本发明涉及发酵饮料领域，具体地涉及一种常温保存的高活性益生菌发酵植物饮料及其制备方法。
背景技术：
近年来，活性乳酸菌饮料以其独特的口感和活菌带来的营养保健功效受到越来越多消费者的喜爱，现市售的活性乳酸菌饮料一般都采用4℃冷链运输和保存，保质期21～30天不等，保质期内的活菌数在1×106CFU/g左右。然而，由于这种冷链饮料保质期短，对运输过程和售卖场所要求高，消费者购买后也不方便储存，促使部分常温保存的乳酸菌饮料也正在成为市场热销品类。这些常温乳酸菌饮料同样宣传“有助消化、促进吸收”，殊不知，为了满足常温保存的条件以及延长产品保质期，常温乳酸菌饮料在发酵完成后几乎都经过了高温杀菌过程才最终上市，也就是说，其中根本就不含有活菌。北京商报联合北京两家权威检测机构选取市面上铺货率较高的常温乳酸菌产品与低温乳酸菌产品进行对比发现，常温乳酸菌产品中并不含活菌(张茜凤，阿茹汗.常温乳酸菌一个活菌都没有.北京商报,2005.3.15特刊)。所以说，目前市场上的非活菌常温乳酸菌饮料与真正的活性乳酸菌饮料相比，其作用机理大有区别：活性乳酸菌饮料通过活菌在人体内迅速定植，起到有效抑制致病菌、保护肠胃的作用，而灭菌的常温乳酸菌饮料对于肠道的作用并非来自活菌，虽然该类产品在生产中因采用发酵技术而产生了活性成分，但可以肯定的是，其作用要远远低于活性菌群。
出现上述“要活菌就必须冷藏，要常温则必须灭菌”这一发酵饮料开发的两难局面，最主要的技术问题是：一旦环境温度升高，活菌体就会继续生长繁殖，发酵利用产品中的营养物质并产酸，使pH值下降，导致产品风味改变的同时菌体也会出现自溶现象而衰亡，因而很难保证在常温下产品风味与活菌数的稳定。为解决这一问题，凌海波等人曾通过采用一株特别的、不能利用乳糖的鼠李糖乳杆菌ATCC53103进行发酵，制备得到可常温保存的含活菌的发酵乳(CN 200710111236 B，一种在常温下保持高活菌数的发酵乳的制备方法)。
虽然传统益生菌发酵饮料都是以乳制品的形式存在的，但近年来，素食在世界范围内越来越流行，加上很多国家和地区都有不同比例的乳糖不耐症患者，发展不含乳的植物性益生菌发酵饮料成为新的研究热点。果汁、豆芽、椰子等植物原料除了本身含有很多营养素，且不含乳过敏原外，其外观及口味也很受欢迎。因此，开发常温活菌的益生菌发酵植物饮料，创造出集果蔬的营养价值和益生菌的保健功能于一体的新型发酵饮料，不仅可以提高农产品加工的附加值，还丰富了益生菌产品的种类，符合食品健康天然的发展趋势。但在制备植物性发酵饮料时，凌海波等人提供的技术并不适用，因为植物来源的原料中本就不含有乳糖，而是以果糖、葡萄糖、蔗糖为主，也有一些低聚糖，所以通过选用不利用乳糖的菌种来控制后酸化在植物来源饮料发酵过程中是不可行的。
有研究认为，某种营养物的缺乏或某种特定发酵产物的累积(如乳酸)都会抑制指数期细胞的增殖，从而使细胞进入平台期。热、冷、渗透压及氧化还原压力也都可能会导致细菌繁殖进入平台期(Maria De Angelis,Marco Gobbetti.Environmental stress responses in Lactobacillus:A review.Proteomics.2004(4):106-122)。
益生菌发酵过程产生乳酸，乳酸的累积导致pH下降，低pH也会促使细菌繁殖进入到平台期，停止生长。在常温保存活菌发酵饮料开发中，这会导致两个问题：1.底物营养过多时，如果pH值未低至足够使细菌进入平台期时即终止其发酵，而底物营养又未耗尽的话，那么产品只能低温保存，一旦运输或保存时温度升高，菌体会继续利用这些营养物质生长产酸，pH值继续降低，导致风味的改变和加速菌体衰亡；2.底物营养过少时，菌体少量增殖后即因营养不足进入平台期，那么益生菌增殖量过低，导致产品的起始活菌数很低，更加难以保证保质期内的活菌数。
因此，本领域的技术人员致力于找到一种平衡，保证发酵过程中菌体充分繁殖的基础上，使其在达到平台期时碳源耗尽，抑制其后酸化，同时菌体由于碳饥饿进入压力应激状态，提高其稳定性，从而开发一种可在常温保存并具有高活性益生菌的植物发酵饮料及其制备方法，解决活菌发酵植物饮料在常温下后酸化严重及活菌衰亡，导致发酵植物饮料只能灭菌后常温保存或活菌冷藏保存的技术难题。
技术实现要素：
有鉴于现有技术中活菌发酵饮料在常温下后酸化严重及活菌衰亡度高的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供能够在常温中保存较长时间，且保持较高的活菌量的植物发酵饮料。
为实现上述目的，本发明提供了一种益生菌发酵植物饮料，在本发明的较佳实施方式中，该饮料的原料包括：植物性原料、增殖因子和益生菌，其中，益生菌对植物性原料进行发酵后达到碳源耗尽的状态，进入压力应激状态，抑制后酸化和该益生菌的菌体死亡。其中，植物性原料为来自植物比如水果和蔬菜的原料。
进一步地，该植物性原料的质量百分比为10～20％。
进一步地，该增殖因子的质量百分比为0.5～10％。
优选地，上述植物性原料为果蔬浓缩浆、果蔬浓缩汁、椰子粉、麦精、豆芽提取物和豆浆粉中的一种或多种；上述增殖因子为酵母膏、吐温、葡萄糖、蔗糖和低聚糖中的一种或多种。
优选地，上述低聚糖为低聚异麦芽糖、低聚果糖和低聚木糖等低聚糖中的一种或几种。
进一步地，上述饮料的原料还包括：甜味剂、调味剂和稳定剂中的一种或多种。
优选地，甜味剂为阿斯巴甜、安赛蜜(AK糖)、甜蜜素(环己基氨基磺胺酸钠)、甜菊糖苷和罗汉果苷中的一种或多种，其添加量为0.01-2g/L；调味剂可选用各种风味香精，其添加量为0.01-1g/L；稳定剂为琼脂、果胶、明胶、变性淀粉及羧甲基纤维素钠中的一种或多种，其添加量为0.1-4g/L。
优选地，上述益生菌为益生菌菌粉，益生菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP-ONLLY、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA11-ONLLY、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LE16、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC18、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LPC28、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)LR22、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF33、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)LH10、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BA77、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)BI516、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)BB8和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST6中的一株或多株的复合。
优选地，还可以添加抗氧化物质，如氧杂蒽酮、SOD、茶多酚和虾青素中的一种或多种。
本发明的另一方提供了一种上述益生菌发酵植物饮料的制备方法，在本发明的较佳实施方式中，包括以下步骤：
1)称取原料，搅拌后进行均质，随后灭菌并冷却；
2)在步骤1)获得灭菌后的原料中添加益生菌进行发酵；
3)将步骤2)中的发酵物冷却，然后灌装，常温保存。
进一步地，步骤2)中添加的益生菌为益生菌粉，所述益生菌粉的添加比例为2.0×105CFU/g～1.0×108CFU/g。
进一步地，步骤2)中的发酵完成时，益生菌的活菌数达到1.0×108CFU/g～3.0×109CFU/g。
进一步地，步骤2)中发酵的发酵终点控制在pH值为2.8～4.6。
进一步地，步骤2)中发酵的发酵温度为36～42℃，发酵时间为12～48小时。
优选地，在步骤1)称取原料后并搅拌后，再添加抗氧化物质氧杂蒽酮、SOD、茶多酚和虾青素。
本发明采用一株或多株高稳定性的益生菌株作为发酵菌，产品配方由一种或多种植物性来源的组分即植物性原料组成，配以酵母膏、吐温、葡萄糖、蔗糖及低聚糖等增殖因子，通过控制植物性原料和增殖因子的添加比例，使发酵达到终点时，发酵底物达到营养耗尽的碳饥饿状态，保证产品即使在常温保存时，菌体也处于半休眠状态，抑制后酸化发酵，保持产品风味和活菌稳定。
其中，碳饥饿会导致细胞生长能量缺乏，在这种压力下刺激细胞表达产生大量调节子与应激蛋白，此时的细胞进入压力应激状态，对外界压力(如酸性、高温)的耐受性都会增强。
用于发酵的一株或多株益生菌的起始总添加量为2.0×105CFU/g～1.0×108CFU/g，发酵完成时益生菌活菌数为1.0×108CFU/g～3.0×109CFU/g，在常温下货架期可达到1～12个月，保质期内产品活菌数大于1.0×106CFU/g。
依照本发明所述方法制备出的发酵饮料具有以下优点：
1.配方为纯植物来源，不含乳过敏原；
2.可常温保存，且具有高活性菌稳定性，产品发酵完成后，益生菌活菌数达到1.0×108CFU/g～3.0×109CFU/g，根据配方不同在常温下保存1～12个月，保质期内活菌数不低于1.0×106CFU/g，且保质期内产品pH值下降不超过0.5。
以下将对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
具体实施方式
本发明中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP-ONLLY，保藏编号为CGMCC NO.1258；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA11-ONLLY，其保藏编号为CGMCC NO.2106；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LE16，其保藏编号为CGMCC NO.6405；上述三个菌株已经在中国专利申请中有公开。本发明中的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC18，保藏编号为CNCM I-4458，于2011年3月28日保藏于法国微生物菌种保藏中心；副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LPC28，保藏编号为CNCM I-4475，于2011年4月26日保藏于法国微生物菌种保藏中心；鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)LR22，保藏编号为CNCM I-4474，于2011年4月26日保藏于法国微生物菌种保藏中心；发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF33，保藏编号分别为CGMCC NO.6407，于2012年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)LH10，保藏编号为CGMCC NO.6404，于2012年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BA77，保藏编号为CGMCC NO.10757，于2015年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)BI516，其保藏编号为CGMCC NO.11959，于2016年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)BB8，保藏编号为CGMCC NO.6402，于2012年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST6，保藏编号为CGMCC NO.10755，于2015年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明中的常温，即本领域中常规意义的常温，即在储存、运输、销售环节不控制温度条件。在实验时，本领域一般以25℃作为常温。
本发明中，高稳定性的益生菌是指菌株经高密度发酵、冻干后活菌数可达到1.0×1011CFU/g，且常温保存12个月其活菌数下跌不超过一个数量级。
实施例1植物乳杆菌发酵豆芽提取物活菌饮料的制备及其常温储存实验
原料组成(重量百分比)为：黄豆芽提取物15％，葡萄糖0.5％，酵母膏0.2％，明胶0.2％，吐温0.1％，甜菊糖苷0.002％，余量为水，按比例称取适量以上组分，搅拌均匀，均质后于121℃灭菌15min，冷却至37℃后待用。
植物乳杆菌LP-ONLLY，经发酵扩增、离心、冷冻干燥后制成植物乳杆菌LP-ONLLY菌粉。适用发酵饮料制备的植物乳杆菌LP-ONLLY菌粉，活菌数须大于1.0×1011CFU/g。
按1.0×106CFU/g的接种量在无菌条件下向冷却后待发酵的配方中加入植物乳杆菌LP-ONLLY菌粉，37℃发酵16小时，至pH4.6左右，冷却至25℃。将冷却后的发酵饮料无菌灌装至包装容器，放置于常温下保存。
该发酵植物饮料，产品呈均匀的浅黄色，有少许菌体悬浮或沉淀，口感酸甜，有独特的豆芽香味，pH值为4.62，其中植物乳杆菌活菌含量1.16×109CFU/g。在25℃条件下进行保存实验12个月后，活菌含量为1.2×107CFU/g，pH值为4.21，pH值仅下降了0.41。25℃条件下保存12个月的活菌数及pH值变化情况见表1。
表1植物乳杆菌发酵豆芽提取物活菌饮料常温储存稳定性
实施例2三株乳杆菌复合发酵麦精活菌饮料的制备及其常温储存实验
原料组成(重量百分比)为：麦精10％，黄豆芽提取物5％，低聚异麦芽糖5％，琼脂0.4％，酵母膏0.2％，吐温0.1％，罗汉果苷0.002％，余量为水，按比例称取适量以上组分，搅拌均匀，均质后于121℃灭菌15min，冷却至37℃后待用；
三株乳杆菌：植物乳杆菌LP-ONLLY、嗜酸乳杆菌LA11-ONLLY和干酪乳杆菌LC18，分别经发酵扩增、离心、冷冻干燥后制成活菌粉。适用发酵饮料制备的益生菌活菌粉，活菌数须大于1.0×1011CFU/g。
分别按1.0×106CFU/g的添加量向冷却后待发酵的配方中加入三种菌粉，总接种量为3.0×106CFU/g，37℃发酵12小时至pH4.0左右，冷却至25℃。将冷却后的发酵饮料灌装至包装容器，放置于常温下保存。
该发酵植物饮料，产品呈均匀的浅黄色，有少许菌体悬浮或沉淀，口感略酸，有独特的麦香味与豆芽香味，pH值为4.01，其中总活菌含量2.85×109CFU/g。在25℃条件下进行保存实验12个月后，活菌含量为1.91×107CFU/g，pH值为3.80，pH值仅下降了0.21。25℃条件下保存12个月的活菌数及pH值变化情况见表2。
表2三株乳杆菌复合发酵麦精活菌饮料常温储存稳定性
实施例3五株益生菌复合发酵果蔬汁活菌饮料的制备及其常温储存实验
原料组成(重量百分比)为：胡萝卜浓缩浆7％，草莓浓缩浆5％，苹果浓缩汁2％，蔗糖1％，羧甲基纤维素钠0.1％，罗汉果苷0.002％，余量为水，按比例称取适量以上组分，搅拌均匀，均质后于121℃灭菌15min，冷却至37℃后待用。
五株益生菌：植物乳杆菌LP-ONLLY、发酵乳杆菌LF33、副干酪乳杆菌LPC28、瑞士乳杆菌LH10、乳双歧杆菌BI516，分别经发酵扩增、离心、冷冻干燥后制成活菌粉。适用发酵饮料制备的益生菌活菌粉，活菌数须大于1.0×1011CFU/g。
按2.0×106CFU/g的接种量向冷却后待发酵的配方中分别加入五种益生菌活菌粉，总接种量为1.0×107CFU/g，37℃发酵36小时至pH2.8左右，冷却至25℃。将冷却后的发酵饮料灌装至包装容器，放置于常温下保存。
该发酵果蔬汁活菌饮料，产品呈胡萝卜黄色，有果蔬纤维和菌体悬浮或沉淀，口感酸甜，有独特果蔬香气，pH值为2.80，其中植物乳杆菌活菌含量2.25×108CFU/g。在25℃条件下进行保存实验1个月后，活菌含量为1.53×106CFU/g，pH值为2.72，pH值仅下降了0.08。25℃条件下保存1个月的活菌数及pH值变化情况见表3。
表3五株益生菌复合果蔬汁活菌饮料常温储存稳定性
由于本实施例中采用的植物性原料中含有果汁成分，其pH值相较于其他的植物性原料更低，因此，发酵后的活菌含量也会较其他植物性原材料的低一些。本实施例中，以产品最终活菌含量为1.0×106CFU/g作为判断保质期的标准，产品在25℃条件储存一个月时，能保持活菌含量为1.53×106CFU/g。
本实施例的产品常温储存一个月，其活菌稳定性和活菌含量，仍明显超过市场上的同等产品在冷藏条件下达到的活菌稳定性和活菌含量。
实施例4两株益生菌复合发酵植物蛋白活菌饮料的制备及其常温储存实验
原料组成(重量百分比)为：豆浆粉10％，麦精5％，葡萄糖6％，酵母膏0.2％，羧甲基纤维素钠0.1％，余量为水，按比例称取适量以上组分，搅拌均匀，均质后于121℃灭菌15min，冷却至37℃后待用；
两株益生菌：植物乳杆菌LP-ONLLY和嗜热链球菌ST6，分别经发酵扩增、离心、冷冻干燥后制成植物乳杆菌LP-ONLLY菌粉。适用发酵饮料制备的益生菌活菌粉，活菌数须大于1.0×1011CFU/g。
分别按1.0×106CFU/ml的接种量向冷却后待发酵的配方中加入两种菌粉，总接种量为2.0×106CFU/ml，37℃发酵18小时至pH4.4左右，冷却至25℃。将冷却后的发酵饮料灌装至包装容器，放置于常温下保存。
该发酵植物蛋白饮料，产品呈均匀的浅黄色，口感爽滑，pH值为4.41，其中活菌含量1.58×109CFU/g。在25℃条件下进行保存实验3个月后，活菌含量为2.6×107CFU/g，pH值为4.05，pH值仅下降了0.36。25℃条件下保存3个月的活菌数及pH值变化情况见表4。
表4两株益生菌复合发酵植物蛋白活菌饮料常温储存稳定性
本实施例中，由于采用的植物性原料为植物蛋白，即豆浆粉，由于蛋白质类饮料存放时间太长其蛋白本身会氧化变质，因此保质期不能更长。从本实施例中可以看出，在25℃条件下进行保存实验3个月后，活菌含量仍然很高。
实施例5八株益生菌复合发酵椰子粉活菌饮料的制备及其常温储存实验
原料组成(重量百分比)为：椰子粉15％，蔗糖6％，麦精3％，低聚异麦芽糖2％，酵母膏0.2％，琼脂0.1％，余量为水，按比例称取适量以上组分，搅拌均匀，均质后于121℃灭菌15min，冷却至37℃后待用；
八株益生菌：植物乳杆菌LP-ONLLY、发酵乳杆菌LF33、嗜酸乳杆菌LA11-ONLLY、罗伊氏乳杆菌LE16、瑞士乳杆菌LH10、动物双歧杆菌BA77、短双歧杆菌BB8和嗜热链球菌ST6，分别经发酵扩增、离心、冷冻干燥后制成植物乳杆菌LP-ONLLY菌粉。适用发酵饮料制备的益生菌活菌粉，活菌数须大于1.0×1011CFU/g。
分别按1.0×106CFU/ml的接种量向冷却后待发酵的配方中加入两种菌粉，总接种量为8.0×106CFU/ml，37℃发酵48小时至pH4.2后，冷却至25℃。将冷却后的发酵饮料灌装至包装容器，放置于常温下保存。
该发酵椰子粉饮料，产品呈均匀的淡黄色，口感爽滑，有椰香味，pH值为4.20，其中活菌含量1.06×109CFU/g。在25℃条件下进行保存实验3个月后，活菌含量为3.8×106CFU/g，pH值为3.80，pH值仅下降了0.40。25℃条件下保存3个月的活菌数及pH值变化情况见表5。
表5两株益生菌复合发酵植物蛋白活菌饮料常温储存稳定性
实施例6三株乳杆菌复合发酵麦精活菌饮料的制备
原料组成(重量百分比)为：麦精10％，黄豆芽提取物5％，低聚异麦芽糖5％，琼脂0.4％，酵母膏0.2％，吐温0.1％，罗汉果苷0.002％，余量为水。按比例称取适量以上组分，搅拌均匀。之后，再添加氧杂蒽酮0.001％，SOD超氧化物歧化酶10000U，茶多酚0.01％和虾青素0.1％，再次搅拌均匀后，进行均质，并于121℃灭菌15min，冷却至37℃后待用；
三株乳杆菌：植物乳杆菌LP-ONLLY、嗜酸乳杆菌LA11-ONLLY和干酪乳杆菌LC18，分别经发酵扩增、离心、冷冻干燥后制成活菌粉。适用发酵饮料制备的益生菌活菌粉，活菌数须大于1.0×1011CFU/g。
分别按1.0×106CFU/g的添加量向冷却后待发酵的配方中加入三种菌粉，总接种量为3.0×106CFU/g，37℃发酵12小时至pH4.0左右，冷却至25℃。将冷却后的发酵饮料灌装至包装容器，放置于常温下保存。
该发酵植物饮料，产品呈均匀的浅黄色，有少许菌体悬浮或沉淀，口感略酸，有独特的麦香味与豆芽香味，pH值为4.03，其中总活菌含量2.93×109CFU/g。在25℃条件下进行保存实验12个月后，活菌含量为1.37×107CFU/g，pH值为3.79。
其中，氧杂蒽酮可以直接购买获得，也可以从山竹皮中制备获得。若是从山竹皮中制备，则将山竹皮加水打碎，然后通过低温蒸馏的方法，获得蒸馏液，将该蒸馏液冷冻干燥，即可获得含有氧杂蒽酮粉末。该含有氧杂蒽酮粉末的添加量为0.01-0.1％。
本实施例的产品由于添加了多种抗氧化物质，即氧杂蒽酮、SOD、茶多酚和虾青素，因此，除了益生菌发酵饮品的保健功能之外，还具有抗氧化和抗疲劳作用。并且，添加的抗氧化成分如SOD等，会促进菌体发酵，产生较好的协同作用。
对比例
市售乳酸菌饮品，其保质期在冷藏条件下(4～10℃)为28天。其原料组成为：脱脂奶粉，葡萄糖，白砂糖，果胶，柠檬酸钠，以水补充至100％。该饮品采用一株菌发酵：干酪乳杆菌。
新鲜生产的产品，经检测，活菌含量为2.0×108CFU/g，pH值为4.48。在25℃条件下进行保存一个月后，pH降为3.52，下降0.96，产品后酸化严重，风味改变；25℃条件下保存20天后，活菌含量降为8.0×105CFU/g，保存30天后活菌数为仅为9.2×104CFU/g。
25℃条件下保存30天后的活菌数及pH值变化情况见表6。
表6市售冷链干酪乳杆菌发酵饮料25℃保存实验
由此可见，现有技术中的益生菌发酵饮品，由于没有对原料配比进行控制，因此发酵后不能达到碳源耗尽的状态，不能引起菌株的压力应激状态，因此，会产生严重的后酸化，并且，常温保存后，菌株的死亡度较高。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。