冷冻保存方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种滇池金线鈀精子质量评价和超低温冷冻保存及复苏方法，属于低 温生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 漬池金线 |巴Sinocyclocheilusgrahami(Regan，1904)又名漬池金线鱼、 波萝鱼、小洞鱼，隶属于鲤形目（Cypriniformes)鲤科（Cyprinidae)金线f巴属 (Sinocyclocheilus)。滇池金线祀是滇池流域的特有种，分布于滇池及其流域所在河流、溶 洞、暗河之中。
[0003] 滇池金线鈀肉质鲜美，系云南"四大名鱼"之首，1989年，被列为国家II级保护动 物，在《中国濒危动物红皮书（鱼类）》中被列为濒危等级，在中国物种红色名录中被列为 VU等级。自上世纪50年代后期以来，由于外来种入侵、水体污染、生境丧失、过度捕捞等原 因，滇池金线鈀在滇池湖体已经消失，现仅存于入湖溪流及龙潭中。若不及时采取有效拯救 措施，以后将在自然界中将很难找到滇池金线鈀这一物种。
[0004] 尽管滇池金线鈀人工繁殖已成功，但由于养殖鱼类本身的局限性，在人工繁殖中， 雌雄性腺发育不同步的现象较为常见；并且在长期的塘养环境下，容易造成种质退化，且精 子和卵子的质量不易把握，这些问题在滇池金线鈀的养殖实践中也同样存在，因此如何实 时监控滇池金线鈀的精子质量就显得异常重要。
[0005] 滇池金线鈀精子质量评价体系的建立可实时监控滇池金线鈀的精子质量，以便随 时调整亲鱼培育方案，以获得较好的人工繁殖结果；精子质量评价体系也为滇池金线鈀精 子的超低温冷冻保存提供了便利，选择较好的精液样品进行长期冷冻保存，而复苏后选择 质量较好的精液样品进行人工繁殖，以获得较高的受精率和孵化率，同时也解决了雌雄发 育不同步的问题；另一方面，利用冷冻保存的滇池金线鈀精液可以实现不同世代、不同地点 的滇池金线鈀的杂交，为遗传育种奠定了基础。因此，滇池金线鈀精子质量评价和超低温冷 冻保存在滇池金线鈀人工养殖实践中具有重要的现实意义。经文献检索，未见与本发明的 相同报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于建立一种滇池金线鈀精子质量评价方法，并提供一种简便、高 效、可长期保存滇池金线鈀精子的超低温冷冻保存方法。
[0007] 根据本发明的一个方面，提供了 一种滇池金线鈀精子超低温冷冻保存方法，该保 存方法包括如下步骤：a)滇池金线鈀新鲜精液的采集，选取形态正常、生长良好、无疾病、 性腺成熟的雄鱼，用80-120ppm的MS-222麻醉3-5分钟，擦干鱼腹，然后轻轻挤压鱼腹，使 成熟的新鲜精液流出到1. 5ml离心管中；b)精液冷冻保存，采精前10-20分钟，将装有离 心液和冷冻液的离心管置于18-20°C水浴中预热，将采集的新鲜精液与离心液按1:1比例 混合，400-600rpm离心6-8分钟，弃上清液，留下浓缩液，然后向浓缩液中加入等体积的抗 冻液，18-20°C水浴混合2-3分钟，混合液置于4°C冰箱中30-60分钟，然后将混合液转移至 0. 5ml麦管中，麦管在液氮面上方5-6cm处2-3分钟，液氮面上2-3分钟后投入液氮中保存； 以及c)精液的解冻，将麦管从液氮中取出后迅速置于37°C水浴锅中快速晃动20-30秒，精 子即解冻。
[0008] 进一步地，所述离心液由稀释液和抗生素组成，向所述稀释液中加入青霉素、庆大 霉素和两性霉素B，使青霉素的浓度为100-200IU/ml，庆大霉素的浓度为10-20μg/ml，两 性霉素B的浓度为10-20μg/ml，现用现配，所述稀释液由葡萄糖、乳糖、氯化钠、氯化钾和 去离子水组成，葡萄糖15g、乳糖10g、氯化钠8g、氯化钾lg，加入去离子水溶液调整至总体 积为1000ml，然后用10%碳酸氢钠调整溶液的pH值至6. 8-7. 2, 25%的葡萄糖溶液或双蒸 水调整溶液的渗透压至300-340m0sm/l，放置于4°C冰箱中保存备用。
[0009] 进一步地，所述抗冻液由稀释液和抗冻剂组成，向所述稀释液中加入乙二醇，使乙 二醇体积占总体积的3-5 %，将稀释液和抗冻剂混合摇动2-3分钟，现用现配，所述稀释液 由葡萄糖、乳糖、氯化钠、氯化钾和去离子水组成，葡萄糖15g、乳糖10g、氯化钠8g、氯化钾 lg，加入去离子水溶液调整至总体积为l〇〇〇ml，然后用10%碳酸氢钠调整溶液的pH值至 6. 8-7. 2, 25%的葡萄糖溶液或双蒸水调整溶液的渗透压至300-340m0sm/l，放置于4°C冰 箱中保存备用。
[0010] 根据本发明的另一方面，还提供一种滇池金线鈀精子质量评价方法，包括：a)采 用权利要求1-3任一项所述的滇池金线鈀精子超低温冷冻保存方法对滇池金线鈀精子进 行超低温冷冻保存；b)新鲜精子质量评价，在滇池金线鈀新鲜精液的采集之后，进行新鲜 精子质量检测，该新鲜精子质量检测包括精子活力、精子快速运动时间、精子寿命、精子密 度、精子细胞膜完整率、精子头直径和尾长；c)冻精质量评价，在精液解冻之后，进行冻精 质量评价，该冻精质量评价指标除包括所述新鲜精子质量评价中的精子活力、精子快速运 动时间、精子寿命、精子细胞膜完整率、精子头直径和尾长六个指标之外，还包括胚胎存活 率、孵化率和畸形率三个指标。
[0011] 根据本发明的又一方面，还提供一种滇池金线鈀精子超低温冷冻保存方法，其采 用权利要求1-3任一项所述的滇池金线鈀精子超低温冷冻保存方法对滇池金线鈀精子进 行超低温冷冻保存并且采用权利要求4所述的滇池金线鈀精子质量评价方法对滇池金线 鈀精子质量进行评价，其中仅冷冻保存具有65%以上的精子活力、15秒以上的精子快速运 动时间、60-90秒间的精子寿命、10 9个/ml以上的精子密度、精子头直径在2. 9μπι以上、尾 长在51. 0μπι以上的新鲜精子。
[0012] 根据本发明的又一方面，还提供一种滇池金线鈀精子超低温冷冻保存方法，其采 用权利要求1-3任一项所述的滇池金线鈀精子超低温冷冻保存方法对滇池金线鈀精子进 行超低温冷冻保存并且采用权利要求4所述的滇池金线鈀精子质量评价方法对滇池金线 鈀精子质量进行评价，其中能够用于人工授精的冻精具有40%以上的精子活力、15秒以 上的精子快速运动时间、50-90秒间的精子寿命、75 %以上的细胞膜完整率、精子头直径在 2. 85μπι以上、尾长在50. 0μπι以上。
[0013] 本发明的显著效果在于：
[0014] 1、成本低，操作简便易行；
[0015] 2、在滇池金线鈀多年的养殖实践中，首次建立了适用于滇池金线鈀的精子质量评 价体系，不仅为精子冷冻保存服务，更有助于随时监测滇池金线鈀的精子质量情况，在塘养 实践中具有重要的现实意义；
[0016] 3、建立了适用于滇池金线鈀的精子超低温冷冻保存方法，使得滇池金线鈀精子得 以长期保存，为遗传育种奠定了基础；
[0017] 4、滇池金线鈀精子经超低温冷冻保存并复苏后，精子的质量较高，人工授精后，胚 胎存活率和孵化率也较高，畸形率较低，可用于规模化生产，对于开展鱼类资源恢复和重建 具有重要意义；
[0018] 5、本方法对仪器的要求较低，一般的鱼类增殖站均可实现，具有重大的推广意义。
【附图说明】
[0019] 图1是示出糖类对滇池金线鈀精子冷冻保存的影响的图。
[0020] 图2是示出抗冻剂对滇池金线鈀精子冷冻保存的影响的图。
【具体实施方式】
[0021] 滇池金线鈀精子质量评价和超低温冷冻保存方法的如下：
[0022] 1.溶液配制
[0023] 稀释液：由葡萄糖、乳糖、氯化钠、氯化钾和去离子水组成，葡萄糖15g、乳糖10g、 氯化钠8g、氯化钾lg，加入去离子水溶液调整至总体积为1000ml。然后用10%碳酸氢钠调 整溶液的pH值至6. 8-7. 2, 25%的葡萄糖溶液或双蒸水调整溶液的渗透压至300-340m0sm/ 1，放置于4°C冰箱中保存备用；
[0024] 离心液：由稀释液和抗生素组成，向稀释液中加入青霉素、庆大霉素和两性霉素 B，使青霉素的浓度为100_200IU/ml，庆大霉素的浓度为10-20μg/ml，两性霉素B的浓度为 10-20μg/ml，现用现配；
[0025] 抗冻液：由稀释液和抗冻剂组成，向稀释液中加入乙二醇，使乙二醇体积占总体积 的3-5%，将稀释液和抗冻剂混合摇动2-3分钟，现用现配。
[0026] 滇池精子超低温冷冻保存过程中，相较于葡萄糖和蔗糖，在抗冻剂中加入蔗糖后， 解冻后滇池金线鈀的精子质量较好，比较结果如图1所示，除精子头直径和尾长外，用乳糖 冷冻后的精子活力、快速运动时间、精子寿命和细胞膜完整率都高于蔗糖和葡萄糖。
[0027] 另外，对比四种抗冻剂，即二甲亚砜、甲醇、乙二醇和甘油，这些抗冻剂对滇池金线 鈀精子冷冻保存的影响如图2所示。在乙二醇作为抗冻剂时，精子活力、快速运动时间、精 子寿命、细胞膜完整率、精子头直径和尾长都高于其他三种抗冻剂。因此，本发明的本实施 例采用乙二醇作为滇池金线鈀精子的抗冻剂。
[0028] 2.精液采集
[0029] 选取形态正常、生长良好、无疾病、性腺成熟的雄鱼捞出水池，用80-120ppm的 MS-222麻醉3-5分钟，鱼类腹部用毛巾擦干，然后轻轻挤压腹部，成熟的精液自然流出到 1.5ml离心管中。尽量避免被鱼类排泄物（尿、屎）污染的样品。
[0030] 3.精子质量评价
[0031 ] 精子质量检测包括精子活力、精子快速运动时间、精子寿命、精子密度、精子细胞