超声波制备玉米醇溶蛋白包埋白藜芦醇纳米颗粒的方法与流程

本发明涉及食品包埋技术领域，特指一种以玉米醇溶蛋白为原料、采用多模式超声处理制备纳米颗粒并对白藜芦醇进行包埋的的方法。

背景技术：

维生素、不饱和脂肪酸、多酚类化合物或益生菌等生物活性成分，具有调节人体生理机能的功能，可以延缓和预防慢性疾病的发生。然而，上述活性成分对食品加工和储藏过程中温度、氧、光、ph和金属离子等因素敏感，易于发生氧化、异构化、聚集或降解等结构改变，导致生物活性降低或丢失。而且，疏水性和两亲性活性成分在水中溶解度非常低。这些在很大程度上限制了生物活性成分在食品和医药工业中的应用。对生物活性成分进行包埋是食品加工和储藏过程中对其保护、消化以及增加生物利用度的一种有效手段。天然的生物大分子(如蛋白质、多糖等)不但具有高的营养价值，而且具有多种功能特性，已被广泛用作包埋技术中的原料。

玉米醇溶蛋白(zein)旧称玉米朊，日本学者称之为“醇溶谷蛋白”，顾名思义属于醇溶蛋白类，1821年johngorham将之命名为zein。其由很多不同的肽链的多肽混合而成，这些多肽的分子大小、溶解性及电荷都不相同，mckinney在1958年首次提出玉米醇溶蛋白(zein)主要包括α-zein和β-zein两种成分，α-醇溶蛋白(α-zein)是指溶于95％乙醇的蛋白，约占所有醇溶蛋白的80％。β-醇溶蛋白(β-zein)溶于60％乙醇而不溶于95％的乙醇，该蛋白相对来说不稳定，易发生凝沉或胶凝，工业制备的玉米醇溶蛋白中不存在。与β-醇溶蛋白比较而言，α-醇溶蛋白更缺乏组氨酸、精氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。pomes提出β-醇溶蛋白分子量较大可能是由α-醇溶蛋白通过二硫键连接组成，因为它水解后，凝胶电泳出现了三个主要带，分子量分别为：24000、22000、14000da。

玉米醇溶蛋白独特的结构性质和氨基酸组成决定了其营养价值低、很难被生物体利用的特点，很难直接作为食品原料使用，造成了其在食品生产领域中直接应用的局限性。但是玉米醇溶蛋白具有粘结、光亮、疏水、阻氧和易成膜等功效，所成膜具有一定韧性，而且光滑、耐水、耐油、防腐等特性，在药物辅料、食品包装材料、生物降解塑料领域等有着良好的潜在应用前景，具有重大的商业价值。如beck的研究表明，玉米醇溶蛋白能作为药物片剂的包衣。其可以在胃中不被消化，这样它就能用于保护药效成分在胃里完好无缺，但能在在肠道中溶解并缓慢释放其包衣物(beckm.i,tomkai,wayseke.physico-chemicalcharac-terizationofzeinasafilmcoatingpolymer-adirectcompari-sonwithwithethylcellulose[j].pharm.1996,14:137-150.)。李秀明等在玉米醇溶蛋白(zein)中添加了聚了聚丙撑碳酸酯(ppc)，通过挤压法制备得到zein-ppc复合薄膜，ppc的添加增强了复合膜的拉伸强度和耐水性，制备的膜为一种良好的可降解的生物材料(李秀明,陈野,王君予,等.ppc对挤压成型zein-ppc复合薄膜性质的影响[j].食品科学,2012,(23):6-10.)。seungyongcho等人进行了玉米醇溶蛋白和大豆蛋白制成的复合膜包装橄榄油试验，研究结果表明，复合膜能显著减缓橄榄油的氧化和腐败，达到了很好的阻氧化作用(chosy,leesy,rheec.edibleoxygenbarrierbilayerfilmpouchesfromcornzeinandsoyproteinisolateforoliveoilpackaging[j].lwt-foodscienceandtechnology.2010,43(8):1234-1239.)。

白藜芦醇是一种生物性很强的天然的多酚类蒽醌萜化合物，又称为芪三酚，是肿瘤的化学预防剂，也是对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂，具有抗氧化、抗肿瘤、保护肝脏等作用。然而其性质不稳定、水溶性差、生物利用度低，在强酸强碱、光照及较高温度下容易发生氧化，且经人体摄入后在胃环境中容易分解破坏而失去活性，因此研究和发展一种白藜芦醇的载体，对其进行包封，以保持其活性及提高其生物利用率尤为必要。

研究发现蛋白质纳米颗粒可以对生物活性成分起到很好的包埋和保护作用。因此国内外学者进行了大量的蛋白质对生物活性成分包埋的研究。乳化法是蛋白质纳米颗粒包埋生物活性成分的常用方法，此法的不足表现在蛋白质纳米颗粒包埋生物活性成分的过程中需要添加有机溶剂、表面活性剂、戊二醛交联剂等，这些试剂的残留使蛋白质纳米颗粒的具有一定毒性；去溶剂法和化学交联法也涉及有毒交联剂的引入；因此这三种方法不是蛋白质纳米颗粒包埋生物活性成分的理想方法。离子交联法和自组装法制备蛋白质纳米颗粒，条件温和，不需要有毒的交联剂，不生成化合键，仅依靠非共价键进行连接，因而被广泛使用。特别是自组装法，对于营养递送系统设计而言，安全性等相对更佳。然而蛋白质毕竟是具体独特性质的生物大分子，仅仅通过简单自组装法包埋生物活性成分，蛋白质分子对生物活性成分的包埋效率低。

为了解决这一问题，本发明引进先进的多模式超声波技术，希望超声波能激发蛋白质与多酚两种生物大分子溶液产生与其自身固有频率相匹配的共振频率，产生交联，获得了一种包埋效率高、ph稳定、粒径均一的蛋白质纳米颗粒，利用所得的蛋白质纳米颗粒对生物活性成分进行包埋和保护。

技术实现要素：

为解决上述问题，该发明主要是通过蛋白质纳米颗粒包埋生物活性成分和多模式超声波处理等技术手段制备玉米醇溶蛋白包埋白藜芦醇纳米颗粒，并研究其对白藜芦醇的包埋作用。

本发明包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，是由以下重量份的原料制备而成：

玉米醇溶蛋白：5-20份；

白藜芦醇：1份。

优选由以下重量份的原料制备而成：

玉米醇溶蛋白：20份；

白藜芦醇：1份。

其中所述的玉米醇溶蛋白为市售产品。

其中所述的玉米醇溶蛋白或者按照下述步骤进行制备：

(1)玉米黄粉采用粉碎机粉碎后过60筛，按照料液比1:10(mg/ml)加入无水乙醇；

(2)逆流超声波辅助脱色40min，然后4000r/min离心5min分离收集上清液；滤饼待进一步超声提取玉米醇溶蛋白；

(3)步骤(2)中的滤饼按照料液比1:8(mg/ml)加入80％乙醇，双频扫频超声波辅助提取，然后4000r/min离心5min分离收集上清液；

(4)上述上清液倒入2倍体积质量浓度为0.6％的氯化钠溶液，回收玉米醇溶蛋白，4℃静置24h，然后收集沉淀，反复水洗，40℃热风干燥4h后，粉碎成玉米醇溶蛋白成品。

其中步骤(2)中逆流脉冲超声辅助脱色的具体参数为脉冲宽度1～5s、脉冲间隔1～5s、超声功率密度50～80w/l；超声频率20khz，料液以逆流循环的方式通过超声探头。

其中步骤(3)中所述的双频扫频超声工作时固定上下板间距为10cm，扫频周期300s，间歇比1:1.2(超声10s，间歇12s)，上下每块振板功率为600w。

其中步骤(3)中所述的双频频率组合为：33khz/68khz、33khz/40khz、33khz/28khz；最优选佳频率组合为33khz/68khz。

其中所述的包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，按照下述步骤进行制备得到：

(1)将玉米醇溶蛋白溶解到70％乙醇中，得到玉米醇溶蛋白浓度为0.06g/ml溶液，磁力搅拌至完全溶解；8000r/min条件下低温(4℃)离心10min；取0.75ml上清液，涡旋振荡条件下逐滴分散到2ml去离子水中；

(2)在避光条件下将白藜芦醇将入到上述混合溶液中，使得玉米醇溶蛋白和白藜芦醇的质量比例为5-20：1。

(3)在避光条件下同时进行多频模式超声处理，其中所述的多频超声处理模式为：三频或者双频或者单频同步超声处理，超声功率密度80～120w/l；超声脉冲工作时间10s；脉冲间歇时间3s，超声处理时间为40min。

其中三频或者双频或者单频同步超声处理的超声波频率组合为：20khz、28khz、28/40khz或者20/28/40khz，优选20/28/40khz。

(4)超声结束后，室温下静置6h，即得包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白溶液，喷雾干燥或者冷冻干燥后得包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明在玉米醇溶蛋白包埋白藜芦醇的过程中施加了多模式超声波，改变玉米醇溶蛋白的高级结构，使其结构打开，暴露活性基团，蛋白质形成小的聚集体，从而促进各聚集体通过疏水相互作用形成纳米颗粒为包埋生物活性成分提供基础。

(2)本发明中包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法，工艺操作简单，制备过程中未涉及有机试剂，适宜工业化生产，且玉米醇溶蛋白原料价格便宜，制备工艺简单。

(3)本发明的包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白纳米颗粒具有稳定性好、生物相容性好、缓释时间长、包载率高等优点，可应用于食品、保健品、药品及化妆品等多个领域。

(4)本发明以玉米黄粉为原料，分离提取其中的玉米醇溶蛋白并用作制备包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的原料，有利于玉米加工副产物的综合利用，同时提高玉米黄粉的附加值。

附图说明

图1是本发明的多模式超声波生物处理设备结构图，其中1、2、3为超声振板，4为盛液器，5为水浴锅，6为温度探头，7为循环泵，8为电脑程序控制器，9、10、11为超声控制器。

图2是扫频双频超声预处理装置的设备图，1-超声池，2-温度计，3-恒温水浴池，4-超声波上振板，5-超声波下振板，6-样品处理区域，7-电脑控制器，8-超声波发生器。

图3是逆流超声处理设备结构示意图，1为聚能式超声波探头，2为超声波控制器，3为超声杯型腔，4为进料口，5为循环泵，6为盛液器，7为出料口。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

图1为本发明的多模式超声波生物处理设备，该设备配有一台电脑程序控制器8，可设定超声工作参数(超声功率密度、频率、脉冲工作时间、间歇时间和处理总时间)分别控制三个超声控制器9、10、11，分别连接三支不同频率的超声振板1、2、3，可实现单一频率/两个频率/三个频率超声波处理；将需要处理的溶液投入盛液器4中进行单频/双频/多频超声辅助酶解试验，启动循环泵7对溶液进行循环。通过水浴锅5和温度探头6实现溶液温度的自动控制。

图2为本发明使用的扫频双频超声预处理装置的设备图，为江苏大学自主研制。超声发生器8能发出定频和扫频两种模式的超声波，单台超声波发生器功率为600w。在超声池1中上下对称放置超声波振板上板4和超声波下板5，通过超声波发生器8控制超声波振板上板4和超声波下板5；电脑控制器7设定超声波各参数后，控制超声波发生器8，发出符合要求的超声波；3为本发明中设备的恒温水浴池，通过温度计2实时监控温度，并根据工作需要调节介质温度；将需要处理的液原料置于样品袋中置于处理液区域6中进行超声波处理。

图3为本发明的逆流超声处理设备，该设备配有超声波控制器2，控制超声参数，聚能式超声波探头1对进料口4进入超声杯型腔3的物料进行处理，超声的同时启动循环泵5对料液进行循环，6为盛液器，7为出料口。

本发明中的玉米醇溶蛋白为市售产品(蛋白质含量大于90％)。

本发明中的玉米醇溶蛋白或者按照下述步骤进行制备：

(1)玉米黄粉采用粉碎机粉碎后过60筛，按照料液比1:10(mg/ml)加入无水乙醇；

(2)逆流超声波脱色40min，然后4000r/min离心5min分离收集上清液；滤饼待进一步超声提取玉米醇溶蛋白；具体参数为脉冲宽度5s、脉冲间隔5s、超声功率密度80w/l；超声频率20khz，料液以逆流循环的方式通过超声探头。

(3)步骤(2)中的滤饼按照料液比1:8(mg/ml)加入80％乙醇，双频扫频超声波辅助提取，然后4000r/min离心5min分离收集上清液；双频扫频超声工作时固定上下板间距为10cm，扫频周期300s，间歇比1:1.2(超声10s，间歇12s)，上下每块振板功率为600w；双频频率组合为：33khz/68khz。

(4)上述上清液倒入2倍体积质量浓度为0.6％的氯化钠溶液，回收玉米醇溶蛋白，4℃静置24h，然后收集沉淀，反复水洗，40℃热风干燥4h后，粉碎成玉米醇溶蛋白成品，测得其中蛋白质含量为90.5％。

实施例1-4(不加超声)

(1)将玉米醇溶蛋白溶解到70％乙醇中，得到玉米醇溶蛋白浓度为0.06g/ml溶液，磁力搅拌至完全溶解；8000r/min条件下低温(4℃)离心10min；取0.75ml上清液，涡旋振荡条件下逐滴分散到2ml去离子水中；

(2)在避光条件下将白藜芦醇将入到上述混合溶液中，玉米醇溶蛋白和白藜芦醇的质量比例为5:1。

(3)室温下静置6h，即得包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白溶液，按照下述步骤测定白藜芦醇包封率，游离白藜芦醇含量测定:取包覆白藜芦醇的玉米醇溶蛋白溶液，经超滤管(截留分子量10kd)在8000×g下离心20min，取滤液500μl于25ml容量瓶中定容，测定a306处的吸光值，并计算游离白藜芦醇质量。

根据下式计算白藜芦醇的包封率和负载率：

白藜芦醇的包封率(％)＝(白藜芦醇总质量－游离白藜芦醇质量)×100/白藜芦醇总质量；

白藜芦醇的负载率(％)＝(白藜芦醇总质量－游离白藜芦醇质量)×100/样品总质量。

(4)喷雾干燥或者冷冻干燥后得包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。

实施例2-4制备过程同实施例1，只是玉米醇溶蛋白/白藜芦醇质量不同，具体见表1不同玉米醇溶蛋白/白藜芦醇质量比对白藜芦醇包封率和负载率的影响。

通过表1中对比实施例1-4不同玉米醇溶蛋白/白藜芦醇质量比对白藜芦醇包封率和负载率的影响可以看出，随着玉米醇溶蛋白的量增加，白藜芦醇的包封率逐步降低，但是当玉米醇溶蛋白/白藜芦醇质量比为20:1时，白藜芦醇的包封率又升高了，达到了55.6％。

表1不同玉米醇溶蛋白/白藜芦醇质量比对白藜芦醇包封率和负载率的影响

实施例5-10(加超声)

(1)将玉米醇溶蛋白溶解到70％乙醇中，得到玉米醇溶蛋白浓度为0.06g/ml溶液，磁力搅拌至完全溶解；8000r/min条件下低温(4℃)离心10min；取0.75ml上清液，涡旋振荡条件下逐滴分散到2ml去离子水中；

(2)在避光条件下将白藜芦醇将入到上述混合溶液中，玉米醇溶蛋白和白藜芦醇的质量比例为10:1。

(3)在避光条件下同时进行多频模式超声处理，其中所述的多频超声处理模式为：三频或者双频或者单频同步超声处理，超声功率密度120w/l；超声脉冲工作时间10s；脉冲间歇时间3s。其中同步超声处理的超声波频率为：28khz。

(4)室温下静置6h，即得包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白溶液，按照下述步骤测定白藜芦醇包封率，游离白藜芦醇含量测定:取包覆白藜芦醇的玉米醇溶蛋白溶液，经超滤管(截留分子量10kd)在8000×g下离心20min，取滤液500μl于25ml容量瓶中定容，测定a306处的吸光值，并计算游离白藜芦醇质量。

根据下式计算白藜芦醇的包封率和负载率：

白藜芦醇的包封率(％)＝(白藜芦醇总质量－游离白藜芦醇质量)×100/白藜芦醇总质量；

白藜芦醇的负载率(％)＝(白藜芦醇总质量－游离白藜芦醇质量)×100/样品总质量。

(5)喷雾干燥或者冷冻干燥后得包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。

实施例6-8制备过程同实施例5，只是超声参数略有改变，表2不同超声波模式对白藜芦醇包封率和负载率的影响。

表2不同超声波模式对白藜芦醇包封率和负载率的影响

通过表2中对比实施例5-8不同超声波模式对玉米醇溶蛋白纳米颗粒包埋白藜芦醇的包封率和负载率的影响，可以发现超声波处理可以显著提高玉米醇溶蛋白纳米颗粒包埋白藜芦醇的包封率，与对照相比(不超声)，28khz的单频超声波处理即可使白藜芦醇的包封率提高70.4％，而20/28/40khz的多频超声波处理则使白藜芦醇的包封率提高了88.3％。