原核型异柠檬酸脱氢酶及其用于提高转基因植物氮利用的应用
【专利说明】原核型异柠檬酸脱氢酶及其用于提高转基因植物氮利用的 应用 发明领域
[0001] 本发明一般涉及具有改进的氮利用和应激耐受性的植物，更具体地，涉及植物中 异柠檬酸脱氢酶（ICDH)的异源表达，包括基于原核的异柠檬酸脱氢酶的过表达和表征，所 述基于原核的异柠檬酸脱氢酶改进应激耐受性和氮摄取，新陈代谢或两者。本发明还包括 将icdh基因与一个或更多个其他转基因组合（stacking)以改进氮利用和/或应激耐受 性。
[0002] 发明背景
[0003] 植物在它们的营养生长和生殖生长期间需要氮。通过土壤矿物质化，施用氮肥或 以上两者植物可以获得氮。但是，根据估计，给作物施用的氮的50-70 %从植物-土壤系统 损失[Peoples，Μ. B. et al.，"Minimizing Gaseous Losses of Nitrogen，'，In Nitrogen Fertilizer in the Environment(Bacon, P. E. ,ed.)Marcel Dekker，pp.565-606(1995)]〇 氮是供应的最昂贵的植物营养物之一，氮肥并不总是以合理的价格提供，并且氮肥的过量 施用可以产生环境挑战。玉米是农学上重要的植物实例，经常需要氮肥以发挥其遗传潜能。
[0004] 天然ICDH可以存在于线粒体，叶绿体和胞浆中，每种均具有不同的生理效果，但 是催化作用可以是类似的。一般来说，I⑶Hl定位于胞浆，I⑶H2定位于叶绿体。
[0005] 对于辅因子还原能力来说，I⑶H可以使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)或烟酰 胺腺嘌呤磷酸二核苷酸（NADP+)，取决于在哪种代谢途径中它是有活性的。一些出版物声 称I⑶H的主要功能可能是为其他代谢反应产生还原能力（NADH，NADPH)，例如，在不饱和 脂肪酸的β-氧化中。其他理论包括以下意见，反应产物2-酮戊二酸（OG)可用于支持 通过 GOGAT 循环的氨基酸合成（Hodges，Μ. Enzyme redundancy and the importance of 2-〇xoglutarate in plant ammonium assimilation. J. Exp. Botany(2002)，迎，905)〇 此 外，与其他一或多个基因组合的ICDH酶的过表达可以允许有效利用额外的碳骨架。先前 关于过表达线粒体icdh基因的转基因烟草植物的研究集中在氧化还原途径，既没有提及 也没有鉴定对氮利用的任意可能影响（Gray，G.，Villarimo，A.，Whitehead，C.，McIntosh， L.Transgenic Tobacco(Nicotiana tabacum L. )Plants with Increased Expression Levels of Mitochondrial NADP+_dependent Isocitrate Dehydrogenase ：Evidence Implicating this Enzyme in the Redox Activation of the Alternative Oxidase， Plant and Cell Physiology 2004 ;45,1413-1425)〇
[0006] 由于表达，底物，小室和翻译后调控，NAD-和NADP-依赖性异柠檬酸脱氢酶 (NAD-ICDH，EC I. I. 1. 41和NADP_ICDH，EC I. I. 1. 42)的调控是复杂的。但是仍不清楚哪 种ICDH形式产生用于氨基酸的0G，任意这类OG应该位于或进入叶绿体中，在那里氮被同 化进氨基酸。文献表明ICDH的植物胞浆形式是同二聚体，具有大约47kD的亚基。线粒体 ICDH疑似具有更多亚基。ICDH的细菌形式可以是单体的，被认为克服了植物中存在的与植 物ICDH有关的表达与功能的典型调控，即磷酸化可以使所述同二聚体失活。
[0007] 胞浆NADP-特异性ICDH催化柠檬酸转化为酮戊二酸。一种策略是设计包含编码单 体原核型异柠檬酸脱氢酶基因（icdh)的基因的构建体，并指导ICDH在植物细胞质中过表 达。表达的ICDH酶将通过增强碳流动入氮同化机制而增强植物利用可利用氮的能力。本 文中，我们描述了合成icdh基因的过表达和表征，基于从细菌icdh序列的挑选并为了在玉 米中表达而优化，以及icdh基因与其他转基因的组合。
[0008] 发明概沐
[0009] 本发明涉及具有增加的氮利用效率、应激耐受性或这两者的转基因植物，所述转 基因植物已经用包括调节植物氮利用的icdh核酸序列的新载体构建体转化。从数个细菌 和植物基因组测序项目（已经保存于公众数据库，从中可以选择编码具有强活性的ICDH酶 的序列）中鉴定多种icdh核酸序列用于本发明。然后对这些候选icdh序列进行筛选，以 取消选择具有相对高含量的会抑制植物中表达的PolyA区域的那些序列。将挑选以例示这 些icdh序列的序列进行密码子优化以在玉米中表达（SEQ ID No 1)。本发明还包括将icdh 基因与一个或更多个异源基因组合以便诱导ICDH酶与氮同化酶的过表达。本发明还涉及 用于转化植物的分离的载体，以及用于检测转化植物中目标核苷酸序列的表达的抗体。本 发明还涉及在植物中表达对应于调节植物氮利用的核酸序列的核酸分子的方法。
[0010] 具体来说，使用核苷酸序列SEQ ID NO :1和3以及其组合，变体，片段，和互补体构 建用于转化植物和细菌细胞的载体。这些载体包括Y DNA启动子序列和Y终止子序列， 其中核酸序列，DNA启动子序列和终止子序列是可操作连接的，以允许核苷酸序列的转录。 在一些实施方案中，启动子序列可以是组成型植物启动子或组织特异型启动子。
[0011] 本发明还包括多克隆抗体，包括针对由核苷酸序列SEQ ID NO :1和3及其组合编 码的多肽的多克隆抗体。
[0012] 本发明还包括用核苷酸序列SEQ ID NO :1和3及其组合，变体和片段转化的植 物。植物选自玉米（玉蜀黍），高粱，小麦，向日葵，番茄，十字花科植物，胡椒，马铃薯，棉花， 水稻，大豆，甜菜，甘蔗，烟草，大麦，和含油种子油菜，芸苔属，苜蓿，裸麦，粟，红花，花生，甘 薯，木薯属，咖啡，椰子，菠萝，柑桔树，可可，茶树，芭蕉属植物，鳄梨树，无花果树，番石榴， 芒果树，橄榄树，番木瓜树，腰果树，澳洲坚果，杏树，燕麦，蔬菜，草（如草皮草，饲草，或牧 草），观赏植物，树（如果树，坚果树，纸浆树，油棕）和针叶树。本发明还包括这类植物的组 成部分，由这类植物产生的植物种子，和利用本发明的载体构建体转化的植物种子。
[0013] 本发明还包括用选自SEQ ID NO :1和3及其组合的核苷酸序列转化的宿主细胞。 宿主细胞可以是细菌细胞或植物细胞。
[0014] 本发明还包括一种表达在植物中调节氮的核酸分子的方法，所述方法包括以下步 骤：提供利用本发明的载体构建体转化的转基因植物或植物种子，和在所述转基因植物或 从转基因植物种子长成的所述植物中有效表达所述核酸分子的条件下生长转基因植物或 从转基因植物种子长成的植物。转基因植物的生长有效增加所述转基因植物或从转基因植 物种子长成的所述植物的氮摄取，和/或增加所述转基因植物或从转基因植物种子长成的 所述植物的氮利用效率，和/或减少限制使得所述转基因植物或从转基因植物种子长成的 所述植物的产量增加。本发明还包括上述方法，其中提供转基因植物或提供转基因种子。 本发明还包括上述方法，其中所述植物选自玉米（玉蜀黍），高粱，小麦，向日葵，番茄，十 字花科植物，胡椒，马铃薯，棉花，水稻，大豆，甜菜，甘蔗，烟草，大麦，和含油种子油菜，芸苔 属，苜蓿，裸麦，粟，红花，花生，甘薯，木薯属，咖啡，椰子，菠萝，柑桔树，可可，茶树，芭蕉属 植物，鳄梨树，无花果树，番石榴，芒果树，橄榄树，番木瓜树，腰果树，澳洲坚果，杏树，燕麦， 蔬菜，草（如草皮草，饲草，或牧草），观赏植物，树（如果树，坚果树，纸浆树，油棕）和针叶 树。
[0015] 本发明还包括一种通过在植物中表达被氮调节的核酸分子而提高植物的应激耐 受性的方法，所述方法包括以下步骤：提供利用本发明的载体构建体转化的转基因植物或 植物种子，和在所述转基因植物或由转基因植物种子长成的所述植物中有效表达所述核酸 分子的条件下生长转基因植物或由转基因植物种子长成的植物。
[0016] 本发明还包括一种通过在植物中表达被氮调节的核酸分子而改变植物的形态的 方法，所述方法包括以下步骤：提供利用本发明的载体构建体转化的转基因植物或植物种 子，和在所述转基因植物或由转基因植物种子长成的所述植物中有效表达所述核酸分子的 条件下生长转基因植物或由转基因植物种子长成的植物。
[0017] 本发明还包括一种载体构建体，包括编码I⑶H氨基酸序列的核苷酸序列，所述核 苷酸序列包括SEQ ID NO :2和4及其组合，5'DNA启动子序列，和3'终止子序列，其中所 述核苷酸序列，DNA启动子序列和终止子序列是可操作连接的，以允许所述核苷酸序列的转 录。
[0018] 本发明还包括一种载体构建体，包括调节植物中氮的核苷酸序列，其中所述核苷 酸序列选自SEQ ID NO :1和3及其组合；与SEQ ID NO :1和3及其组合的相应核苷酸序列 具有至少85%序列相同性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物中调节氮；选自编码 I⑶H氨基酸序列SEQ ID NO :2和4及其组合的那些核苷酸序列的核苷酸序列；和，编码与 SEQ ID NO :2和4及其组合的氨基酸序列具有至少85%序列相同性的氨基酸序列的核苷酸 序列，其中所述核苷酸序列在植物中调节氮；其中所述构建体还包括5' DNA启动子序列和 3'终止子序列，其中所述核苷酸序列，DNA启动子序列和终止子序列是可操作连接的，以允 许所述核苷酸序列的转录。
[0019] 附图简沐
[0020] 图1是质粒PMD08901的载体图，其中质粒的主要元件（从顶端顺时针方向）是： 右侧边界，ScUbi4启动子，5' UTR外显子，内含子，icdh基因，35S终止子，ScUbi4启动子， 5'UTR外显子，内含子，来自EPSPS的叶绿体转运肽，nagk基因，35S终止子，ScUbi4启动子， 5' UTR外显子，内含子，来自EPSPS的叶绿体转运肽，草甘膦耐受SM(GRG23ac35)，35S终止 子，左侧边界。
[0021] 图2是质粒pMD08902的载体图，其中质粒的主要元件（从顶端顺时针方向）是： 右侧边界，ScUbi4启动子，5' UTR外显子，内含子，icdh基因，35S终止子，ScUbi4启动子， 5'UTR外显子，内含子，来自EPSPS的叶绿体转运肽，nagk基因，35S终止子，ScUbi4启动子， 5' UTR外显子，内含子，草甘膦耐受SM，35S终止子，左侧边界。
[0022] 优诜实施方案的详细说明
[0023] 开发更有效利用氮的植物品种将减少过量输入氮的必要，节约农民的生产成本， 造福发展中国家的农民（其无法获得肥料输入），和减少与过量氮肥施用有关的环境污染。 已经用于开发具有提高的氮利用的植物品种的一种方法依赖于传统的植物繁育技术。但 是，由于缺乏遗传重组的规范，这类方法的成功率是不稳定的。
[0024] 需要开发能够更有效地吸收和利用氮的植物品种。植物科学家已经采用简写 术语氮利用效率（NUE)，并已经开发出各种测量和评估NUE的方法[Craswell，E. T. and Godwin, D. C. (1984)The efficiency of nitrogen fertilizers applied to cereals grown in different climates.Tn Advances in Plant Nutrition(Vol. I) (Tinker, P.B. and Lauchli,A. ,eds),pp. 1-55,Praeger Publishers ；Steenbjerg,F. and Jakobsen, S.T. (1963)Plant nutrition and yield curves. Soil Sci. 95,69-90 ：Siddiqi, Μ. Y. and Glass, D. M. (1981)Utilization index ：a modified approach to the estimation and comparison of nutrient utilization efficiency in plants. T. Plant Nutr. 4, 289-302 ；Moll, R. H. et al. (1982)Analysis and interpretation of factors which contribute to efficiency of nitrogen utilization. Agron. .L 74, 562-5641 0 在具体定 义和使用背景中存在差异。例如，一些定义基于总生物量，而其他定义基于产生的籽粒重 量。另一组定义使用从土壤提取氮的效率。可以通过农学效率（AE)，生理效率和利用效率 的乘积，或NUEg(其是摄取效率和利用效率的乘积）测量施用氮肥用于提高籽粒产量的效 率。其他定义考虑了生理因素。
[0025] 如本说明书所述，术语氮利用效率，或NUE，被定义为包括同化途径中任意主要氮 代谢库规模的可测量变化（例如，可能包括下列中一种或更多种的可测量变化：硝酸盐，亚 硝酸盐，氨，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，亮氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸，甘 氨酸，色氨酸，酪氨酸，植物部分的总蛋白含量，植物部分的总氮含量，和/或叶绿素含量）， 或其中在更低氮施肥水平植物显示提供相同或提高的生物量或可收获产量，或其中在相同 的氮施肥水平，当与未用本发明的调节氮的核酸构建体转化的植物相比时，植物显示提供 提高的生物量或可收获产量。"可测量的变化"包括氮同化途径的任意组分（"代谢库"）的 量的增加或降低。变化可以包括途径中一种或更多种代谢库的降低或增加，或一种或更多 种库的降低以及一种或更多种其他库的伴随增加，如当为了产生另一种中间物或途径产物 而使用氮同化途径的一种中间物。例如，在谷氨酸转化为谷氨酰胺时，谷氨酸的水平可以降 低而谷氨酰胺的水平可以增加。因此，不受任何具体理论或机制的束缚，这些库中的一种或 更多种的任意变化表明氮正被植物更有效地利用。
[0026] 氮利用效率的增加可以伴随同化途径中任意主要氮代谢库规模的约5%，约 10%，15%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，125%，150%，约 200%或 更大的可测量变化。在一个实施方案中，当与不包含本发明的调节氮的序列的植物相比时， 本发明的转基因植物具有增加的从环境的氮摄取。"调节氮的序列"旨在表示调节NUE的核 苷酸或氨基酸序列，非限制性实例如下：通过产生影响NUE的酶，或通过产生与涉及NUE的 组分相互作用的蛋白，或通过产生影响调节NUE的内部稳态信号级联的蛋白，或通过导致N 摄取、N同化、N代谢、N转运、N利用、N保存或这些组合的可测量变化的这些机制的组合。 本发明还提供提高植物的应激耐受性的方法，通过在植物中表达一种或更多种调节氮的核 苷酸序列而进行。在一个实施方案中，调节氮的核苷酸序列是SEQ ID NO :1，或其变体和片 段。在另一个实施方案中，调节氮的核苷酸序列是编码SEQ ID NO :2的核苷酸序列或其变 体和片段。在另一个实施方案中，调节氮的核苷酸序列分别是编码SEQ ID NO :1加 SEQ ID NO :2的核苷酸序列或