腺相关病毒介导的基因向中枢神经系统转移的制作方法
【专利说明】腺相关病毒介导的基因向中枢神经系统转移
[0001]相关串请案的交叉引用
[0002]本申请案要求2013年5月15日申请的美国申请案第61/823，757号的申请日的权益，其揭示内容以引用的方式并入本文中。
[0003]有关政府权利的声明
[0004]本发明是依据由美国国家卫生研究院(Nat1nal Institutes of Health)授予的HD032652和DK094538，在政府支持下进行。美国政府在本发明中享有一定权利。
【背景技术】
[0005]粘多糖病(MPS)是由葡糖胺聚糖(GAG)分解代解中断，导致其在溶酶体中积累而引起的一组11种储积疾病(穆恩泽(Muenzer), 2004 ;穆诺兹-罗杰斯(Munoz-Ro jas)等人，2008)。具有不同严重程度的表现包括内脏增大、骨骼发育不良、心脏和肺阻塞以及神经功能恶化。对于MPS I，S卩，艾杜糖醛酸酶(IDUA)缺乏，严重程度范围从轻度(谢氏综合症(Scheie syndrome))到中度(贺-谢二氏(Hurler-Scheie))，乃至重度(贺氏综合症)，其中后者导致神经功能缺失并且在15岁时死亡(穆恩泽，2004 ;穆诺兹-罗杰斯等人，2008)。MPS疗法的最主要部分是姑息剂。然而，对于包括贺氏综合症在内的一些MPS疾病来说，同种异体造血干细胞移植(HSCT)已展现功效(克维特(Krivit)，2004 ;奥查德(Orchard)等人，2007 ;彼得斯(Peters)等人，2003)。另外，对于越来越多的MPS疾病，酶替代疗法(ERT)正变得可用(布雷迪(Brady)，2006)。一般来说，HSCT和ERT引起储积材料的清除以及周围病状的改善，不过在治疗后仍残留一些问题(骨骼、心脏、角膜混浊)。这些细胞和酶疗法中的主要难题是在处理神经系统表现方面的效用，因为在周围投与的酶不能穿透血脑屏障，并且已经发现HSCT对于一些而非全部的MPS具有益处。
[0006]对于开发细胞和分子疗法来说，MPS I是研究最充分的MPS疾病之一。同种异体HSCT的效用很可能是跨细胞代谢校正的结果，由此缺失的酶从供体源性细胞释放，并且随后被宿主细胞吸收并运送到溶酶体，在其中所述酶促进溶酶体代谢(弗拉托尼(Fratantoni)等人，1968)。随后观察周围器官，例如肝和脾中GAG储积材料的清除，存在心肺阻塞的缓解以及角膜混浊的改善(奥查德等人，2007)。特别重要的是同种异体干细胞移植对MPS疾病中神经系统表现的出现的影响。就这一点而言，若干MPS疾病证实，相较于未移植的患者，移植有同种异体干细胞的个体面临改善的结果(波拉克(Bjoraker)等人，2006 ;克维特，2004 ;奥查德等人，2007 ;彼得斯等人，2003)。解释同种异体造血干细胞移植的神经系统益处的一个重要假设是，供体源性造血细胞(最可能是微神经胶质细胞)(赫斯(Hess)等人，2004;安格尔(Unger)等人，1993)穿透到中枢神经系统中，其中缺失的酶是由移植的细胞表达，从这一点开始，所述酶扩散到CNS组织中并且参与储积材料的清除。因此，提供给CNS组织的酶水平局限于由移植到脑中的供体源性细胞表达和释放的量。尽管此类移植对于MPS I具有较大益处，但是接受者仍继续展现低于正常的IQ和减弱的神经认知能力(齐格勒(Ziegler)和夏皮罗(Shapiro)，2007)。
[0007]跨细胞代谢校正现象还解释了 ERT对于若干溶酶体储积疾病(布雷迪，2006)，最值得注意的是MPS I的效用。然而，由于需要通过特定溶酶体储积疾病(LSD)中缺失的酶来穿透血脑屏障(BBB)以便有效地到达CNS，故尚未观察到酶疗法对于溶酶体储积疾病(LSD)的神经系统表现的效用(布雷迪，2006)。酶几乎总是太大并且一般带太多电荷而无法有效地穿过BBB。这就引起针对侵入性鞘内酶投与的研究(迪克逊(Dickson)等人，2007)，对于所述投与，其效用已在犬类动物MPS I模型中得到证实(卡基斯(Kakkis)等人，2004)并且正在开始针对MPS I的人类临床试验(帕斯托(Pastores)，2008 ;穆诺兹-罗杰斯等人，2008)。酶疗法的关键缺点包括其费用庞大(>$200，000/年)并且需要重复输注重组蛋白。当前有关鞘内IDUA投与的临床试验被设计成每三个月仅注射一次酶，因此，这一给药方案的效用仍不确定。
【发明内容】
[0008]本发明描述预防、抑制和/或治疗有需要的哺乳动物的与中枢神经系统(CNS)疾病有关的一或多种症状的方法。所述方法涉及向需要治疗的哺乳动物的CNS递送包含有效量的重组腺相关病毒(rAAV)载体的组合物，所述rAAV载体包含编码基因产物，例如治疗性基因产物的开放阅读框架。可以由rAAV载体编码的靶基因产物包括(但不限于)α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、硫酸乙酰肝素硫酸酯酶、N-乙酰基- a -D-氨基葡糖苷酶、己糖胺酶、a-半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶或葡糖脑苷脂酶。可以使用本文所揭示的方法预防、抑制或治疗的疾病包括(但不限于)1型粘多糖病、II型粘多糖病或VII型粘多糖病。AAV载体可以通过多种方式投与以确保其递送到CNS/脑，以及转基因在个体的CNS/脑中成功地转导。递送到CNS/脑的途径包括(但不限于)鞘内投与、烦内投与，例如脑室内投与或侧脑室投与)、鼻内投与、血管内投与及实质内投与。
[0009]在一个实施例中，所述方法涉及向需要治疗的成年哺乳动物的CNS递送包含有效量的rAAV-9载体的组合物，所述rAAV-9载体包含编码基因的开放阅读框架。在一个实施例中，所述方法涉及向需要治疗的成年哺乳动物的CNS递送包含有效量的rAAV-9载体的组合物，所述rAAV-9载体包含编码IDUA的开放阅读框架。这些方法是部分基于发现AAV-9载体可以在成年个体的脑/CNS中高效地转导治疗性转基因，使酶水平恢复到野生型水平。(参见图15，见下文)。鉴于先前的研究证实在成年小鼠中血管内递送AAV-9无法实现广泛的直接神经元靶向(参见福斯特(Foust)等人，2009)，以及有另外的数据显示将AAV8-1DUA直接注射到成年IDUA缺陷型小鼠的CNS中引起较差的转基因表达(图18)，使用AAV-9获得的结果是出人意料的。作为原理论证，本文所描述的工作实例使用了临床前MPS1 (—种由溶酶体酶a-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)缺乏引起的遗传性代谢病症)治疗模型。所述工作实例意外地证实，将AAV9-1DUA直接注射到具有免疫能力的成年IDUA缺陷型小鼠的CNS中引起与野生型成年小鼠中IDUA酶表达和活性相同或比其更高的IDUA酶表达和活性(参见图15，见下文)。
[0010]在本发明的另一个实施例中，工作实例还证实，诱导免疫抑制作用或免疫耐受作用的辅助疗法，或免疫缺陷动物的治疗可以实现甚至更高的IDUA酶表达和活性水平。在一个实施例中，除包含编码基因产物(例如IDUA)的开放阅读框架的rAAV载体以外，还用免疫抑制剂治疗具有促进中和酶活性的免疫反应的基因型的患者(参见例如，巴贝尔(Barbier)等人,2013)。
[0011]新生IDUA 7小鼠是不具有免疫能力的。然而，向新生IDUA 7小鼠投与表达IDUA的AAV-8引起IDUA表达(伍尔夫(Wolf)等人，2011)，因此使动物耐受IDUA。如本文中所描述，使用不同投与途径显示了通过将AAV直接输注到中枢神经系统中实现成年(具有免疫能力的)小鼠中AAV介导的基因转移的适用性。举例来说，通过在具有免疫能力的、免疫缺陷型(N0DSCID/IDUA-/-)、用环磷酰胺(CP)免疫抑制或通过从出生开始每周一次注射人类艾杜糖醛酸酶蛋白质(Aldurazyme)进行免疫耐受化的成年IDUA缺陷型小鼠的侧脑室中直接注射来投与AAV-1DUA血清型9。另外，在利用和不利用甘露醇破坏血脑屏障的情况下，通过鼻内输注，通过鞘内注射及通过血管内输注向经CP免疫抑制的动物投与AAV9-1DUA。在投与载体之后8周时处死动物，并且收集脑并进行显微解剖以相较于正常和受影响的对照小鼠来评价IDUA酶活性、组织葡糖胺聚糖及IDUA载体序列。由这些研究得到的结果显示，可以采用将AAV载体直接投与CNS的众多途径，例如由此在CNS中实现较高水平的蛋白质递送和/或酶活性。此外，尽管脑是免疫赦免部位，但投与免疫抑制剂或免疫耐受化会增加投与AAV之后在脑中所发现的活性。每次投与的较高水平的表达和/或侵入性不太高的投与途径在临床上更适合患者。
[0012]因此，本发明包括重组AAV(rAAV)载体的用途，当在哺乳动物的CNS中表达时，所述rAAV载体编码具有治疗作用的基因产物。在一个实施例中，哺乳动物是患有CNS疾病或病症(一种神经系统疾病)的具有免疫能力的哺乳动物。如本文所使用，“具有免疫能力的”哺乳动物是在暴露于抗原刺激物之后，由Thl功能或IFN-γ制造响应于多克隆刺激物上调而引起细胞和体液免疫反应的一定年龄的哺乳动物，与具有固有的免疫性和来源于母体(例如在妊娠期间或经由哺乳)的免疫性的新生哺乳动物相对。不具有免疫缺陷性疾病的成年哺乳动物是具有免疫能力的哺乳动物的实例。举例来说，具有免疫能力的人类通常是至少1、2、3、4、5或6个月大，并且包括未患免疫缺陷性疾病的成年人类。在一个实施例中，AAV是鞘内投与的。在一个实施例中，AAV是颅内(例如，脑室内)投与的。在一个实施例中，AAV是在存在或不存在渗透增强剂情况下经鼻内投与的。在一个实施例中，AAV是在存在或不存在渗透增强剂情况下血管内投与，例如经颈动脉投与的。在一个实施例中，投与AAV的哺乳动物是免疫缺陷动物，或者经历免疫耐受化或免疫抑制，例如以诱导比投与AAV但未经历免疫耐受化或免疫抑制的相应哺乳动物高的治疗性蛋白质表达水平。在一个实施例中，投与免疫抑制剂以诱导免疫抑制作用。在一个实施例中，投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受化或免疫抑制(例如，仅投与AAV提供治疗作用)。
[0013]本发明提供一种预防、抑制或治疗有需要的哺乳动物的与中枢神经系统疾病或病症有关的一或多种症状的方法。所述方法包括向所述哺乳动物鞘内(例如向腰椎区域)或脑室内(例如向侧脑室)投与包含有效量的rAAV载体的组合物，所述rAAV载体包含编码基因产物的开放阅读框架，在所述哺乳动物的中枢神经系统中所述基因产物的表达预防、抑制或治疗所述一或多种症状。在一个实施例中，基因产物是溶酶体储积酶。在一个实施例中，哺乳动物是具有免疫能力的成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV载体是AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV rhlO 或 AAV-9 载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多剂。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。
[0014]在一个实施例中，所述方法包括向哺乳动物鞘内(例如向腰椎区域)投与包含有效量的rAAV载体的组合物，所述rAAV载体包含编码基因产物的开放阅读框架，在所述哺乳动物的中枢神经系统中所述基因产物的表达预防、抑制或治疗一或多种症状，并且任选地投与渗透增强剂。在一个实施例中，渗透增强剂是在所述组合物之前投与。在一个实施例中，所述组合物包含渗透增强剂。在一个实施例中，渗透增强剂是在所述组合物之后投与。在一个实施例中，基因产物是溶酶体储积酶。在一个实施例中，哺乳动物是具有免疫能力的成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV载体是AAV-1、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV rhlO或AAV-9载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多剂。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。在一个实施例中，鞘内投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受化或免疫抑制(例如，仅投与AAV提供治疗作用)。在一个实施例中，鞘内投与AAV的哺乳动物是免疫缺陷动物，或者经历免疫耐受化或免疫抑制，例如以诱导比鞘内投与AAV但未经历免疫耐受化或免疫抑制的相应哺乳动物高的治疗性蛋白质表达水平。
[0015]在一个实施例中，所述方法包括向具有免疫能力的哺乳动物脑室内(例如向侧脑室)投与包含有效量的rAAV载体的组合物，所述rAAV载体包含编码基因产物的开放阅读框架，在所述哺乳动物的中枢神经系统中所述基因产物的表达预防、抑制或治疗所述一或多种症状。在一个实施例中，基因产物是溶酶体储积酶。在一个实施例中，rAAV载体是AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV rhlO 或 AAV-9 载体。在一个实施例中，rAAV载体不是rAAV-5载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多剂。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。在一个实施例中，脑室内投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受化或免疫抑制(例如，仅投与AAV提供治疗作用)。在一个实施例中，脑室内投与AAV的哺乳动物是免疫缺陷动物，或者经历免疫耐受化或免疫抑制，例如以诱导比脑室内投与AAV但未经历免疫耐受化或免疫抑制的相应哺乳动物高的治疗性蛋白质表达水平。在一个实施例中，在投与包含AAV的组合物之前，使哺乳动物对基因产物具有免疫耐受性。
[0016]本发明另外提供一种预防、抑制或治疗有需要的哺乳动物的与中枢神经系统疾病或病症有关的一或多种症状的方法。所述方法包括向哺乳动物血管内投与包含有效量的rAAV载体及有效量的渗透增强剂的组合物，所述rAAV载体包含编码基因产物的开放阅读框架，所述哺乳动物的中枢神经系统中所述基因产物的表达预防、抑制或治疗所述一或多种症状。在一个实施例中，所述组合物包含渗透增强剂。在一个实施例中，渗透增强剂包含甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、月桂基硫酸钠、聚氧化乙烯-9-月桂醇醚或EDTA。在一个实施例中，基因产物是溶酶体储积酶。在一个实施例中，哺乳动物是具有免疫能力的成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV载体是AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV rhlO 或 AAV-9 载体。在一个实施例中，rAAV载体不是rAAV-5载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多剂。在一个实施例中，所述组合物是每周一次投与。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。在一个实施例中，血管内投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受化或免疫抑制(例如，仅投与AAV提供治疗作用)。在一个实施例中，血管内投与AAV的哺乳动物是免疫缺陷动物，或者经历免疫耐受化或免疫抑制，例如以诱导比血管内投与AAV但未经历免疫耐受化或免疫抑制的相应哺乳动物高的治疗性蛋白质表达水平。
[0017]在一个实施例中，所述方法包括向哺乳动物鼻内投与包含有效量的rAAV-9载体的组合物，所述rAAV-9载体包含编码基因产物的开放阅读框架，所述哺乳动物的中枢神经系统中所述基因产物的表达预防、抑制或治疗所述一或多种症状，并且任选地投与渗透增强剂。在一个实施例中，鼻内递送可以如美国专利第8，609，088号中所描述来实现，所述专利的揭示内容以引用的方式并入本文中。在一个实施例中，渗透增强剂是在所述组合物之前投与。在一个实施例中，所述组合物包含渗透增强剂。在一个实施例中，渗透增强剂是在所述组合物之后投与。在一个实施例中，基因产物是溶酶体储积酶。在一个实施例中，哺乳动物是具有免疫能力的成年哺乳动物。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多剂。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。在一个实施例中，鼻内投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受化或免疫抑制。在一个实施例中，鼻内投与AAV的哺乳动物经历免疫耐受化或免疫抑制，例如以诱导比鼻内投与AAV但未经历免疫耐受化或免疫抑制的相应哺乳动物高的IDUA蛋白质表达水平。
[0018]本发明还提供一种预防、抑制或治疗有需要的哺乳动物的与中枢神经系统疾病有关的一或多种症状的方法。所述方法包括向所述哺乳动物投与包含有效量的rAAV载体及免疫抑制剂的组合物，所述rAAV载体包含编码基因产物的开放阅读框架，所述哺乳动物的中枢神经系统中所述基因产物的表达预防、抑制或治疗所述一或多种症状。在一个实施例中，免疫抑制剂包含环磷酰胺。在一个实施例中，免疫抑制剂包含糖皮质激素、细胞抑制剂，包括烧化剂或抗代谢物，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、硫卩坐嘌呤(azath1prine)、巯基嘌呤或细胞毒性抗生素、抗体或作用于免疫亲和素的药剂。在一个实施例中，免疫抑制剂包含氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲、铀化合物、甲氨蝶呤、硫卩坐嘌呤、巯基嘌呤、氟尿啼啶、放线菌素(dactinomycin)、蒽环霉素(anthracyclin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、针对IL2受体-(CD25-)或CD3的抗体、抗IL-2抗体、环抱素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、类鸦片或TNF-α (肿瘤坏死因子-a)结合剂，例如英利昔单抗(infliximab)(Remicade)、依那西普(etanercept) (Enbrel)或阿达木单抗(adalimumab) (Humira)。在一个实施例中，rAAV与免疫抑制剂是共投与的。在一个实施例中，rAAV是在免疫抑制剂之前以及任选地在免疫抑制剂之后投与。在一个实施例中，免疫抑制剂是在rAAV之前投与。在一个实施例中，rAAV和免疫抑制剂是鞘内投与的。在一个实施例中，rAAV和免疫抑制剂是脑室内投与的。在一个实施例中，rAAV是鞘内投与的并且免疫抑制剂是静脉内投与的。在一个实施例中，基因产物是溶酶体储积酶。在一个实施例中，哺乳动物是成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV 载体是 AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAVrhlO或AAV-9载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多剂。在一个实施例中，所述组合物是每周一次投与。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。
[0019]本发明还提供一种预防、抑制或治疗有需要的哺乳动物的与中枢神经系统疾病有关的一或多种症状的方法。向对疾病相关性基因产物具有免疫耐受性的哺乳动物投与包含有效量的rAAV载体的组合物，所述rAAV载体包含编码基因产物的开放阅读框架，所述哺乳动物的中枢神经系统中所述基因产物的表达预防、抑制或治疗所述一或多种症状。在一个实施例中，基因产物是溶酶体储积酶。在一个实施例中，哺乳动物是成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV 载体是 AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV rhlO或AAV-9载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多剂。在一个实施例中，所述组合物是每周一次投与。
[0020]可以由rAAV载体编码的基因产物包括(但不限于)a _L_艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、硫酸乙酰肝素硫酸酯酶、N-乙酰基-a -D-氨基葡糖苷酶、β -己糖胺酶、α-半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、葡糖脑苷