大斑病长蠕孢抗性植物的制作方法

大斑病长蠕孢抗性植物的制作方法
【专利说明】大斑病长蠕孢抗性植物 发明领域
[0001] 本发明涉及使用分子生物学方法和标记技术、与遗传工程一起进行植物改造的领 域。本发明涉及新型的大斑病长懦孢(Helminthosporium turcicum)抗性植物，特别是包含 具有一个或多个抗性赋予基因（在来自种质Pepitilla的修饰的染色体片段上)的多核苷酸 的玉米植物，以及其细胞、组织、部分、谷粒和种子，包含一个或多个针对大斑病长蠕孢的抗 性赋予基因的分离的多核苷酸，含有此多核苷酸的载体、转基因植物细胞和转基因植物。本 发明还涵盖了适宜的分子标记以及其用于将抗性基因座或者转基因引入植物中的用途，以 及涵盖了对包含修饰的染色体片段的经改良玉米植物的鉴别。
[0002] 发明背景
[0003] 在玉米(Zea mays L.)中，有大量引起叶疾病的真菌病原体。目前能够在热带和温 带气候条件下(如欧洲和北美的大部分以及非洲和印度）引起最多破坏的真菌，已知为大斑 病长懦孢或者也称作玉米大斑病菌(ExserohiIum turcicum(Pass ·) )Leonard和Suggs(有 性型：Setosphaeria turcica(LuttrelI )Leonard&Suggs)。大斑病长懦抱（H. turcicum)是 引起已知为"玉米大斑病"（NCLB)的叶斑病的起因，其在潮湿年份可以流行病的比例发生， 攻击易受感染的玉米玉米品种并引起大量的破坏和30%的产量的可观损失以及同时影响 更大的区域（Perkins&Pedersen，1987 ;Raymundo&Hooker，1981a;Ullstrup&Mi Ies，1957) 〇 继而从I 970年代起，就已经在遗传材料中寻找天然的抗性。目前，已知有数量 (quant i tat ive)和质量(qualitative)抗性。寡基因或多基因数量抗性在表现型方面显得 不完全并且对于小种没有特异性以及会受到额外的和部分显性的基因影响，而质量抗性通 常是小种特异性的并且可以通过个体的、大多为显性的基因来遗传，如Htl、Ht2、Ht3、Html 或Htnl(Lipps et al.，1997;Welz&Geiger，2000)。在许多频繁使用的近交玉米品系如W22、 A619、B37或B73中的回交(backcross)已经成功地实现了HT基因的渐渗（introgression)， 其中它们呈现出部分显性和作为各自遗传背景的函数的表达(Welz，1998)。
[0004] 虽然在玉米中对NCLB抗性有此种复杂的遗传结构，但是目前原则上在玉米中使用 Htl基因结合部分数量抗性已经足以控制长懦孢疾病（helminthrosporiosis) (Welz， 1998)。其基础在于，从全球来看，大斑病长蠕孢的小种0在使用方面占据优势（大约55%) (Lipps等，1997;Ferguson&Carson，2007)，而其它的小种如2N和23N仅仅在很少的情况下使 用并且即时使用也是在地理上有限的区域（Moghaddam&Pataky，1994; Jordan等，1983 ; Lipps&Hite，1982 ;Thakur等，1989 ;Welz，1998)。此小种0对于具有Htl的玉米植物而言是无 毒性的，因而当具有适宜的数量抗性时，其呈现出对NCLB的足够的一般抗性。然而，许多研 究已经报道了不太常见小种日益增加的散播(Jordan等，1983;Welz，1998;Pratt&Gordon, 2006)。其原因与病原体的种群动态相关，种群动态使得病原体毒性可以通过无毒性基因的 新突变以及可用毒性基因的新组合来发生变化。最终，这可以导致发生新的、适宜的、有时 更有侵略性的病原体小种。例如在巴西，大斑病长蠕孢种群已经表现出在小种组成方面比 起例如北美来说实质上更加多样化。Gianasi等（1996)报道了已经突破Htl基因赋予的抗性 的大斑病长蠕孢小种。另外，抗性基因对某些环境因素有不稳定性，如在一些气候区域的温 度和光强度(Thakur等，1989)。这一进展的后果在于，全球来看，使用新型的HT抗性基因或 者目前很少关注的基因用于商业玉米植物的生产在重要性上正在日益增加，以便在玉米中 引导出针对大斑病长蠕孢的更广谱的且更长效的抗性。Pataky等早在1998年就在此方面尝 试了最初的方法。通过使用Ht 1和Htnl的组合在sh2良种玉米中改善了 NCLB抗性。
[0005] 单基因 Htnl抗性的来源是墨西哥地方品种"Pepiti 11a"（Gevers，1975) aHtnl渐渗 品系呈现定位在染色体8的长臂上距离Ht2大约IOcM以及距离RFLP标记umcll7(bin 8.06) 大约8cM(Simcox&Bennetzen, 1993)的基因。与通常的HT抗性基因相反，Htnl通过延缓孢子 形成的发生而赋予抗性，并由此防止病斑的发展。结果，形成的病斑较少且较小以及孢子形 成区域减少(Raymundo等，1981b ,Simcox&Bennetzen, 1993)。没有形成褪绿坏死病斑，如具 有Htl、Ht2或Ht3赋予的抗性所发生的那些(Gevers ,1975)。然而，Htnl基因杂合状态下的抗 性反应比纯合状态的有效性显著更低(Raymundo等，1981b)。
[0006] 开发能够简化基因型测定的另外的特异性标记会改善Htnl基因的育种可控性。标 记辅助筛选(MAS)技术因而使得若干抗性基因的有效堆叠或聚合成为可能(Min等，2012)。 在许多研究中，使用了渐渗品系B37Htnl或W22Htnl来对抗性基因座进行定位以及鉴别抗性 的来源（Raymundo等，1981a，b; Simcox&Bennetzen，1993 ,Bar-Zur等，1998 ;Coates&White， 1998)。然而，可用于从Pepitilla种质筛选Htnl的抗性基因座的标记的有效信息依然很有 限（Simsox&Bennetzen, 1993)。在来自PepitiIla种质的抗性基因座旁侧并且对其有功用的 针对Htn 1的已知标记依然只定位在接近22.2cM的距离，其在最好的情形中允许筛选出大的 染色体片段。然而，经常会有的风险是，在标记之间的此片段内，发生双遗传重组可导致 Htnl抗性基因座的假阳性选择。另外，在一些情形中，不期望的遗传区域被带入到渐渗品系 的可能性随着所渐渗的染色体片段的大小而增加并且可以在良种品系的代际之间传播。此 类遗传区域已知为连锁累赘（linkage drag)，特别是当它们与Htnl基因座紧密偶联并明确 导致一或多种农学特征的负面影响时。然而，从研究和使用了具有来自Pepitilla的Htnl的 渐渗品系的研究可知，此类负面影响是未知的。即便是Welz (1998)同样在B37Htnl中所进行 的非常详尽的研究，也认为是如此，例如，Htnl基因座的渐渗对产量和成熟未带来显著的劣 势。因此，现有技术中尚未进行过严肃的努力来研讨如何缩短大染色体片段。
[0007] 相反，WO 2011/163590公开了基因型PH99N作为染色体8bin 5上NCLB抗性的另外 的来源，然而，其并不对应于Pepitilla种质。基本上，只有对于大斑病长蠕孢小种0和1的抗 性已经在来自PH99N的回交群体中进行了鉴别。即便是抗性表现型也没有清楚地确定。尽管 如此，作者们得到的结论是，该抗性是由于Htnl基因。但是PH99N中的抗性基因座被限制在 仅仅~224kb长的染色体片段;然而，具有该224kb片段以及因而具有所述推断的Htnl的抗 性玉米植物并未公开。另外，所述基因型PH99N未通过保藏而使公众可得。
[0008] 使得所述Htnl基因有用的另外的方法是鉴别和克隆抗性基因并将其用于转基因 策略。
[0009] 为了鉴别NCLB的抗性基因，在2010年，Chung等2010发表了对bin 8.06抗性基因座 进行精细定位的研究。然而，所研究的染色体片段，并非源自Pepitilla而是源自玉米杂交 种DK888(其呈现出多种疾病抗性）。对长懦孢属(Helminthosporium)小种特异性的研究开 始弄清楚了 DK888上的抗性基因座(命名为qNLB8.06DK888)与Ht2和Htnl基因紧密连锁或者功 能上连锁，因为长蠕孢属菌株23和23N是有毒性的（Chung等，2008)。然而，在缺乏来自大斑 病长蠕孢的纯N分离株时，对Htnl存在的阳性检测未能实现。另外，具有qNLB8.06DK888的抗性 表现型也并未与预期的表现型（褪绿病斑的出现和病斑形成的延迟)对应。Chung等（2010) 中进一步的详细补充研究最终显示出，qNLB8.06 DK888与Ht2相同、是等位基因、紧密连锁、或 者功能上连锁，而不是Htnl。所述抗性基因座qNLB8.06 DK888可以被分配至0.46Mb的染色体片 段。对此染色体片段的基因组标注提示有12个推定的开放阅读框，其中的三个可能分别是 串联蛋白激酶样基因（GRMZM2G135202;GRMZM2G164612)或者蛋白磷酸酶样基因 (GRMZM2G119720)，并且每个均同样地构成了抗性基因 Ht2的有希望的候选基因（Chung等， 2010)。并未描述功能性的验证。
[0010] 另外，WO 2011/163590A1还将抗性来源PH99N中假定的Htnl基因标注为串联蛋白 激酶样基因(GRMZM2G451147)并公开了其基因序列，但是也并未确定其功能(例如在转基因 玉米植物中）。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明源于上文所述的现有技术;本发明的目标是提供这样的玉米植物，其呈现 出来自供体P e p i t i 11 a的对大斑病长懦孢的抗性，并且其中已知玉米植物的农学特征可以 与来自供体Pep i t i I Ia的抗性叠加。
[0013] 该目标一方面通过提供这样的玉米植物来实现，其基因组中已整合了来自供体 Pepitilla的染色片段，其中所述染色体片段包含所述供体的区间（下文称作第一区间或者 区间1)，所述区间呈现依照表2的单倍型(haplotype)的供体等位基因以及在所述玉米植物 中赋予对大斑病长蠕孢抗性的多核苷酸，并且其中所述染色体片段在第一标记区(Ml)(其 旁侧为标记SYN14136和PZE-108076510)中的标记与第二标记区（M2)(其旁侧为标记 SYN24931和PZE-108077560)中的标记之间不含有所述供体的另外的区间（下文称作第二区 间或区间2)。对于该问题的这些以及其它的解决方案（下文中所述），其可以是基于将来自 Pepitilla的Htnl基因座整合至玉米品系中的育种程序。然而，也可以选择遗传工程方法， 通过该方法可以产生依照本发明的植物。遗传工程策略的实例在下文中有更详细的描述。 为了产生本发明的植物，可以使用来自现有技术的各种基因型。特别是将B37HTN1用作原始 品系，其包含来自地方品种"Pepi t i I la"的抗性基因座。除了 Pepi t i I Ia本身以及B37HTN1 (在现有技术中也称为B37HtN)之外，几乎任何的玉米基因型均可以用于整合所述Htnl基因 座，以便产生本发明的玉米植物(在其基因组中，特别是在染色体Sbin 5或6上，插入了来自 Pepitilla的Htnl抗性基因座的渐渗）。在此方面，许多基因型的实例是现有技术中已知的， 例如：W22Htn(如Bar-Zur等，1998) ;H6314Htn(如Bar-Zur等，1998)、B73HtN(e · g. Shimoni 等，Journal of Phytopathology 131:4(1991),315-321)、B68HtN和A632HtN(如Carson, Plant Disease 79(1995) ,717-720)和A619HtN(如St:antovi:(5等，Genetika 39:2(2007)， 227-240)。在本发明的玉米植物中，所述染色体片段源自供体Pepi ti I la;在本发明的玉米 植物优选的实施方案中，所述染色体片段源自供体B37HTN1或者源自上文引用的另外的玉 米基因型。作为实例，B37HTN1可以使用存货ID 65749而从Maize Genetics COOP Stock Center 订购。
[0014] 整合至本发明玉米植物的基因组的所述染色体片段源自供体Pepitilla，其已知 包含抗性基因座HTNl。此抗性基因座的渐渗位于染色体8的长臂(bin8.05-8.06)。所整合的 染色体片段包含供体的第一区间，其包含在本发明的玉米植物中赋予针对大斑病长蠕孢抗 性的多核苷酸。在此方面，所述多核苷酸包含来自Pepitilla的HTNl基因座的一个或多个抗 性赋予基因（表1)或者其等位基因。在大斑病长蠕孢侵袭的情况下，所述基因或等位基因可 以产生具有HTNl典型特征的抗性表现型。优选地，所述多核苷酸包含HTNl基因座(优选来自 Pepitilla)的一个或多个抗性赋予基因，选自RLKl和EXT1(参见表1)或者其等位基因，其在 大斑病长蠕孢侵袭的情况下产生具有HTNl典型特征的抗性表现型。特别优选地，所述多核 苷酸包含核苷酸序列，其编码依照SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:6的多肽或者依照SEQ ID NO: 2或SEQ ID N0:6的多肽的同源物，其在大斑病长蠕孢侵袭的情况下产生具有HTNl典型特征 的抗性表现型。这些HTNl典型特征的实例有孢子形成的延迟发生、减少的病斑发展、发展更 小的病斑、缩小的孢子形成区域和/或没有或者仅有分离的褪绿坏死病斑。结构上来说，所 述多核苷酸特征在于其包含这样的核酸分子：（a)所述核酸分子包含依照SEQ ID NO: 1、3、 5、7、9、ll、13或15的核苷酸序列；（b)所述核酸分子包含与依照SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、 13 或 15 的核苷酸序列之一具有至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%的相同性的核苷酸序列，优选在该序列的全长上具有至少80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 的相同性；（c)所述核酸分子在 严格条件下与依照(a)或(b)的核酸分子的互补链杂交；（d)所述核酸分子编码多肽，该多肽 具有依照SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列；（e)所述核酸分子编码具有这 样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与依照(d)的氨基酸序列之一具有至少80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性;或者（〇所述核酸分 子包含依照(a)至(e)的核酸的部分序列。在优选的实施方案中，所述多核苷酸特征在于其 包含这样的核酸分子：（aa)所述核酸分子包含依照SEQ ID NO: 1或5的核苷酸序列；（bb)所 述核酸分子包含与依照SEQ ID NO: 1或5的核苷酸序列之一具有至少80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性的核苷酸序列，优选在该序 列的全长上具有至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%的相同性；（cc)所述核酸分子在严格条件下与依照(aa)或(bb)的核酸分子的互补链杂 交；（dd)所述核酸分子编码多肽，该多肽具有依照SEQ ID N0:2或6的氨基酸序列；（ee)所述 核酸分子编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与依照(dd)的氨基酸序列之一 具有至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性； 或者(ff)所述核酸分子包含依照(aa)至(ee)的核酸的部分序列。如本发明中所用的表述 "核酸分子的部分序列"可以是至少20、30、40、50、60、70、80、90或者至少100个连续核苷酸， 另外至少 150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸。所 述多核苷酸在本发明的玉米植物中可以是杂合的或者纯合的状态;优选地，所述多核苷酸 是纯合状态。
[0015] 表1:来自Pepitilla的HTNl基因座的潜在抗性赋予基因；基因名称(第1列）；在基 因组外显子序列中的相应SEQ ID No编号(第2列）；在推测的氨基酸/蛋白序列中的相应SEQ ID No编号(第3列）；从来自B73的参照基因组中标注的同源基因（第4列）。
[0017]另外，呈现出依照表2中单倍型的供体等位基因的染色体片段中的第一区间特征 在于表2的单倍型中的供体等位基因的序列，但是却并不局限于依照表2的供体等位基因的 此序列。这意味着第一区间至少呈现出描述了表1的抗性赋予基因的供体等位基因，任选地 伴随标记MA0008的供体等位基因。另外，第一区间优选呈现出至少依照表2的单倍型的供体 等位基因，从MA0021至MA0022(也即MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、 MA0012、MA0022)或者从 MA0005 至 MA0022(也即 MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、 1^0010、]\^0011、]\^0012和]\^0022)或者从1^0005至]\^0013(也即]\^0005、]\^0021、]\^0007、 1^0008、]\^0009、]\^0010、]\^0011、]\^0012、]\^0022和]\^0013)或者从1^0005至]\^0014(也即 MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013和 MA0014)或者从 MA0005 至 MA0015(也即 MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、 MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014 和 MA0015)或者从 MA0005 至 MA0016(也即 MA0005、 MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015 和MA0016)，特别优选的是从MA0005至MA0017(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、 MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016和MA0017)、 MA0005 至 MA0018(也即 MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、 MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017和MA0018)、MA0005至PZE-108095998(也即 MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、 MA0015、MA0016、MA0017、MA0018和PZE-108095998)、MA0005至PZE-108096011(也即MA0005、 MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、 MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998 和 PZE-108096011)或者 MA0005 至 MA0019(也即 MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、 MA0015、MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998、PZE-108096011和MA0019)，更特别优选的 是从 MA0005至 PZE-108096610(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、 MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998、 PZE-108096011、MA0019 和 PZE-108096610)、MA0005 至 MA0020(也即MA0005、MA0021、MA0007、 MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、 MA0018、PZE-108095998、PZE-108096011、MA0019、PZE-108096610和MA0020)、MA0005至PZE-108096791 (也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、 MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998、PZE-108096011、MA0019、 PZE-108096610、MA0020和 PZE-108096791)或者 MA0005至 MA0006(也即MA0005、MA0021、 MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、 MA0017、MA0018、PZE-108095998、PZE-108096011、MA0019、PZE-108096610、MA0020、PZE-108096791和MA0006)。此抗性单倍型明确地指明和鉴别抗性来源Pepitilla。具体而言，第 一区间位于标记MA0004和PZE-108097482之间、标记MA0004和MA0022之间、标记MA0005和 PZE-108097482之间、或者标记MA0005和MA0022之间。优选地，第一区间描述了这样的染色 体片段的区段，其可以赋予HTNl典型的抗性。因而其是上文所述多核苷酸的载体。
[0018] 表2:来自B37HTN1的抗性单倍型；
[0020]另外，每个本发明的玉米植物均为HT抗性玉米植物。由所述染色体片段的整合所 赋予的HT抗性，可以通过在依照表3和实施例1.A)中方案的表现型分型实验中确定分类评 分来进行定量;其中，所述抗性的水平从1降低至9。本发明的HT抗性玉米植物呈现出对大斑 病长蠕孢的提高至少1个分类评分，优选至少2个分类评分或者至少3个分类评分，以及特别 优选至少4个分类评分的抗性。优选地，本发明的玉米植物呈现出针对至少一种大斑病长蠕 孢小种的抗性，不对应于现有技术中已知的小种特异性。在特别优选的实施方案中，本发明 的玉米植物对所有已知的大斑病长蠕孢小种具有抗性，也即所赋予的抗性不是小种特异性 的并且可在形成对大斑病长蠕孢的广谱抗性方面是特备有利的。
[0021 ]表3:在各种地点的田间试验中对表现型分型实验的分类评分方案，其中使用天然 和人工大斑病长懦孢接种（来自〇61^8(：116|^1丨81^0111；^6 6(011(，德国玉米委员会）；46品种 27.02.02；(DMK J.Rath；RP Freiburg H.J.Imgraben)
LUUD」 本说明节通]Q：提供早借型、通]Q：足位王妥的称记、以及边通]Q：签別赋于针对柄原 体大斑病长蠕孢的抗性的候选基因，公开了HTNl基因座的遗传和分子结构。
[0024]出乎意料地，在田间和在温室进行的表现型分型试验证明了本发明的玉米植物是 符合农学的。这是因为，通过整合来自Pepitilla以及来自现有技术的经转化的品系如 B37HTN1的HTNl基因座的育种程序而得到的其它经转化的品系，除了在非大斑病长蠕孢侵 袭条件下和在相当的环境条件下(温度、营养供应、地点等)所赋予的HT抗性之外，与没有渐 渗的对应品系相比（例如等基因品系或原始品系)呈现出雄性和/或雌性开花时间的显著延 迟，但是在本发明的玉米植物中，开花时间与相当的等基因玉米植物(其基因组中没有整合 来自供体Pepitilla的染色体片段)相对应。所述"开花时间"在其彼此差异少于两天时是对 应的。此种情况中所观察到的延迟的幅度强烈取决于玉米的小种或者玉米的基因型、占优 势的环境条件如土壤条件、湿度、降雨、温度等和/或生物胁迫如大斑病长蠕孢之外的病原 体侵袭。所述延迟为至少2天、至少3天、至少5天、或至少7天。在开花时间上的这种差异是由 于作为渐渗一部分的连锁累赘，这特别出乎意料因为此种类型的观察在现有技术中是未知 的。开花时间是重要的农学特征。其可以直接并且实质上地影响玉米植物的产量潜力。延迟 的开花时间常常会导致产量降低。
[0025]为了弄清楚此种不利的遗传学成因并鉴别连锁累赘，例如，进行了广泛的回交程 序并伴有进行基因型分型和表现型分型。在携有HTNl的染色体片段上特异性标记的密集开 发支持了此工作。标记辅助筛选(MAS)以及进行聚焦回交程序(例如"图位克隆"）的技术可 以在现有技术中找到（Gupta