细胞质雄性不育的菊苣属植物的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及细胞质雄性不育的(CMS)菊宦属(Cichorium)植物，尤其设及细胞质雄 性不育的（CMS)绿菊宦（green chicory)植物、细胞质雄性不育的（CMS)红菊宦(radiccMo rosso)植物、细胞质雄性不育的（CMS)红叶菊宦(red leaved chicory)植物、细胞质雄性不 育的(CMS)特拉维索(TreviSO)植物、细胞质雄性不育的（CMS)牧草菊宦（sugar loaf)植物、 细胞质雄性不育的（CMS)白菊宦(White chicory)植物、细胞质雄性不育的（CMS)比利时苦 宦(Belgian endive)植物、细胞质雄性不育的（CMS)玉兰菜(Witloof)植物、细胞质雄性不 育的（CMS)西科里拉(化talogna)植物、细胞质雄性不育的（CMS)苦宦植物、细胞质雄性不育 的（CMS)芽球菊宦（C.intybus var.foliosum)植物、细胞质雄性不育的（CMS)栽培菊宦 (C. endivia)植物和细胞质雄性不育的（CMS)菊宦根(C. intybus L. var. sativum)植物。本 发明进一步设及确认细胞质雄性不育(CMS)的菊宦属(Cichorium)植物的方法，W及在菊宦 属(Ci Chor ium)植物中提供细胞质雄性不育(CMS)的线粒体核酸序列。
【背景技术】
[0002] 可获得几种不同栽培形式的菊宦属（Cichorium):如绿菊宦（green chico巧）、红 菊宦（radicchio rosso)或红叶菊宦（red leaved chicoiT)、特拉维索（Treviso)、白菊宦 (white chicoiT)、牧草菊宦（sugar loaf)、比利时苦宦（Belgian endiveK玉兰菜 (witloof))、西科里拉（Catalogna)(所有的芽球菊宦（C. intybus var. foliosum))、苦宦 (栽培菊宦(C.endivia))，另外，菊宦根(C. intybus L. var. sativum)也是已知的。栽培菊宦 根W得到其主根，从其主根获得几种产品，如菊粉、啤酒的调味香料、咖啡替代品W及聚合 物生产的基质。
[0003] 种植玉兰菜(Witloof),首先得到其主根，然后强制其进入黑暗中W产生周知的玉 兰菜、比利时苦宦或卷屯、菜芽(chicon)。通过营养液培养或常规培养进行运种强制。
[0004] 叶菊宦（芽球菊宦（Cichorium intybus var.foliosum))的实例是红菊宦（具有 红、绿杂色的叶子，有时具有白色叶脉）、特拉维索、西科里拉和绿屯、菊宦（green hearted cMco巧）。所有菊宦品种的特点是都有些苦味。菊宦族(Cichorieae)的另一成员是苦宦 (Cichorium endivia)。
[0005] 菊宦族是菊科(Asteraceae)(之前是Compositae)的一部分，向日葵（向日葵属 化elianthus))、生菜（窝宦属（Lactuca))、金盏花(Calendula)、紫苑属(Aster)和紫锥花属 (Echinacea)都属于该菊宦族(Cichoriae)。
[0006] 使用现有的最先进的技术用于市售的菊宦属种子(如红菊宦、特拉维索及其他品 种），使用花粉管竞生来生产杂种植物。
[0007] 花粉管竞生是植物学现象，其中在花粉管之间存在竞争，示出生长速率上的差异。 同一植物（自花传粉）的花粉管，比异花传粉的另一植物的花粉管更慢地穿过花柱。利用运 一机制来增加异花受精的份额导致产生不纯的、期望的杂种，但是并不能排除自花受精。在 实践中，所产生的种子中高达30%由自花受精的产物组成，换句话说，是由近交植物组成， 而不是由杂种植物组成。使用种子清选法可将运一百分比降低至10%~20%，但运仍然过 局。
[0008] 使用花粉管竞生的其他缺点是，在维持雌系（具有花粉管竞生）的过程中，产生更 多花粉的个别植物将它们的基因更有效地扩散到种群中，从而在若干代之后潜在丢失了花 粉管竞生，即无用的亲本系。
[0009] 此外，花粉管竞生不是在菊宦属的所有品系中都存在，从而降低了产生商业上感 兴趣的杂种的组合可能性。
[0010] 为了培养上述所有形式的菊宦具有可用的、高度均一、优选基本100%均一的Fl杂 种是有利的。与现在普遍可用的种族相比，运些杂种菊宦属品种具有数个优点。
[0011] 最重要的优点是极好的均一性，运样的Fl杂种将赋予即基本上100%的均一性。 运样，除了在分炼作物之后产生最小损失之外，还能够同时或者同步进行收获。
[0012] 例如，红菊宦的颜色变得不太强烈当作物很长一段时间暴露于高溫和强烈的日 光。同步收获该产物的可能性，降低了种植者的损失。
[0013] 当就菊宦属植物的遗传组成（即基因组)而言，菊宦属植物是高度均一或者是基本 上100 %均一时，对于种子生产者和作物种植者来说都有数个优点。
[0014] 当可提供高度均一的Fl杂种时，生产者得到W下优点：可使用亲本的更多组合，从 而产生更广范围的可用杂种。
[0015] 目前，作为引发等的种子处理或选种用处不大，因为各批种子的均一性太低。当可 获得所期望的高度均一的杂种的高质量种子时，如种子的引发和其他种子技术处理的加工 方法就变成有用的了。
[0016] 对于种植者，高度均一的杂种的优点是，由非常同质的产物(没有所谓的异型株） 组成的全部作物的收获和加工周期短。为此，需要较少的劳力来收获作物并进行准备W用 于出售。
[0017] 尤其对于在考虑例如红菊宦时的颜色，高度均一或基本上100%均一的杂种具有 一致的品质。市场上可获得的品种现在不能确保该一致的品质。
[0018] 最后，可W注意到，高度均一的Fl杂种会表现出种子更好的出苗。
[0019]对于Cichorium endivia(苦宦），现有技术的杂种生产是不可能的；如花粉管竞生 的机制在苦宦中不存在。因此苦宦是100%自花传粉的作物，尽管示出高水平的均一性，但 它具有较差的杂种优势。
[0020]为了改善上述问题，进行了很多研究W开发用于菊宦属杂交的其他方法。在Enza Zaden(化 1001554)和Florimond Desprez(W0 97/45548)的专利申请中记载了一种运样的 方法，其中，通过细胞融合，来自向日葵化elianthus annuus)的细胞质因子被引入到菊宦 属物种中。运样产生了细胞质雄性不育(CMS)的菊宦属育种材料。Sakata Seeds递交了类似 的专利申请WO 2007/049730,其中，来自向日葵的CMS被转移到生菜(Lactuca sativa)中。 [0021 ] Az.Agricola T&T的专利申请WO 2012/163389中记载了另一途径，其中，隐性或 遗传核编码的雄性不育通过诱变被引入到菊宦属中。因为所记载的特性的隐性性状，使用 运一系统产生的Fl杂种是雄性不育的。运一系统的另一缺点是，雄性不育的母本(表示为 ms/ms)必须通过体外或体内的方法进行无性繁殖。
【发明内容】
[0022] 鉴于此，本发明的目标是提供避免了现有技术的上述缺点的细胞质雄性不育的菊 宦属(Cichorium)植物。
[0023] 通过提供如在所附权利要求书中记载的植物，本发明已经满足了上述目标。
[0024] 具体地，根据第一方面，通过包括窝宦属化actuca)的线粒体的细胞质雄性不育的 菊宦属(Cichorium)植物，本发明已经满足了上述目标，其中，所述窝宦属的线粒体包括选 自由沈Q ID No.1、沈Q ID No.2、沈Q ID No.3、沈Q ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、 沈Q ID No.7、SEQ ID No.8、沈Q ID No.9和沈Q ID No. 10组成的组中的至少一种线粒体核 酸序列。
[0025] 开始研究计划，W鉴定可用作在菊宦属中引入细胞质雄性不育（CMS)的合适的供 体植物物种。在本上下文中，"合适的"也指避免了现有技术的缺点。
[0026] 在生菜（窝宦属化actuca SP.))中，不存在CMS。窝宦属化actuca)和菊宦属 (Cichorium)属于菊科(Asteraceae)，并且在运一科内，分别属于菊宦族(Cichorieae)或窝 宦方矣(Lactuceae)。
[0027] 研究窝宦属和菊宦属的组合，W确定菊宦属的细胞核与窝宦属的细胞质组合是否 会产生细胞质雄性不育(CMS)的菊宦属。
[0028] 在生菜(窝宦属）中，不存在CMS。窝宦属与菊宦属相关，两者都属于菊科，并且在运 一科内，属于菊宦族或窝宦族;因此选择窝宦属植物，作为用于与菊宦属进行杂交和不对称 的细胞融合的候选物。
[0029] 使用上述窝宦属，研究与菊宦属的组合，W确定菊宦属的细胞核与窝宦属的细胞 质组合是否会产生细胞质雄性不育的菊宦属。该研究尤其针对几种窝宦属物种，因为初始 研究认识到菊宦属与窝宦属的杂交产生有限量的种子。通过作为分子研究的流式细胞法， 识别自运些种子生长的作为杂种的植物。
[0030] 在获得菊宦属与窝宦属之间的运一杂种之后，有必要进行几次回交，W恢复菊宦 属的遗传设置。使用如菊宦属的作物，将耗费至少8年，在杂交产物中重构运一物种的全基 因组。其次，不同物种之间的杂交效率非常低，尤其是在第一代中，因此所产生的种子的量 最初会非常有限。
[0031] 在几代之后，窝宦属基因组的量被充分稀释，但是需要通过自花传粉得到的近交 代，来选择产生杂种所需的遗传稳定的候选亲本。但是，因为运一材料是雄性不育的，因此 运一最后的自花传粉步骤是不可能的。
[0032] 为了提供解决之前提到的缺点的方案，Bejo Zaden B.V.(贝霍种子有限公司）在 菊宦属(Cichori皿)物种和窝宦属(Lactuca sp.)之间进行了不对称的细胞融合。
[0033] 简单来讲，分离来自两种物种的原生质体。使用灭活细胞质的舰乙酷胺（IOA)或舰 醋酸盐（IA)，处理来自菊宦属(受体)的原生质体。使用电离福射处理窝宦属(供体）的原生 质体，W灭活或破坏核基因组，但保持细胞质中的活性遗传成分(叶绿体和线粒体）。
[0034] 在阳G/化2+介导的细胞融合之后，使用菊宦属的核基因组m及园艺特征），而使用 窝宦属的细胞质，形成一种或多种新的细胞。可在试管或皮氏培养皿中，进行运一融合。PEG 在此作为促进细胞联合的工具，高抑和化h离子是细胞实际融合的先决条件。使用FDA染色 程序，W确认产生的细胞是存活的。
[0035] 使用包括水、盐、维生素、糖和植物激素的合适的培养基，W促进愈伤组织的形成。 随后，通过促进最终生根的嫩枝的出现，进行植物的再生；另外，运些阶段依赖于使用合适 的植物激素。
[0036] 在再生之后，使用流式细胞法，检测所获得的植物的正确的DNA含量。然后，对从该 检测中产生的二倍体植物进行分子测试，W确定窝宦属细胞质的存在。为了运一目的，使用 RAMP技术来区分菊宦属与窝宦属的细胞质。
[0037] 对含有菊宦属核材料与窝宦属细胞质组合的植物的进一步研究，示出在再生的融 合植物中间，出现了雄性不育、同时保留雌性育性的个体植物，即根据本发明的植物。确认 出的运些植物的频率是21株原始融合植物中约有1株。
[0038] 获得的植物具有在花药上有可见花粉粒的花，但是运些花粉粒比野生型花粉粒 小，并且使用抑A染色技术，示出杂种植物的花粉是无活力的。相应地，Fl杂种植物