一种新鲜毛竹笋中提取蛋白的方法与流程

本发明涉及一种新鲜毛竹笋中提取蛋白的方法，属于天然蛋白提取技术领域。

背景技术：

毛竹是禾本科竹亚科刚竹属的多年生常绿植物，具有生长快、分布范围广、产量高，并产出两个主产品--竹材和竹笋等特点。根据第八次森林资源清查结果，我国现有竹林面积601万公顷，其中毛竹林面积443万公顷，占竹林总面积的三分之二以上，其中毛竹笋的产量约占全国笋总产量的90％以上。素有“寒土山珍”之称的毛竹笋是竹膨大的芽和幼嫩的茎，富含蛋白、膳食纤维，低脂肪，营养齐全。然而，现有竹笋的食用和消费主要以新鲜竹笋、发酵竹笋、水煮笋和笋干等有形产品为主，严重限制了竹笋在食品工业中的应用范围。

技术实现要素：

为了解决竹笋产品单一、应用范围局限的缺陷，本发明提供一种新鲜毛竹笋中提取蛋白的方法，使有形的竹笋变成无形的竹笋蛋白粉和膳食纤维粉。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种新鲜毛竹笋中提取蛋白的方法，以新鲜毛竹笋为原料，依次经过五步低温提取方法，分别得到第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白；第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白中含有相同的19种氨基酸，19种氨基酸分别为天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、γ-氨基正丁酸和鸟氨酸。

本申请的新鲜毛竹笋指采摘后0-2天以内的毛竹笋，或采摘后0-30天内保存在-10℃以下的毛竹笋；上述低温指小于40℃。

本申请采用的提取方法，得到了五种蛋白，且保持了蛋白的原始风味，五种蛋白均含有8种人体必需的氨基酸，且含量较高，为功能食品提供了理想的蛋白质原料，显著拓宽了竹笋的应用范围。

上述各蛋白的中氨基酸采用全自动氨基酸分析仪进行分析。

作为本申请的进一步改进，第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白中19种氨基酸的质量含量分别为50-70％、8-14％、5-12％、8-15％、2-6％，进一步优选为68.33％、12.74％、8.72％、14.59％和3.64％。

19种氨基酸中，其中8种为人体必需氨基酸，分别为苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸；第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白中8种人体必需氨基酸的质量含量分别为20-35％、2-6％、1-4％、2-5％、0.1-0.6％，进一步优选为27.01％、3.27％、2.04％、3.68％和0.53％。

上述第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白中8种人体必需氨基酸占总氨基酸的质量比分别优选为39.53％、25.67％、23.39％、25.22％和14.56％。

上述第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白中8种人体必需氨基酸含量丰富，营养价值高，是功能食品中较好的蛋白质原料。

为了进一步保证所得蛋白的质量和得率，上述新鲜毛竹笋中提取蛋白的方法，为将新鲜毛竹笋依次经去皮、洗涤、切片和匀浆粉碎后，再依次通过低温水提、盐提、醇提、碱提1和碱提2，得到了第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白。

申请人经研究发现，毛竹笋的营养成分主要有蛋白质、碳水化合物、矿物质和膳食纤维等，其中蛋白的含量较多，是一种较好的天然功能性食品。为了将有形竹笋转变成高附加值的无形食品，本发明以新鲜毛竹笋为原料，依次通过低温水提、盐提、醇提和碱提，并采用低温沉淀离心、透析(或超滤)和冷冻干燥法，分别得到了第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白等5种蛋白。然后，进一步分析了这5种蛋白的氨基酸组成，均含有8种人体必需的氨基酸，其中第一蛋白中必须氨基酸占总氨基酸的最高，为优质蛋白。该提取工艺采用低温提取和冷冻干燥法，保留了蛋白的原始风味与营养，为功能食品领域提供了一种较好的蛋白质原料。

为了进一步保证所得蛋白的质量和得率，上述新鲜毛竹笋中提取蛋白的方法，包括顺序相接的如下步骤：

1)采摘的新鲜毛竹笋经去皮、洗涤、切片，得笋片；

2)将步骤1)所得笋片与去离子水混匀，然后通过匀浆机充分粉碎5～10min，得到匀浆液，其中，去离子水的质量用量为笋片质量的2-8倍；

3)将步骤2)所得匀浆液放入胶体磨中充分粉碎10-120min，使最大颗粒尺寸小于500μm，保证粒度可以进高压均质机；

4)将步骤3)所得粉碎浆液的温度调整为15℃以下，然后进行高压均质水提，均质时间为5～30min，然后经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到得到上清液A和残留a；

5)将步骤4)所得上清液A进行40℃以下低温减压蒸馏浓缩，再经透析或超滤、冷冻干燥得到第一蛋白；

6)将NaCl溶液加入到步骤4)所得的残留a中，在5～15℃下搅拌混合均匀，倒入均质机中，进行高压均质盐提，提取时间为5～30min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到上清液B和残留b，其中，NaCl溶液的用量为2-8mL/g笋片；

7)将步骤6)所得上清液B，在40℃以下低温下进行减压蒸馏浓缩，再经透析或超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第二蛋白；

8)将步骤6)所得的残留b与无水乙醇混合，并在5～15℃下搅拌混合均匀，然后在高压均质机中进行醇提5～30min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到上清液C和残留c，其中，无水乙醇的用量为2-8mL/g笋片；

9)将步骤8)所得的上清液C，在低于40℃的低温下，采用减压蒸馏除溶剂得到浓缩液，经透析或超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第三蛋白；

10)将NaOH溶液滴加到步骤8)所得的残留c(含有一定量的去离水)中，在5～15℃下搅拌混合均匀，并使体系的pH为9.0～10.0，然后在高压均质机中进行碱提5～30min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到D和残留d，其中，溶液的用量为2-8mL/g笋片；

11)将步骤10)所得上清液D用HCl溶液调成中性，在40℃以下低温下进行减压蒸馏浓缩，再经透析或超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第四蛋白。

12)将NaOH溶液滴加到步骤10)所得的残留d(含有一定量的去离水)中，在5～15℃下搅拌混合均匀，并使体系的pH为10.0～11.0，然后在高压均质机中进行碱提5～30min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到F和残留f，其中，溶液的用量为2-8mL/g笋片；

13)将步骤12)所得上清液F用HCl溶液调成中性，在40℃以下低温下进行减压蒸馏浓缩，再经透析或超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第五蛋白。

上述残留指离心所得的上层清液之外的部分，也即离心将物料分为上层清液和残留两部分。

为了进一步提高提取物的利用率，上述新鲜毛竹笋中提取蛋白的方法，还包括步骤14)将步骤12)所得的残留f，经过水洗、干燥，制备得到超细竹笋膳食纤维粉。

步骤14)所得的残留f为膳食纤维。

为了进一步保证所得提取物的质量，上述步骤10)和步骤12)中调节pH所用为浓度为0.1～1.0mol/L的NaOH溶液；步骤11)和步骤13)中调节pH所用为浓度为0.1～1.0mol/L的HCl溶液。

为了进一步保证所得提取物的质量和得率，上述步骤6)中NaCl溶液的质量浓度为2～5％。各步骤中高压匀质的压力为300～1000bar。

上述第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白的提取和干燥过程是在40℃以下的低温进行，保留了竹笋蛋白的原始风味。

所述毛竹笋的第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白，采用了低温提取和干燥方法，第一蛋白的提取率最高，蛋白品质较好。

本申请采用低温提取保留了蛋白的原始特性，且人体必需氨基酸含量丰富，是功能食品中较好的蛋白质原料。

本发明未提及的技术均参照现有技术。

本发明新鲜毛竹笋中提取蛋白的方法，采用低温提取的方法，从新鲜竹笋中提取了第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白等五种蛋白，五种蛋白中含有相同的19种氨基酸，19种氨基酸中包含了8种人体所必须的氨基酸，保留了竹笋蛋白的原始特性，蛋白质品质好，营养价值高，是功能食品中理想的蛋白质原料，广泛拓宽了竹笋的应用。

附图说明

图1是本发明新鲜毛竹笋中提取蛋白的工艺路线图。

图2是新鲜毛竹笋中所提取的第一蛋白的扫描电镜图片。

图3是新鲜毛竹笋中所提取的第二蛋白的扫描电镜图片。

图4是新鲜毛竹笋中所提取的第三蛋白的扫描电镜图片。

图5是新鲜毛竹笋中所提取的第五蛋白的扫描电镜图片。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

各例中M为mol/L的意思，实施例中新鲜毛竹笋采集自杭州市余杭区径山镇。

各例中新鲜毛竹笋中提取蛋白的方法，包括顺序相接的如下步骤：

1)采摘的新鲜毛竹笋经去皮、洗涤、切片处理后备用；

2)将90～110g新鲜毛竹笋片和200～800mL去离子水加入到1000mL的烧杯中，然后通过匀浆机充分粉碎5～10min，得到匀浆液；

3)将匀浆液放入胶体磨中充分粉碎10-120min，使最大颗粒尺寸小于500μm，保证粒度可以进均质机；

4)将步骤3)所得粉碎浆液的温度调整为8-15℃，然后进行高压均质水提，均质时间为5～30min，然后经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到得到上清液A和残留a；

5)将步骤4)所得上清液A进行40℃以下低温减压蒸馏浓缩至5～30mL，再经透析或超滤、冷冻干燥得到第一蛋白，其质量为1.10～1.60g；

6)将200～800mL 3％NaCl溶液加入到残留a中，在5～15℃下搅拌混合均匀，倒入均质机中，进行高压均质盐提，提取时间为5～30min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到上清液B和残留b；

7)将步骤6)所得上清液B，在40℃以下低温下进行减压蒸馏浓缩，再经透析或超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第二蛋白，其质量为0.30～0.60g；

8)将200～800mL无水乙醇加入到残留b中，并在5～15℃下搅拌混合均匀，然后在高压均质机中进行醇提5～30min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到上清液C和残留c；

9)将步骤8)所得的上清液C，在低于40℃的低温下，采用减压蒸馏除溶剂得到浓缩液，经透析或超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第三蛋白，其质量为0.15～0.25g；

10)将0.5M NaOH溶液滴加到步骤8)所得的残留c(含去离子水200～800mL)中，在5～15℃下搅拌混合均匀，并使体系的pH为9.0～10.0，然后在高压均质机中进行碱提5～30min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到D和残留d；

11)将步骤10)所得上清液D用0.5M HCl溶液调成中性，在40℃以下低温下进行减压蒸馏浓缩，再经透析或超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第四蛋白，其质量为0.20～0.40g。

12)将1M NaOH溶液滴加到步骤10)所得的残留d(含去离子水200～800mL)中，在5～15℃下搅拌混合均匀，并使体系的pH为10.0～11.0，然后在高压均质机中进行碱提5～30min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到F和残留f；

13)将步骤12)所得上清液F用1M HCl溶液调成中性，在40℃以下低温下进行减压蒸馏浓缩，再经透析或超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第五蛋白，其质量为0.05～0.25g；

14)将步骤12)所得的残留f，经过水洗、干燥，制备为竹笋膳食纤维粉。

实施例1毛竹笋五种蛋白的低温制备：

第一蛋白：将100g新鲜洗涤干净的毛竹笋片和800mL去离子水加入到1000mL的烧杯中，用匀浆机充分粉碎得到匀浆液，再用胶体磨中充分粉碎100min，使最大颗粒尺寸小于500μm。然后，将上述所得粉碎浆液的温度调整为15℃，然后进行高压均质水提，工作压力800bar，均质时间为15min，然后经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到得到上清液A和残留a。将上清液A进行40℃低温减压蒸馏浓缩至15mL，再经超滤、冷冻干燥得到第一蛋白，其质量为1.51g，提取率为1.51％。

第二蛋白：将700mL 3％NaCl溶液加入到残留a中，在15℃下搅拌混合均匀，倒入均质机中，进行高压均质盐提，工作压力800bar，提取时间为15min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到上清液B和残留b。然后，将上清液B，在40℃低温下进行减压蒸馏浓缩，再经透析除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第二蛋白，其质量为0.35g，提取率为0.35％。

第三蛋白：将600mL75％无水乙醇加入到残留b中，并在15℃下搅拌混合均匀，然后在高压均质机中(工作压力800bar)进行醇提15min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到上清液C和残留c。在35℃的低温下，再将上清液C进行减压蒸馏除溶剂得到浓缩液，经透析除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第三蛋白，其质量为0.19g，提取率为0.19％。

第四蛋白：将0.5M NaOH溶液滴加到残留c(含去离子水600mL)中，在15℃下搅拌混合均匀，并使体系的pH为9.5，然后在高压均质机中(工作压力800bar)进行碱提15min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到D和残留d。然后，将上清液D用0.5MHCl溶液调成中性，在40℃低温下进行减压蒸馏浓缩，再经透析除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第四蛋白，其质量为0.28g，提取率为0.28％。

第五蛋白：将1M NaOH溶液滴加到残留d(含去离子水600mL)中，在15℃下搅拌混合均匀，并使体系的pH为11.8，然后在高压均质机中(工作压力800bar)进行碱提15min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到F和残留f。再将上清液F用1M HCl溶液调成中性，在40℃以下低温下进行减压蒸馏浓缩，再经透析除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第五蛋白，其质量为0.09g，提取率为0.09％。

毛竹笋四种蛋白氨基酸组成分析：

依次精确称量毛竹笋第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白样品各20mg，将各个样品分别加入8mL的6M HCl溶液后，氮气密封，并在110℃的烘箱内保持22h，然后经冷却，过滤除杂，用双蒸水将各个溶液定容至50mL，各取1mL进行冷冻干燥。结束后，加入1mL的0.02M HCl，充分摇匀，在14000r/min下高速离心15min，上清液过0.45μm滤膜，最后将滤液用氨基酸自动分析仪进行分析检测。毛竹笋5种蛋白氨基酸成分分析结果如表1所示。

表1毛竹笋5种蛋白的氨基酸成分和含量(g/100g蛋白样品)

实施例2毛竹笋五种蛋白的低温制备：

第一蛋白：将101g新鲜洗涤干净的毛竹笋片和600mL去离子水加入到1000mL的烧杯中，用匀浆机充分粉碎得到匀浆液，再用胶体磨中充分粉碎110min，使最大颗粒尺寸小于500μm。然后，将上述所得粉碎浆液的温度调整为12℃，然后进行高压均质水提，工作压力600bar，均质时间为20min，然后经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到得到上清液A和残留a。将上清液A进行40℃低温减压蒸馏浓缩至18mL，再经透析、冷冻干燥得到第一蛋白，其质量为1.35g，提取率为1.34％。

第二蛋白：将600mL 3％NaCl溶液加入到残留a中，在15℃下搅拌混合均匀，倒入均质机中，进行高压均质盐提，工作压力700bar，提取时间为20min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到上清液B和残留b。然后，将上清液B，在40℃低温下进行减压蒸馏浓缩，再经超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第二蛋白，其质量为0.48g，提取率为0.48％。

第三蛋白：将500mL75％无水乙醇加入到残留b中，并在15℃下搅拌混合均匀，然后在高压均质机中(工作压力700bar)进行醇提20min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到上清液C和残留c。在36℃的低温下，再将上清液C进行减压蒸馏除溶剂得到浓缩液，经超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第三蛋白，其质量为0.21g，提取率为0.21％。

第四蛋白：将0.5M NaOH溶液滴加到残留c(含去离子水500mL)中，在15℃下搅拌混合均匀，并使体系的pH为9.6，然后在高压均质机中(工作压力600bar)进行碱提20min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到D和残留d。然后，将上清液D用0.5MHCl溶液调成中性，在40℃低温下进行减压蒸馏浓缩，再经超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第四蛋白，其质量为0.32g，提取率为0.32％。

第五蛋白：将1M NaOH溶液滴加到残留d(含去离子水600mL)中，在15℃下搅拌混合均匀，并使体系的pH为11.5，然后在高压均质机中(工作压力600bar)进行碱提20min，经离心、水洗残留、离心、合并上清液得到F和残留f。再将上清液F用1M HCl溶液调成中性，在40℃低温下进行减压蒸馏浓缩，再经超滤除盐和有机小分子，用冷冻干燥法干燥，得到第五蛋白，其质量为0.08g，提取率为0.08％。

毛竹笋四种蛋白氨基酸组成分析：

依次精确称量毛竹笋第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白样品各20mg，将各个样品分别加入8mL的6M HCl溶液后，氮气密封，并在110℃的烘箱内保持22h，然后经冷却，过滤除杂，用双蒸水将各个溶液定容至50mL，各取1mL进行冷冻干燥。结束后，加入1mL的0.02M HCl，充分摇匀，在14000r/min下高速离心20min，上清液过0.45μm滤膜，最后将滤液用氨基酸自动分析仪进行分析检测。毛竹笋5种蛋白氨基酸成分分析结果如表2所示。

表2毛竹笋5种蛋白的氨基酸成分和含量(g/100g蛋白样品)