本发明属于珊瑚人工养殖技术领域。具体涉及珊瑚人工养殖的复合液体饵料的制备方法。
背景技术：
近年来，虽然活体珊瑚养殖在商业化水族市场的比重越来越大，但是国产活体珊瑚几乎完全来自于野外捕获；市场的需求与珊瑚人工养殖科研的现状存在脱节，针对满足市场需求的国产珊瑚繁育研究报道几乎没有。在珊瑚优良观赏性状筛选、良种培育、产业化等方面均为空白。水族箱中的珊瑚处于良好的环境(例如，水质指标合适，水流，水温，光照系统，钙含量等)，在水族箱中的珊瑚会自然增加。主要是无性繁殖形式，母体会产生分枝。在发芽过程中，一个新珊瑚(芽体)会在母体的边上长出，随着芽体的生长，会逐渐脱离母体，新的珊瑚个体产生了。开展水族箱中珊瑚人工养殖是一种获得更多珊瑚的有效办法，更重要的是，可以减少野外采集的数量，保护自然珊瑚礁环境。
珊瑚的“食谱”中，珊瑚虫体内的虫黄藻是珊瑚虫的重要营养源。虫黄藻可以通过光照等适宜条件珊瑚可以自行解决。单依靠虫黄藻不能满足珊瑚生长的营养需要，需要补充动物性饵料。单细胞的浮游动物、甲壳类小动物以及多毛类、贝壳类、棘皮动物的幼虫都被列为主要的饵料。虽然这些鲜活饵料，投喂方便，管理简便。但鲜活饵料来源有限，受季节性影响很大，生长密度也很低，给鲜活饵料的采集造成困难，这也给大规模珊瑚人工养殖生产产生了制约因素。相对于天然鲜活饵料，对珊瑚的人工饵料的研究更少。虽然市场上存有各种类型的珊瑚人工饵料，但这些人工饵料的作用一般缺乏科学研究数据与证据，这些珊瑚人工饵料替代食物营养价值较低，在水体中保形性差，影响珊瑚类食用，而且还会对水环境造成严重的污染。导致养殖水环境氨氮超标、水质恶化，进而引发细菌和病毒等病原微生物大量滋生等问题。一些研究表明，多数商业人工饵料并不能提高珊瑚的生长率，反而可能引起水体富营养化及珊瑚白化。
技术实现要素：
本发明目的是针对现有水族市场珊瑚人工养殖的饵料技术不足，制备一种珊瑚人工养殖复合液体饵料，其营养成分比较全面，饵料的营养均衡性好，饵料无毒、无害，饵料兼具营养和净化水质的功效，在水中的稳定性好，性价比高，比同等营养价值饵料成本低50％以上。该复合液体饵料能提高水族市场珊瑚人工养殖的成活率、和生长速度。
为实现本发明的目的采用的技术方案是：
1、酶解清液与鱼油混合液的制备
(1)重量体积份配比：
(2)制备：
在虾肉和贻贝性腺中加海水，通过搅碎机搅碎成虾肉和贻贝性腺碎屑液，加虾肉和贻贝性腺碎屑液重量的0.18～0.22％复合蛋白酶进行酶解得到酶解液，酶解液通过200目尼龙布过滤后酶解清液；酶解清液中加入鱼油，混合制成酶解清液与鱼油混合液，在6～8℃冷藏备用。
所述的海水，是指将海水煮沸5分钟后再冷却至常温的海水。
所述的鱼油是购自汤臣倍健股份有限公司的深海鱼油。
所述的复合蛋白酶由酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶按1:1重量比例构成。
所述的酶解，其条件为：ph为4.0,酶解温度为45～55℃,酶解时间为48～60h。虾肉和贻贝性腺酶解液的蛋白回收率和水解度分别为80～83％和42～46％。
2、拟微绿球藻与石莼混合液的制备
(1)重量、体积份配比：
石莼液200-250g
拟微绿球藻200-250g
海水1000ml
(2)制备
将新鲜石莼洗净去杂处理后，放入磨碎机进行研磨处理，研磨后的石莼碎屑悬浮液通过200目筛绢网袋过滤，得到石莼液于4℃下保存。拟微绿球藻(nannnochloropsisgaditana)藻种经扩增培养后，离心机沉淀藻体。取拟微绿球藻沉淀藻体和石莼液混合，加入海水，制成拟微绿球藻与石莼混合液，在8～10℃冷藏备用。
所述的拟微绿球藻的藻种扩增培养：拟微绿球藻培养基为人工海水(f/2)培养基；培养条件:初始接种藻细胞密度为(4～8)×104个/ml。试验采所用光照强度为100μmol·m－2·s－1，培养温度为25℃，光暗比为12h光照∶12h黑暗。
所述的海水，是指将海水煮沸5分钟后再冷却至常温的海水。
3、混合菌种子液的制备
将酿酒酵母种子液、产朊假丝酵母种子液和深红红螺菌种子液按照1:1:4的体积比例混合，制成混合菌种子液，在10～14℃冷藏备用。
所述的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)种子液由8°bx米曲汁和10°bx麦芽汁按照5:2的体积比例混合，接种酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)种子并置于摇床上进行酿酒酵母培养得到的酿酒酵母种子液。
所述的酿酒酵母培养，其温度为28℃～30℃，培养时间为72～96小时，摇床转速120转/分。培养结束时，酿酒酵母种子液中每毫升含酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌数≥10个亿。
所述的产朊假丝酵母(candidautilis)种子液由8°bx米曲汁和10°bx麦芽汁按照5:1的体积比例混合，接种产朊假丝酵母(candidautilis)种子并进行摇床培养，得到的产朊假丝酵母种子液。
所述的产朊假丝酵母摇床培养，其温度为28℃～30℃，培养时间为72～96小时，摇床转速120转/分。培养结束时，产朊假丝酵母种子液中每毫升含产朊假丝酵母菌数≥10个亿。
所述的深红红螺菌(rhodospirillumrubrum)种子培养液组成按重量百分比为：氯化铵0.1～0.2％、碳酸氢钠、0.04～0.8％、磷酸氢二钾0.05～0.1％、乙酸钠0.20～0.40％、硫酸镁0.02～0.04％，余量为无菌水，经调节种子培养液ph为7.8后，将深红红螺菌种子接种到培养液中，在自然光照下进行静止培养得到的深红红螺菌种子液。
所述的静止培养，其条件为：培养温度为30℃～32℃，培养时间为96～120小时。培养结束时，深红红螺菌种子液中每毫升含深红红螺菌菌数≥20个亿。
4、珊瑚人工养殖复合液体饵料的制备
将以上步骤(1)酶解清液与鱼油混合液、步骤(2)拟微绿球藻、石莼混合液、步骤(3)混合菌种子液按照3:2:1的体积比例混合均匀成复合液体，按照复合液体总重量的5％加入复合维生素，溶解后得到本发明所述的珊瑚人工养殖复合液体饵料。其使用时，可用针管吸取，注入珊瑚体腔及珊瑚小穗周围即可。
所述的复合维生素配比为：硫胺素26mg、核黄素105mg、烟酸510mg、泛酸钙105mg、维生素b6105mg、维生素b120.26mg、生物素1.2mg、叶酸12mg。
所述的8°bx米曲汁，其制备过程如下：
(1)蒸饭：糯米清洗后，清水浸泡6h至米粒呈乳白色，将水沥干，倒入蒸饭机连续蒸饭，得到熟透的糯米饭。
(2)淋饭搭窝：糯米饭经过输送带喷水淋饭，让饭粒吸水膨胀，糯米饭冷却温度控制在40℃。每个酒缸倒入50斤糯米的蒸饭量，加入甜酒药和红曲粉，拌匀，压平实，中间挖个井状窝，进行搭窝糖化。
(3)糖化：搭窝糖化48h后，井状窝中出现少量糖化液，冲入清水，停留24小时，可以通过压榨过滤得到浅黄色的浓甜味米曲汁。用时将滤液稀释至所需糖度。
所述的10°bx麦芽汁，其制备过程如下：
所述的10°bx麦芽汁制备：称1500g麦芽粉,加水4500ml，置于55℃保温水浴糖化4小时，即可取出过滤。将滤液装瓶灭菌备用。用时将滤液稀释至所需糖度。
所述的菌株产朊假丝酵母(candidautilis)编号：2.1495；酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)编号：2.596；深红红螺菌(rhodospirillumrubrum)编号：1.3369，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
所述的石莼(ulvalactucal.)、拟微绿球藻(nannnochloropsisgaditana)、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、鱼油、虾肉、贻贝、维生素均购自市场。
采用本发明所述的复合液体饵料对珊瑚进行50天的人工养殖(试验组)，与相同水环境无添加饵料自然生长的同品种人工养殖的珊瑚(对照组1)以及市场购买的人工饵料同品种人工养殖的珊瑚(对照组2)进行试验对照，其生长增重情况如下表。
表50天喂养肉质软珊瑚生长情况
表中数据显示，采用本发明所述的复合液体饵料对珊瑚进行人工养殖的肉质软珊瑚，经过50天的养殖后，从起始湿重223.28增加到341.43克，净增118.15克，天均生长率达到2.36。
而对照组1、对照组2天均生长率仅为0.32和0.92，大大低于本发明制备的复合液体饵料。表明本发明制备的复合液体饵料，营养均衡性好，能提高珊瑚的成活率和生长速度，同时兼具营养和净化水质的功效。
具体实施方式
实施例1
1、酶解清液与鱼油混合液的制备
(1)重量体积份配比：
(2)制备：
在虾肉和贻贝性腺中加海水，通过搅碎机搅碎成虾肉和贻贝性腺碎屑液，加0.036kg的复合蛋白酶进行酶解得到酶解液，酶解液通过200目尼龙布过滤后酶解清液；酶解清液中加入0.07kg鱼油，混合制成酶解清液与鱼油混合液，在6℃冷藏备用。
所述的海水，是指将海水煮沸5分钟后再冷却至常温的海水。
所述的复合蛋白酶由酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶按1:1的重量比例构成。
所述的酶解，其条件为：ph为4.0,酶解温度为55℃,酶解时间为48h。虾肉和贻贝性腺酶解液的蛋白回收率和水解度分别为82.5％和42.6％。
2、拟微绿球藻与石莼混合液的制备
(1)重量、体积份配比：
石莼液2.5kg
拟微绿球藻2kg
海水10l
(2)制备
将新鲜石莼洗净去杂处理后，放入磨碎机进行研磨处理，研磨后的石莼碎屑悬浮液通过200目筛绢网袋过滤，得到石莼液于4℃下保存。拟微绿球藻(nannnochloropsisgaditana)种子经扩增培养后，离心机沉淀藻体。取拟微绿球藻沉淀藻体和石莼液混合，加入海水，制成拟微绿球藻与石莼混合液，8℃冷藏备用。
所述的海水，是指将海水煮沸5分钟后再冷却至常温的海水。
3、混合菌种子液的制备
分别取0.5l酿酒酵母种子液、0.5l产朊假丝酵母种子液和2l深红红螺菌种子液按照1:1:4的体积比例，混合制成混合菌种子液3l，在14℃冷藏备用。
所述的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)种子液由8°bx米曲汁和10°bx麦芽汁按照5:2的体积比例混合，接种酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)种子并置于摇床上，进行酿酒酵母培养得到的酿酒酵母种子液。
所述的酿酒酵母培养，其温度为30℃，培养时间为72小时，摇床转速120转/分。培养结束时，酿酒酵母种子液中每毫升含酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌数＝10.24个亿。
所述的产朊假丝酵母(candidautilis)种子液由8°bx米曲汁和10°bx麦芽汁按照5:1的体积比例混合，接种产朊假丝酵母(candidautilis)种子并置于摇床上，进行产朊假丝酵母培养得到的产朊假丝酵母种子液。
所述的产朊假丝酵母培养，其温度为30℃，培养时间为80小时，摇床转速120转/分。培养结束时，产朊假丝酵母种子液中每毫升含产朊假丝酵母菌数＝11.74个亿。
所述的深红红螺菌(rhodospirillumrubrum)种子培养液组成按重量百分比为：氯化铵0.2％、碳酸氢钠、0.04％、磷酸氢二钾0.05％、乙酸钠0.40％、硫酸镁0.02％，余量为无菌水，经调节种子培养液ph为7.8后，将深红红螺菌种子接种到种子培养液，在自然光照下进行静止培养，得到的深红红螺菌种子液。
所述的静止培养，其条件为：培养温度为32℃，培养时间为100小时。培养结束时，深红红螺菌种子液中每毫升含深红红螺菌菌数＝21.85个亿。
(4)珊瑚人工养殖复合液体饵料的制备
将以上步骤(1)酶解清液与鱼油混合液6l、步骤(2)拟微绿球藻、石莼混合液4l、步骤(3)混合菌种子液2l混合均匀成复合液体，按照复合液体总重量的5％加入复合维生素，搅匀溶解后得到本发明所述的珊瑚人工养殖复合液体饵料。其使用时，可用50ml针管吸取，注入珊瑚体腔及珊瑚小穗周围即可。
所述的复合维生素配比为：硫胺素26mg、核黄素105mg、烟酸510mg、泛酸钙105mg、维生素b6105mg、维生素b120.26mg、生物素1.2mg、叶酸12mg。
实施例2
实施例1
1、酶解清液与鱼油混合液的制备
(1)重量体积份配比：
(2)制备：
在虾肉和贻贝性腺中加海水，通过搅碎机搅碎成虾肉和贻贝性腺碎屑液，加0.072kg的复合蛋白酶进行酶解得到酶解液，酶解液通过200目尼龙布过滤后酶解清液；酶解清液中加入0.14kg鱼油，混合制成酶解清液与鱼油混合液，在6℃冷藏备用。
所述的海水，是指将海水煮沸5分钟后再冷却至常温的海水。
所述的复合蛋白酶由酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶按1:1的重量比例构成。
所述的酶解，其条件为：ph为4.0,酶解温度为55℃,酶解时间为48h。虾肉和贻贝性腺酶解液的蛋白回收率和水解度分别为82.0％和45.5％。
2、拟微绿球藻与石莼混合液的制备
(1)重量、体积份配比：
石莼液5.0kg
拟微绿球藻4kg
海水20l
(2)制备
将新鲜石莼洗净去杂处理后，放入磨碎机进行研磨处理，研磨后的石莼碎屑悬浮液通过200目筛绢网袋过滤，得到石莼液于4℃下保存。拟微绿球藻(nannnochloropsisgaditana)种子经扩增培养后，离心机沉淀藻体。取拟微绿球藻沉淀藻体和石莼液混合，加入海水，制成拟微绿球藻与石莼混合液，8℃冷藏备用。
所述的海水，是指将海水煮沸5分钟后再冷却至常温的海水。
3、混合菌种子液的制备
分别取1l酿酒酵母种子液、1l产朊假丝酵母种子液和4l深红红螺菌种子液按照1:1:4的体积比例，混合制成混合菌种子液6l，在14℃冷藏备用。
所述的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)种子液由8°bx米曲汁和10°bx麦芽汁按照5:2的体积比例混合，接种酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)种子并置于摇床上，进行酿酒酵母培养得到的酿酒酵母种子液。
所述的酿酒酵母培养，其温度为28℃，培养时间为90小时，摇床转速120转/分。培养结束时，酿酒酵母种子液中每毫升含酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌数＝11.56个亿。
所述的产朊假丝酵母(candidautilis)种子液由8°bx米曲汁和10°bx麦芽汁按照5:1的体积比例混合，接种产朊假丝酵母(candidautilis)种子并置于摇床上，进行产朊假丝酵母培养得到的产朊假丝酵母种子液。
所述的产朊假丝酵母培养，其温度为28℃，培养时间为96小时，摇床转速120转/分。培养结束时，产朊假丝酵母种子液中每毫升含产朊假丝酵母菌数＝12.85个亿。
所述的深红红螺菌(rhodospirillumrubrum)种子培养液组成按重量百分比为：氯化铵0.2％、碳酸氢钠、0.04％、磷酸氢二钾0.05％、乙酸钠0.40％、硫酸镁0.02％，余量为无菌水，经调节种子培养液ph为7.8后，将深红红螺菌种子接种到种子培养液，在自然光照下进行静止培养，得到的深红红螺菌种子液。
所述的静止培养，其条件为：培养温度为30℃，培养时间为120小时。培养结束时，深红红螺菌种子液中每毫升含深红红螺菌菌数＝22.15个亿。
(4)珊瑚人工养殖复合液体饵料的制备
将以上步骤(1)酶解清液与鱼油混合液12l、步骤(2)拟微绿球藻、石莼混合液8l、步骤(3)混合菌种子液4l混合均匀成复合液体，按照复合液体总重量的5％加入复合维生素，搅匀溶解后得到本发明所述的珊瑚人工养殖复合液体饵料。其使用时，可用50ml针管吸取，注入珊瑚体腔及珊瑚小穗周围即可。
所述的复合维生素配比为：硫胺素26mg、核黄素105mg、烟酸510mg、泛酸钙105mg、维生素b6105mg、维生素b120.26mg、生物素1.2mg、叶酸12mg。