一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和农业工程领域，具体涉及一种抗菌的诸葛菜人工种子的制 作方法。
【背景技术】
[0002] 诸葛菜属于十字花科一、二年生草本植物，广泛分布于我国东北、华北，适应性强， 耐寒、耐旱、耐阴，病虫害少。花呈紫色或白色，生活史从每年9月至次年6月，甚至在寒冷冬 季仍可保绿不枯，可以较好地覆盖地面，是北方地区不可多得的早春观花，冬季观绿的地被 植物，因此深受人们喜欢。诸葛菜种子的脂肪酸组成中，芥酸、亚麻酸含量低，棕榈酸、油酸 和亚油酸的含量为总脂肪的89.8%，即诸葛菜为高亚油酸低芥酸种质，其种子油是品质优 良的食用油，尤其适合心血管病患者食用。近年来诸葛菜在组织培养、体细胞杂交等方面的 研究多有进展，诸葛菜人工种子技术也颇有进展，现在已经建立了一套较为完整的诸葛菜 人工种子制作方法，但距离实际应用还有一定距离。
[0003]人工种子技术的实质就是将组织培养产生的外植体，如芽或胚状体，包埋在人工 制作的含有特定激素和营养的胶囊中，具有天然种子长成植株的功能。与天然种子不同，人 工种子不受季节的影响，可以根据播种环境改变激素和营养物质配方，而且成本低廉，可控 性强，研制成功必然会带来一场农业革命。
[0004] 防腐抗菌问题一直是阻碍人工种子技术大规模推广的一大难题，常用杀菌剂如多 菌灵、青霉素、先锋霉素等均对植物有一定负面影响，并且单独添加往往只能抵抗几种菌类 污染。目前诸葛菜人工种子只能在无菌条件下萌发，并未有人进行过诸葛菜人工种皮抗菌 性研究，因此抗菌能力的研究已经成为推广诸葛菜人工种子技术发展亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，制作出来的诸葛菜 人工种子种皮具有较高的抗菌能力、种子可以在有菌环境中顺利萌发，为诸葛菜人工种子 技术进一步走向实际应用提供技术支持。
[0006] 本发明采用具体技术方案为：
[0007] -种抗菌的诸葛菜人工种子的制作，包括步骤：
[0008] 步骤1，诸葛菜的芽诱导：取诸葛菜幼苗，无菌水冲洗，切取腋芽和顶芽，消毒后进 行芽诱导培养；
[0009] 步骤2，诸葛菜的芽繁培养:取步骤1芽诱导培养的诸葛菜组培苗，切取幼芽，转接 到芽繁培养基上进行芽繁培养；
[0010] 步骤3,诸葛菜芽的包埋和人工种子胶囊制备：取步骤2中在芽繁培养基上生长的 幼芽，切取若干个一定长度的芽并逐个放在包埋液表面，所述包埋液是含纳米二氧化钛的 质量浓度为7 %海藻酸钠水溶胶；用玻璃吸管先吸取少量包埋液，再吸入一个诸葛菜芽，然 后滴入质量浓度为2%的CaCl2溶液中，络合反应形成固态人工种子，取出所述固态人工种 子，于无菌水中清洗并吸干表面水分即可。
[0011]进一步，所述步骤1中的芽诱导培养使用的培养基的成分包括:MS培养基、2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3%蔗糖、0.65%琼脂;芽诱导过程的光照强度为2000~3000LUX日光灯 照射12小时。
[0012]进一步，所述步骤2中的芽繁培养基的成分包括:MS培养基、2.5mg/L 6-BA、0.2mg/ L NAA、3%蔗糖、0.65%琼脂;芽繁培养的光照强度为2000~3000Lux日光灯照射12小时。 [0013]进一步，所述步骤3中在芽繁培养基上生长的幼芽生长时间为30天;切取若干个芽 的长度为8mm。
[0014]进一步，所述步骤3中包埋液的成分包括：质量浓度为7%海藻酸钠水溶胶、0.1_ 0.2mg/L NAA、20-40g/L nTi〇2、l/2MS培养基、3%蔗糖。
[00?5] 更进一步，所述nTi〇2为锐钛型纳米Ti〇2，其粒径为15 ± 5nm。
[0016] 更进一步，所述NAA优选为0· lmg/L，所述nTi〇2优选为30g/L。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 1.因添加纳米二氧化钛，常规的海藻酸钠（质量浓度小于5%)难以使诸葛菜人工 种子固化形成胶囊，本发明使用质量浓度为7%海藻酸钠浓度水溶胶作为包埋液，解决了诸 葛菜人工种子难以固化的问题。
[0019] 2.本发明生产的人工种子具有很好的抗菌效果，不需要在无菌环境下完成种子的 制作，完全可用于有菌环境下播种，与添加传统抗菌剂的诸葛菜人工种子相比具有明显优 势;可显著提高了种子的萌发率和萌发速度，对植株毒害作用小，为诸葛菜人工种子从实验 室走进大田提供了技术支持。
[0020] 3.本发明开展了不同配比的NAA和纳米Ti02对诸葛菜人工种子萌发的影响研究以 及有菌萌发实验，找出纳米二氧化钛和NAA的最佳配比，实现了纳米二氧化钛抗菌和促萌、 促生的完美结合。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0022] 本发明的实施例中，一种抗菌的诸葛菜人工种子制作方法，包括以下步骤：
[0023]步骤1，诸葛菜的芽诱导:取诸葛菜幼苗，无菌水冲洗3分钟，切取腋芽和顶芽，在超 净工作台上完成消毒，无菌接种在芽诱导培养基上进行芽诱导培养;芽诱导培养基的包括： MS培养基、2mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤）、0 · 2mg/L ΝΑΑ(α-萘乙酸）、3 %蔗糖、0 · 65 %琼脂； 芽诱导过程的光照强度2000~3000LUX日光灯照射12小时；
[0024] 步骤2，诸葛菜的芽繁培养:取步骤1芽诱导培养的诸葛菜组培苗，切取幼芽，转接 到芽繁培养基上进行芽繁培养；芽繁培养基的包括:MS培养基、2.5mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、3 %蔗糖、0.65 %琼脂;芽繁培养的光照强度为2000~3000Lux日光灯照射12小时；
[0025] 步骤3,诸葛菜芽的包埋和人工种子胶囊制备：步骤2中的幼芽在芽繁培养基上生 长30天后，取出，置于超净工作台上并切取8mm左右的芽若干个，将切取的若干个芽逐个放 在包埋液表面，所述包埋液是含纳米二氧化钛的7 %海藻酸钠水溶胶，其组成包括:质量浓 度为7%海藻酸钠、0.1-0.2mg/L NAA、20-40g/L nTi02、l/2MS培养基、3%蔗糖，其中nTi02为 锐钛型纳米Ti0 2，其粒径为15 ± 5nm;
[0026] 所述步骤1、步骤2和步骤3中的MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细 胞培养设计的培养基，包括:大量元素:NH4N03为1650mg/L、KN0 3为1900mg/L、CaCl2