用于在宿主昆虫中表达重组蛋白的杆状病毒dna元件的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明可W被列入生物技术领域；其涵盖了包含例如启动子、作为增强子的同源 区化r)、转录调节因子的编码序列（例如杆状病毒Ac-ie-OlcDNA)或其任意组合且能够提 高重组蛋白表达效率（例如在昆虫幼虫中）的核酸序列。此外，本发明还指向：包含上述本 发明核酸序列的载体本身；W所述序列或载体所感染、转化、转导或转染的昆虫；W及，使 用上述序列、载体或昆虫来生成蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 杆状病毒表达载体体系度EV巧是一种已建立完善的方法，用于生成用作疫苗、治 疗分子或诊断试剂的重组蛋白。BEVS因其过度表达潜力及快速发展速度，而成为用于生成 任何用途的重组蛋白的最诱人选择之一。工业中最常用于重组蛋白表达的杆状病毒载体 基于首猜银纹夜蛾（Autographacali化rnica)多核多角体病毒（AcMNPV)，W草地贪夜蛾 (Spodopterafrugiperda)9(Sf9)或21(Sf21)昆虫细胞为合适表达宿主（1)，并W粉纹夜 蛾（Trichoplusiani，或T.ni)昆虫幼虫为活生物工厂（2)。邸VS开发于80年代（3)，自 此W来，已在杆状病毒感染的昆虫细胞中成功生成了从胞质酶到膜结合蛋白的数百种重组 蛋白。
[0003] 全世界每年约生产70000吨蚕丝，其生产过程中，将低价值的原料桑树叶转化为 基于蛋白质的高价值产物蚕丝。昆虫是高效的蛋白质生产者，因为其新陈代谢快。鱗翅 目，例如家蚕度ombyxmori)或粉纹夜蛾（Trichoplusiani)，是生物技术中最常用的两种 昆虫。它们在不到2周内即可将体积成长约5000倍，并生产出每只昆虫超过1千米的蚕 丝。丝腺细胞可W产生约80μg蛋白质/细胞/天，而最好的哺乳类细胞培养体系仅能产 生约50pg蛋白质/细胞/天。从培养哺乳类细胞中得到的重组蛋白可能受外源因子（例 如病毒或航病毒）感染的担忧，在人用或动物用的昆虫源产品中即使并非绝不存在，亦显 著较低。虽然已经产生了转基因桑蚕来生成人医疗蛋白（4)，但该技术尚未用于生产疫苗 抗原。但是，转基因杆状病毒（首猜银纹夜蛾多核多角体病毒和家蚕核型多角体病毒）已 经用于生产昆虫源疫苗（insectigen)。从根本上来说，用于在昆虫细胞培养物中进行抗原 表达的相同杆状病毒可W用于感染昆虫幼虫。感染后，重组抗原在昆虫组织中积累，在感染 后3-4天，即可处理该幼虫W获得该重组抗原，其获取数量可W在每条受感染幼虫数百微 克（yg)至数毫克之间。针对动物感染性疾病的实验性疫苗也得到了极好的测试结果，哪 怕使用的是从幼虫获得的未纯化可溶抗原，且在对动物进行重复免疫程序后没有任何副作 用巧，6, 7, 8)。其他一些不同用途的蛋白质也是W昆虫作为活生物工厂来生产的，例如酶 (9, 10)、抗体（11，12)、荷尔蒙（13, 14)、细胞因子（15, 16)和诊断性蛋白（17, 18, 19, 20)。 上述蛋白中大多数在合成后经过正确处理，且其功能活性在可溶性幼虫蛋白提取物中保持 完整。用昆虫作为活生物工厂，因其生产多功能性、可扩展性、效率性和发展速度，是有希望 取代常规发酵技术和植物源蛋白的一种替代方式，
[0004] 加速重组蛋白表达，从而能够在昆虫幼虫的细胞机器被杆状病毒感染严重损 坏之前进行蛋白表达，将会是BEVS的一项重要改进。由常规强病毒启动子多角体蛋白 (polyhe化in,即po化）或plO基因所驱动的晚期表达，在外源蛋白翻译后修饰中具有严重 不利条件。杆状病毒启动子能够比常规使用的P0化或plO启动子更早地启动表达，因此其 特性在于可用作异源蛋白生产，但其生产力降低（21)。
[0005] 改进BEVS的另一种可能是，通过减少病毒诱导的细胞死亡，在感染后晚期更好地 保存细胞完整性。降低感染后晚期因BEVS导致的昆虫细胞机器严重损坏，将不仅增加可用 于生产和积累重组蛋白（分泌或未分泌）的时间，还为复合蛋白的折叠或生成蛋白的所有 翻译后修饰提供更多时间。杆状病毒感染的昆虫幼虫在感染过程中W病毒剂量依赖性的方 式生产和积累重组蛋白。延长受感染幼虫的存活，连同针对高感染剂量进行某种保护，可W 极大地提高充当活生物工厂的昆虫的生产力。
[0006] 已经测定出一些杆状病毒DNA元件参与启动了病毒传播所必需的后期表达因子 的基因。其中之一为AcMNPV(首猜银纹夜蛾（Autographscalifornica)多核多角体病毒） 的立即早期（ie)蛋白（immediateearlyprotein)IE-1及其剪接变体IE-0。因其内部翻 译起始，翻译由Ac-ie-01cDNA编码的AcMNPVmRNAs会既产生IE-0又产生IE1。两者均 由于具有作为转录调节因子的能力（22)而被认为是杆状病毒基因表达的关键调节因子。 AcMNPVIE-1合成于感染极早期，是67-kDa的二聚DNA结合性蛋白，在质粒转染试验中，它 通过其N端酸性结构域的活性来刺激转录（23, 24)。IE-1在细胞核中累积，且保留于此度 过晚期（25)。IE-1作为同源二聚体与杆状病毒同源区域化r)序列的结合，能增强IE-1 的反式激活，所述同源区域充当转录增强子W及病毒DNA复制起点。AcMNPV立即早期蛋白 IE-0(74kDa)与IE-1相同，只是其N端上另有54个氨基酸残基。AcMNPVIE-0是含636个 氨基酸的72. 6-kDa的蛋白，它由orfl41 (exonO)所编码的38个氨基酸、iel上游未翻译前 导所编码的16个氨基酸W及IE-1蛋白的全部582个氨基酸所组成。因此，除了融合在N 端的额外54个氨基酸外，最终产物与IE-1 -模一样。推测因为其共有序列，IE-0和IE-1 具有相同的生物化学活性，包括结合虹增强子和转录调控。
[0007] 由于缺乏强于商用启动子（PO化和plO)的新型替代启动子，W及缺乏任何能通过 降低病毒导致的细胞损伤从而在杆状病毒体系中实现长期表达的替代形式，因此，本发明 聚焦于通过在杆状病毒表达组件中并入重组DNA元件的方法，解决所述问题。令人吃惊地， 本发明展示了 ：包含杆状病毒转录调节因子、增强子同源区域化r)序列、启动子或启动子 组合的所述表达组件，能够将昆虫幼虫中的重组蛋白生产提高到前所未有的水平。此外，本 发明的表达组件还提高了高感染剂量杆状病毒感染的昆虫幼虫在感染后晚期的存活率，由 此令杆状病毒感染对昆虫的致病作用最小化。另一方面，提高了杆状病毒感染期间的细胞 功能完整性，也有助于在昆虫幼虫中进行正确的重组蛋白翻译后加工。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了用于改进杆状病毒感染的昆虫幼虫中的重组蛋白表达的方法及其 产物。
[0009] W下各项为能够实现该改进表达的优选实施例：
[0010] 1.含有能够高于内源水平地表达充当转录调控因子的蛋白IE-1、IE-0和/或其 片段的核酸序列的昆虫，其中所述核酸选自：
[0011] (a)含有如SEQIDNO: 1-5中任一项所示的核巧酸序列的核酸；
[001引 化）与SEQIDNO: 1-5中任一项所示的核巧酸序列的序列一致性为至少70%、优 选为至少75 %、更优选为至少80 %、更优选为至少85 %、更优选为至少90 %、最优选为至少 95%，并编码能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的蛋白的核酸序列；
[0013] (C)编码含有如SEQIDN0:6-9中任一项所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列； W及
[0014] (d)编码了与SEQIDN0:6-9中任一项所示的氨基酸序列的序列一致性为至少 70 %、优选为至少75 %、更优选为至少80 %、更优选为至少85 %、更优选为至少90 %、最优 选为至少95%并能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的氨基酸序列的核酸序列。
[0015] 2.根据第1项所述的昆虫，进一步包括至少一个充当增强子区域并可操作地连接 任何适用于驱动重组蛋白表达的启动子的重组同源区域化r)。
[0016] 3.根据第2项所述的昆虫，其中所述重组同源区域化r)是如SEQIDN0:27(虹1) 所示的序列。
[0017] 4.根据第2或3项所述的昆虫，其中，所述可操作地连接在所述重组同源区域 化r)上的启动子选自如下核酸：
[001引 （a)含有如SEQIDNO: 10-16中任一项所示的核巧酸序列的核酸讯
[0019] 化）能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQIDNO: 10-16中任一项所示的核 巧酸序列的序列一致性为至少70%、优选为至少75%、更优选为至少80%、更优选为至少 85 %、更优选为至少90 %、最优选为至少95 %的核酸序列。
[0020] 5.根据1-4中任一项所述的昆虫，包含了含有重组启动子、编码转录调控因子的 序列、选自SEQIDNO: 17-26的增强子区域的组合的核酸序列。
[0021] 6.根据1-5中任一项所述的昆虫，进一步包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所 述核酸序列可操作地连接在选自第1-5项中的核酸序列。
[002引 7.根据1-6中任一项所述的昆虫，其中所述昆虫来自鱗翅目（Lepidoptera)。
[0023] 8.根据1-7中任一项所述的昆虫，其中所述昆虫选自Jrichoplusiani(粉纹夜 蛾）、Spodopterafrugiperda(草地贪夜蛾）、Spodopteraexigua(甜菜夜蛾）、Ascalapha odorata、Bombyxmori(家蚕）、Rachiplusiani和Stigmeneacrea。
[0024] 9.根据1-8中任一项所述的昆虫，其中所述核酸序列是通过重组杆状病毒（优选 为AcMNPV或BmNPV)引入该昆虫的。
[002引10.用于产生重组蛋白的方法，包括：使用1-9中任一项所述的昆虫，并通过常规 方法对重组蛋白进行提取和纯化。
[0026] 11.根据第10项所述的用于生产重组蛋白的方法，其中所述重组蛋白选自：亚单 位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、病毒样颗粒、治疗蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗 凝剂、受体、荷尔蒙或诊断性蛋白试剂。
[0027] 12.用于含有如1-6中任一项所述核酸序列的昆虫的饲育、喂养或注射培养基。
【附图说明】
[0028] 图1:本发明的杆状病毒重组DNA元件的示意图，包括4种主要元件：编码转录调 控因子的序列（A，例如IE0和IE1)，其表达受到启动子度，例如P0化或地2g)的驱动；增强 子同源区域化r)序列（C，例如虹1)，位于驱动编码重组蛋白的外源基因表达的启动子值；e.g.plO、pB2gplO或p6. 9pl0)的上游。该示意图展示了本发明的重组DNA元件之间相互作 用，从而获得前所未有的重组蛋白过度表达的理论机制。
[002引 图2 :使用"克隆体系（invitrogen?)生成重组杆状病毒的不同策略。
[0030]图3 :生成与其他用于制备重组杆状病毒的商用技术相兼容的克隆、供体和转移 载体的基本方案。
[0031] 图4 :A)用在PO化启动子控制下表达GFP蛋白的常规杆状病毒或含有本发明的杆 状病毒组件PO化Ac-ie-01/虹lp6. 9plOGFP的杆状病毒，W500或50000P即接种粉纹夜蛾 灯richoplusiani)幼虫（五龄），在感染96小时后所生成的重组GFP。B)W图4A中的相 同杆状病毒W两种不同感染剂量，即500和50000P即S，感染96小时后的幼虫存活率。 [003引图5 :A)包含本发明的表达组件PO化Ac-ie-01/