金花菌对栘*叶化学成分的微生物转化及应用的制作方法

本发明属于制茶技术领域和微生物发酵技术领域，具体涉及金花菌对栘叶化学成分的微生物转化及应用。该技术的产品可用于食品、功能型食品的开发。

背景技术：

栘俗称野苹果、楂子树、栘衣、栘依、栘[木衣]、栘枍、栘等，是蔷薇科苹果亚科栘属docynia植物的统称，为常绿或半常绿的乔木，包括三个种：云南栘(d.delavayi(franch.)schneid)、栘(d.indica(wall.)dcne)和长爪栘(d.longiunguisq.luoetj.l.liu)，主要分布在我国西南少数民族地区及东南亚地区，生于海拔2000-3000米的山坡、溪旁及丛林中。

栘是我国西南少数民族地区及东南亚地区常见的药食两用的植物资源。其茎叶、果实可入药，具有消炎、接骨、舒经活血、舒肝止痛、清暑消毒等功效；嫩茎尖也是傣族日常采集的野生蔬菜之一。另外，栘果实营养丰富且口感独特，常作为野生水果食用，也有部分开发成果脯、果醋、果酒等；目前市场上对栘的开发利用多为果实销售及加工。

研究表明，栘叶中含有较高的多酚物质，保健价值高，而且栘叶一年四季均可采集，资源量大。然而栘作为木本植物，其叶片较大，生长后期老化，不利于直接利用，因此需要一定的加工方式对栘叶进行处理，以达到开发利用的目的。但目前尚无开发、利用栘叶的报道，更未见将栘叶制备成代用茶类的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种栘发酵茶及其制备方法。

本发明提供了一种新型代用叶茶的制备流程与方法，丰富了代用茶的制备技术和原料的微生物处理技术，拓展了药食两用物品的开发技术。

本发明提供了一种采用金花菌提高栘有效成分含量和抗氧化活性的方法，它包括如下步骤：

a、制备栘茶粗品：取栘鲜叶，剪成体积为1-2cm³的碎叶片，摊放2hr-4hr，然后进行杀青、首次揉捻，再摊放0.5hr-1hr、再二次揉捻、干燥，控制水分在8％-11％，得栘茶粗品；

其中，杀青的温度为200℃-300℃，杀青的时间为5min-10min，出锅后摊放30min-60min，然后进行揉捻；

其中，揉捻采用揉捻机，首次揉捻方式为轻压10min-25min；二次揉捻方式为轻压5min-10min；

b、取步骤a的栘茶粗品，先用蒸汽处理10min，用45℃-55℃的温度进行渥堆处理3hr-5hr；

c、冠突散囊菌发酵：按水料比为20％-40％(ml/g)的比例加入无菌水，接种冠突散囊菌；然后在25℃-35℃条件下培养发酵2d-60d；

d、将步骤c的发酵物烘干，即得栘发酵茶。

其中，步骤b中，首次蒸汽处理为饱和蒸汽处理；

和/或，所述渥堆处理的条件为：50℃下4hr；

其中，渥堆处理时，控制茶堆的含水量为12％-20％。

其中，步骤b中，渥堆处理后，还包括灭菌步骤；其中，灭菌的方法为：115℃保持20min。

其中，步骤c中，水料比为35％或45％。

其中，步骤c中，接种浓度为5％(v/m)或7％(v/m)的冠突散囊菌。

其中，步骤c中，接种冠突散囊菌后，冠突散囊菌的数量为10⁶～10⁷个/ml。

其中，步骤c中，发酵的温度为28℃或31℃；和/或，发酵过程中翻动2-3次。

其中，步骤c中，发酵的时间为7天或36-60天；其中，发酵的时间为40天。

其中，步骤d中，烘干的温度为40℃-60℃，控制水分在8-11％；其中，烘干的温度为50℃。

本发明还提供了上述方法制备的栘发酵茶。

本发明方法通过利用人工接种“金花菌”(即冠突散囊菌)，对栘叶进行固态发酵，通过hplc指纹图谱分析技术和定量分析的方法，对发酵前后栘叶中的化学成分及抗氧化活性的变化进行考察，为栘叶开发成代用茶的可行性提供一定的理论基础，从而提高栘的综合利用价值。

本发明的栘发酵茶感官品质、口感佳，而且氨基酸含量高、根皮素含量高，营养成分丰富，适合广泛日常饮用，具有较高的开发与应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1发酵过程中的栘茶发花情况

图2发酵过程中栘茶的hplc指纹图谱

图3根皮苷、根皮素和对照色谱图

图4发酵过程中根皮苷、根皮素的含量变化

图5发酵过程中氨基酸含量变化

图6发酵过程中各类氨基酸含量变化

图7发酵过程中的dpph自由基清除率

图8发酵过程中的总还原力

图9不同粒度制备的栘茶发酵前后茶样对比

图10不同发酵粒度制备的栘茶中根皮苷、根皮素含量

图11水料比对发酵的影响

图12不同接种量对发酵的影响

图13不同温度对发酵的影响

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验材料与仪器如下：

栘叶：采自云南省德宏州、攀枝花市和西昌市等地；

冠突散囊菌(eurotiumcristatum)：购自北纳创联生物技术研究院，bncc146559，即中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏号为cgmcc3.448的冠突散囊菌菌种；

根皮苷、根皮素：纯度≥98％，成都普菲德生物技术有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯(lc)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

沙氏培养基：广东环凯生物技术有限公司；

6cr-25型茶叶揉捻机购自四川省井研县飞亚机械制造有限公司；a-astree电子舌购自法国alphamos公司；安捷伦1260高效液相色谱仪购自美国安捷伦有限公司；s-433d氨基酸分析仪购自德国sykam公司；wsl-2比较测色仪购自上海昕瑞仪器仪表有限公司；sartoriusbp211d型电子天平购自北京塞多利斯仪器系统有限公司；ar224cn型电子天平购自奥豪斯仪器(上海)有限公司；direct-q型超纯水仪购自美国millipore公司；kq400kdb型高功率数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；ldzx-50kbs型立式压力蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械厂；dhp-9082型电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；sw-cj-2f型洁净工作台购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；dhg-9240a电热恒温鼓风干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司。

实施例1本发明栘发酵茶的制备

一、制备未发酵的栘茶粗品

具体方法如下：取栘树鲜叶，剪成1-2cm³的碎叶片，摊放2-4hr，然后进行杀青、首次揉捻，再摊放0.5-1hr后、二次揉捻、干燥，控制水分在8-11％，得栘茶粗品；

杀青和揉捻是关键的环节：

1)杀青温度200℃-300℃，杀青时间5min-10min。可用炒锅手工杀青，锅温200℃-300℃，每锅投叶量5kg-7kg，叶子下锅后能听到清脆的如炒豆般爆声。杀青时间5min-10min，杀至青味消失，略有清香溢出，此时叶色暗绿，叶梗手折不断，杀青叶手捏成团，松手后会慢慢弹开。出锅后摊放30min-60min，然后进行揉捻；

2)揉捻可用小型揉捻机(如：6cr-25型茶叶揉捻机，四川省井研县飞亚机械制造有限公司)，投叶量15kg-20kg，首次揉捻用轻压揉10min-25min。二次揉捻加轻压揉5min-10min。

二、冠突散囊菌种子液的制备

取4℃保存的冠突散囊菌菌种，接种于沙氏液体培养基上，28℃、150r/min摇床培养24h，挑取适量菌丝接种于沙氏斜面培养基中，培养7d后，向斜面试管中加入适量无菌水，反复吹洗斜面，制成孢子悬浮液并转移至100ml无菌三角瓶中，以血球计数板法调节其孢子浓度为10⁶～10⁷个/ml，即得种子液。

三、固态发酵法制备栘发酵茶

准确称取10g栘茶粗品，汽蒸10min后转移至100ml发酵瓶中，50℃下渥堆培养4h后，于115℃灭菌20min，按照35％的水料比加入无菌水，5％的接种量接种冠突散囊菌种子液，28℃下发酵培养7天或40天，于50℃条件下烘干后得栘发酵茶。

实施例2本发明栘发酵茶的制备

一、制备未发酵的栘茶粗品

具体方法如下：取栘树鲜叶，剪成1-2cm³的碎叶片，摊放2-4hr，然后进行杀青、首次揉捻，再摊放0.5-1hr后、二次揉捻、干燥，控制水分在8-11％，得栘茶粗品；

杀青和揉捻是关键的环节：

1)杀青温度200℃-300℃，杀青时间5min-10min。可用炒锅手工杀青，锅温200℃-300℃，每锅投叶量5kg-7kg，叶子下锅后能听到清脆的如炒豆般爆声。杀青时间5min-10min，杀至青味消失，略有清香溢出，此时叶色暗绿，叶梗手折不断，杀青叶手捏成团，松手后会慢慢弹开。出锅后摊放30min-60min，然后进行揉捻；

2)揉捻可用小型揉捻机(如：6cr-25型茶叶揉捻机，四川省井研县飞亚机械制造有限公司)，投叶量15kg-20kg，首次揉捻用轻压揉10min-25min。二次揉捻加轻压揉5min-10min。

二、冠突散囊菌种子液的制备

取4℃保存的冠突散囊菌菌种，接种于沙氏液体培养基上，28℃、150r/min摇床培养24h，挑取适量菌丝接种于沙氏斜面培养基中，培养7d后，向斜面试管中加入适量无菌水，反复吹洗斜面，制成孢子悬浮液并转移至100ml无菌三角瓶中，以血球计数板法调节其孢子浓度为10⁶～10⁷个/ml，即得种子液。

三、固态发酵法制备栘发酵茶

称取5g栘茶粗品(即栘碎茶)，汽蒸10min后转移至100ml发酵瓶中，50℃下渥堆培养4h后，于115℃灭菌20min，按照45％的水料比加入无菌水，7％的接种量接种冠突散囊菌种子液，31℃下发酵培养7天或40天，于50℃条件下烘干后得栘发酵茶。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1本发明栘发酵茶的发酵时间筛选

一、实验方法

(一)不同发酵时间制备栘茶样品

准确称取10g栘茶粗品，汽蒸10min后转移至100ml发酵瓶中，50℃下渥堆培养4h后，于115℃灭菌20min，按照35％的水料比加入无菌水，5％的接种量接种冠突散囊菌种子液，28℃下发酵培养，共发酵60天，分别在第0(未发酵)、2、4、6、9、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60天取样，烘干后得不同发酵天数的栘发酵茶。共16组样品，代表16个时间点，每组3个平行。

(二)栘茶的化学成分测定

1、hplc指纹图谱分析不同发酵时间化学成分的动态变化

指纹图谱测定用样品制备：称取不同发酵时间的栘茶样于50℃条件下烘干至恒重，研钵研碎成粉末并过60目筛(过筛率大于98％)，精密称取粉末0.1000g于25ml容量瓶中，然后加入约20ml甲醇，在25℃下超声提取30min，冷却至室温后以甲醇定容得提取液，样品过0.45μm微孔滤膜，即为指纹图谱测定用样品。低温保存备用。

色谱条件：agilentzorbaxextend-c18柱(4.6×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相a(乙腈)、b(甲醇)、c(水)按下述洗脱方式进行：0～40min(5％-15％a∶0％-35％b∶95％-50％c)，40～44min(15％-30％a∶35％-0％b∶50％-70％c)，44～55min(30％-40％a∶70％-60％c)，55～59min(40％-100％a∶60％-0％c)，59～70min(100％a)，体积流量：1ml/min，进样量：10μl，检测波长：285nm。

2、根皮苷、根皮素含量变化

精密称取标准品根皮苷0.0040g、根皮素0.0020g于50ml容量瓶中，以甲醇溶解定容，配制成根皮苷质量浓度为80μg/ml、根皮素质量浓度为40μg/ml的对照品混合储备液。分别移取0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5ml储备液至10ml容量瓶中，甲醇定容，配制成不同浓度的根皮苷、根皮素混合标准溶液，得根皮苷质量浓度分别为0.4、0.8、1.6、4、8、16、40μg/ml的单一成分对照品储备液；根皮素质量浓度分别为0.24、0.48、0.96、2.4、4.8、9.6、20μg/ml的单一成分对照品储备液，按上述色谱条件进行分析，分别以浓度x(μg/ml)为横坐标，色谱峰面积(mau*min)y为纵坐标进行线性拟合，所得标准曲线用于计算栘发酵茶中根皮苷、根皮素含量变化。

3、氨基酸含量动态变化

选取0(未发酵)、10、20、30、40天的样品进行测定。分别称取1.5g发酵前后栘茶样品，加入80ml沸水，沸水浴上浸提45min，抽滤后将滤液收集于100ml容量瓶中，并用少量去离子水洗涤残渣，冷却后定容，摇匀得茶汤。取5ml茶汤于离心管中，加入5ml10％磺基水杨酸，摇匀，静置10分钟，4000r/min离心10min，上清液经不同程度稀释后，经0.22μm微孔滤膜过滤待测。。色谱柱：lcak07(150mm×4.6mm)，检测波长：570nm，440nm，洗脱液流量：0.45ml/min，反应液流量：0.25ml/min，柱温：57～74℃梯度温度，反应温度：130℃。

(三)栘茶的抗氧化活性测定

1、dpph自由基清除法测定不同发酵时间抗氧化活性的变化

密准确称取0.0078gdpph标准品，于100ml容量瓶中，用甲醇定容、溶解。dpph浓度为78μg/ml，现配现用。按表1进行试验：

表1

按照下式计算dpph自由基清除率：

2、铁氰化钾还原法测定不同发酵时间抗氧化活性的变化

2.1芦丁标准曲线制作

精密称取芦丁标准品0.0021g置于10ml容量瓶中，用甲醇定容、溶解，得到质量浓度为210μg/ml，分别精密吸取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml芦丁母液到试管中，再分别加入0.95、0.9、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml甲醇溶液至试管中补足溶液体积1ml，得到芦丁质量分数分别为10.5、21、42、84、126、168、210μg/ml的单一成分对照品储备液。同时，精密吸取1.0ml甲醇到试管中作为空白对照。然后依次加入2.5ml磷酸缓冲液，再加入2.5ml1％铁氰化钾溶液，混合摇匀，封口后，置于水浴锅中50℃恒温水浴20min。水浴结束后迅速冷却，再加入2.5ml10％三氯乙酸溶液，混合摇匀，4000r/min离心10min后精密量取2.5ml上清液，依次加入2.5ml蒸馏水、1.0ml0.1％三氯化铁溶液，混合摇匀，静置10min后在波长700nm处测定吸光度值。分别以芦丁的质量浓度x(μg/ml)为横坐标，吸光度值为纵坐标进行线性拟合。

2.2总还原力的测定

取提取液0.1ml，加0.9ml95％乙醇进行稀释，按芦丁标准曲线制作过程进行测定，所得不同样品对应的吸光度值带入芦丁标准曲线进行计算，以芦丁当量评价栘茶发酵过程总还原力的变化。

二、实验结果

(一)不同发酵时间制备的栘茶茶样变化

栘茶长期发酵过程中的发花情况如图1所示。

可知，随着发酵时间延长，茶样颜色逐渐加深，最后栘茶变为暗绿色，且表面出现少量白色菌斑。冠突散囊菌生长状况良好，在整个发酵过程中栘茶表面布满金黄色颗粒，并伴有独特的“菌花香”。

(二)化学成分变化

1、hplc指纹图谱的建立

分别测定了栘茶发酵过程中不同发酵天数的16个样品的hplc指纹图谱，如图2。

可知，栘茶发酵过程当中化学成分的含量分别发生了不同程度的增减，发酵前期的大部分成分在后期消失了，而后期又生成了许多成分。

2、根皮苷、根皮素的含量变化

结合中药指纹图谱相似度评价系统2004a，根据外标法可以判断出样品中18号峰和26号峰变化最大，并确定18号峰为根皮苷，26号峰为根皮素，如图3。

由hplc法制作所得根皮苷标准曲线为y＝19.776x+4.2290，r²＝0.99998；根皮素标准曲线为：根皮素标准曲线分别为y＝34.788x+2.9654，r²＝0.99999。根据所得根皮苷、根皮素标准曲线计算栘茶发酵过程中根皮苷、根皮素含量的变化，如图4。在人工接种冠突散囊菌发酵栘茶的过程中，其主要功效成分根皮苷、根皮素含量变化如图4。

可见，根皮苷、根皮素含量变化与栘茶化学成分相似度评价结果一致，整个发酵过程可分成三个时间段。发酵第一阶段(发酵0-6天)含量变化幅度较为明显，随着发酵天数的增加，根皮苷含量显著降低，根皮素含量显著增加；发酵第二阶段(发酵7-35天)根皮苷、根皮素含量变化趋势有所减缓；发酵第三阶段(发酵36-60天)基本趋于平衡状态，根皮苷含量40mg/g左右，根皮素含量115mg/g左右。

按下式计算得到栘茶中总根皮苷的含量：

式中：m1为1g茶样中根皮苷质量(g)；m2为1g茶样中根皮素质量(g)；m1为根皮苷的摩尔质量g/mol；m2为根皮素的摩尔质量g/mol。

由图4可知，在整个发酵过程中，根皮苷含量逐渐下降，同时根皮素含量逐渐上升，而根皮苷当量一直处于平衡状态，平均当量为232.15mg/g，说明减少的根皮苷几乎降解转化为了根皮素。

因此，发酵后的栘茶，根皮素含量提高，尤其是发酵36-60天的栘茶，根皮素含量保持在115mg/g左右，含量较高。

3、氨基酸成分变化

发酵40天的过程中氨基酸含量与组成如表2，氨基酸含量变化如图5，呈味氨基酸、人体必需氨基酸和氨基酸总量变化如图6。

表2发酵过程中氨基酸的变化

由表2、图5可知，栘茶在发酵40天的过程中，其17种氨基酸变化明显，一部分氨基酸含量降低，一部分氨基酸先增后减。其中，丝氨酸、甘氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸这10种氨基酸含量先增后减。其余氨基酸含量均持续下降。

由表2、图6可知，栘茶中各类氨基酸含量的变化也较为明显。发酵40天后，其氨基酸总量、鲜味氨基酸下降；而甜味氨基酸、芳香族氨基酸、人体必需氨基酸的含量均呈现出先升高后降低的趋势，各类氨基酸在30天时达到平衡状态。

因此，发酵后的栘茶，甜味氨基酸、芳香族氨基酸、人体必需氨基酸的含量升高，营养增加且口感较好。

(三)抗氧化活性的变化

1、dpph自由基清除率测定法

以发酵天数x(d)为横坐标，dpph自由基清除率y(％)为纵坐标作图，发酵过程当中的dpph自由基清除能力见图7。

dpph自由基清除法是最常用于评价抗氧化性能的一种方法，目前已经在全世界范围内都被广泛用于自由基清除能力的评价与分析。稀释后的样品液中栘茶浓度为1.2mg/ml，由图7可知，未发酵的栘茶dpph自由基清除能力最低，仅有33.20％，而发酵后dpph自由基清除率较强，发酵2天后就增加到54.59％，之后的两个月都趋于较稳定的状态，一致保持在50％左右。说明抗氧化能力为：栘茶>未发酵的栘茶粗品。仅发酵2天dpph自由基清除率能力就加强到原来的1.5倍。说明人工接种冠突散囊菌能有效提高栘茶的dpph自由基清除能力，侧面反映出能够有效提高栘茶的抗氧化能力。

因此，发酵后的栘茶，dpph自由基清除率均较高，是发酵前的1.5倍，发酵2-60天的栘茶抗氧化性能均较强。

2、总还原力法

以芦丁质量浓度x(μg/ml)为横坐标，以吸光度值y为纵坐标作图，得回归方程为y＝0.0028x+2.96544，r2＝0.9992。

以发酵天数x(d)为横坐标，总还原力即芦丁当量y(g/g)为纵坐标作图，见图8。

可知，发酵过程当中栘茶的总还原能力是逐渐增强的。未发酵的时候芦丁当量仅有0.05g/g，发酵2天总还原力升高到0.07g/g，而后稳定上升，在发酵第30天时，芦丁当量达到0.14g/g，之后趋于稳定状态，一直保持在0.14g/g左右。

因此，发酵后的栘茶，芦丁当量均较高，尤其是发酵40天的栘茶，芦丁当量提高2倍以上，抗氧化性能较强。

综合考虑，本发明发酵40天的栘茶，冠突散囊菌生长良好，根皮素的含量高，必须氨基酸含量高，抗氧化性能强，栘茶品质好，营养保健价值高。

试验例2本发明栘发酵茶的条件优化

一、制备栘茶过程

1、制备未发酵的栘茶粗品

具体方法如下：取栘树鲜叶，不同处理后，摊放2-4hr，然后进行杀青、首次揉捻，再摊放0.5-1hr后、二次揉捻、干燥，控制水分在8-11％，得栘茶粗品；

杀青和揉捻是关键的环节：

1)杀青温度200℃-300℃，杀青时间5min-10min。可用炒锅手工杀青，锅温200℃-300℃，每锅投叶量5kg-7kg，叶子下锅后能听到清脆的如炒豆般爆声。杀青时间5min-10min，杀至青味消失，略有清香溢出，此时叶色暗绿，叶梗手折不断，杀青叶手捏成团，松手后会慢慢弹开。出锅后摊放30min-60min，然后进行揉捻；

2)揉捻可用小型揉捻机(如：6cr-25型茶叶揉捻机，四川省井研县飞亚机械制造有限公司)，投叶量15kg-20kg，首次揉捻用轻压揉10min-25min。二次揉捻加轻压揉5min-10min。

2、冠突散囊菌种子液的制备

同实施例1。

3、固态发酵法制备栘发酵茶

二、发酵条件的筛选方法

1、不同粒度对发酵的影响

将茶样分别处理成不同粒度大小：粉末(60目筛)、碎茶(0.5cm*0.5cm)、整茶。

整茶：指取栘鲜叶，杀青、揉捻制备的粗品；

粉末：指取栘鲜叶，杀青、揉捻制备成粗品后，打粉；

碎茶：指取栘鲜叶，剪成1-2cm³的碎叶片，杀青、揉捻制备的粗品。

准确称取5g栘粉末、碎茶、整茶放入培养瓶，汽蒸10min，50℃渥堆4h后，调整水料比为35％，接种冠突散囊菌种子液为5％，环境温度28℃，环境湿度60％～70％下发酵培养。每组3个平行，监控发花情况，待发酵7d后，按照试验例1中方法，测定根皮苷、根皮素含量，以根皮素的含量作为评价指标。

2、水料比对发酵的影响

准确称取5g栘碎茶放入培养瓶，汽蒸10min，50℃渥堆4h后，115℃下灭菌20min，按照15％、25％、35％、45％、55％的水料比加入无菌水，接种冠突散囊菌种子液5％。环境温度28℃，环境湿度60％～70％下发酵培养。每组3个平行，监控发花情况，待发酵7d后，测定根皮苷、根皮素含量，以根皮素的含量作为评价指标。

3、接种量对发酵的影响

准确称取5g栘碎茶放入培养瓶，汽蒸10min，50℃渥堆4h后，115℃下灭菌20min，按35％水料比加入无菌水，接种冠突散囊菌种子液分别为1％、3％、5％、7％、9％，环境温度28℃，环境湿度60％～70％下发酵培养。每组3个平行，监控发花情况，待发酵7d后，测定根皮苷、根皮素含量，以根皮素的含量作为评价指标。

4、发酵温度对发酵的影响

准确称取5g栘碎茶放入培养瓶，汽蒸10min，50℃渥堆4h后，115℃下灭菌20min按35％水料比加入无菌水，接种冠突散囊菌种子液5％，环境温度分别为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃，环境湿度60％～70％下发酵培养。每组3个平行，监控发花情况，待发酵7d后，测定根皮苷、根皮素含量，以根皮素的含量作为评价指标。

5、同时对水料比、接种量和发酵温度进行考察

选择不同组合的水料比、接种量、发酵温度；其他条件为汽蒸10min，50℃渥堆4h，环境湿度60％～70％下发酵7d。以根皮素含量作为评价指标，对发酵工艺进行优化。

6、统计与分析

所得实验数据用spss19.0软件和excel进行统计分析，origin9_64软件作图。

三、结果

1、粒度对发酵的影响

粒度大小为粉末、碎茶、整茶时，发酵7天后，各粒度栘茶发酵前后茶样对比如图9。栘茶当中根皮苷、根皮素含量如表3、图10所示。

表3不同发酵粒度制备的栘茶中含量

由表3、图10可知，将栘茶粗品处理成不同粒度，以粉末、碎茶、整茶的形态固态发酵7天后，根皮苷的含量均有不同程度的下降，而根皮素的含量均有所增加。其中，整茶中根皮素含量太低，转化效率低，并且容易产生搅拌不均匀以至于发酵不均匀。粉末状发酵虽然转化率高，但是加水后粉末成团，出现发酵不均匀的现象，误差较大。而碎茶发酵的栘茶，根皮苷含量sd值只有4.52，根皮素含量的sd值只有0.59，误差最小，碎茶发酵均匀，可以保证每一批发酵茶品质相当。

因此，选择栘茶粗品进行发酵时，应选择碎茶。

2、水料比对发酵的影响

水料比分别为15％、25％、35％、45％、55％时，发酵培养7天后，栘茶当中根皮苷、根皮素含量如表4、图11所示。

表4水料比对发酵的影响

可知，不同水料比发酵后，根皮苷的含量均有不同程度的下降，而根皮素的含量均较发酵前有所增加。

3、接种量对发酵的影响

接种量分别为1％、3％、5％、7％、9％时，发酵7天后，栘茶当中根皮苷、根皮素含量如表5、图12所示。

表5不同接种量对发酵的影响

可知，不同体积的菌液发酵后，根皮苷的含量均有不同程度的下降，而根皮素的含量均较发酵前有所增加。

4、温度对发酵的影响

在25℃、28℃、31℃、34℃、37℃，发酵7天后，栘茶当中根皮苷、根皮素含量如表6、图13所示。

表6不同温度对发酵的影响

可知，不同温度下发酵后，根皮苷的含量均有不同程度的下降，大部分根皮素的含量较发酵前有所增加。

5、综合考察水料比、接种量、发酵温度的影响，结果见表7。

表7不同条件组合对发酵的影响

可知，在水料比45％，接种量7％，温度31℃的条件发酵后，根皮素的含量高达25.51mg/g。

根皮素是根皮苷的苷元，具有极强的抗氧化活性，活性高于根皮苷，而且根皮素具有一定的癌症辅助治疗作用，还可以作为天然的皮肤美白剂，并且具有保护心血管、抑制葡萄糖转运、调节自身免疫的作用。本发明的栘发酵茶根皮素含量高，营养保健价值高。

因此，最终的发酵工艺为：称取5g栘碎茶，汽蒸10min后转移至100ml发酵瓶中，50℃下渥堆培养4h后，于115℃灭菌20min，按照45％的水料比加入无菌水，7％的接种量接种冠突散囊菌种子液，31℃下发酵培养7天，烘干后得栘发酵茶。

综上，本发明的栘发酵茶感官品质、口感佳，而且根皮素含量高、必需氨基酸含量高、营养成分丰富，适合广泛日常饮用，市场应用前景良好。