本发明涉及食品添加剂，特别涉及天然食品添加剂，具体属于一种以君迁子叶为原料制备天然食品添加剂的方法和应用。
背景技术：
食品添加剂是为改善食品色、香、味等品质，以及为防腐和加工工艺的需要而加入食品中的物质。食品添加剂按来源分为两大类，一类是化学合成添加剂，一类是天然食品添加剂。目前，市场上使用的大多数为化学合成添加剂，化学合成添加剂成本低、效果显著，但作用单一，具有毒副作用，各国都规定限量使用。在“崇尚绿色，回归自然”的当今，天然食品添加剂的研究与应用已日趋广泛，尤其是具营养和保健功能的天然食品添加剂更成为人们追求的热点。
亚硝酸盐广泛存在于各类食品中，食品中亚硝酸盐主要有以下几个来源：1)以发色剂和防腐剂加入食品中。亚硝酸盐是肉制品加工中应用最广泛的一种添加剂；2)食物原料中含亚硝酸盐。植物性食物原料在生长过程中施用过多硝酸铵和其它硝态氮肥后，造成土壤富营养化，过剩硝态氮被植物吸收后以硝酸盐的形式储藏在植物食物中，造成植物食物中亚硝酸盐和硝酸盐含量超标；3)食物中硝酸盐转化为亚硝酸盐。食物中一般都含有微量硝酸盐，如存放过久或保管、加工不当。细菌大量繁殖就会将食物中的硝酸盐转化为亚硝酸盐。然而，亚硝酸盐有害健康的问题倍受关注，过量的亚硝酸盐可使正常的血红蛋白，失去携氧的功能，导致组织缺氧,严重者会因呼吸衰竭而死；亚硝酸盐也可与肉制品中的次级胺等发生反应，生成致癌物质n-亚硝胺类化合物，美国一份调查已证实，每年有135例癌症死亡与亚硝酸盐有关。因此，具亚硝酸盐清除功能的天然食品添加剂的研究与发现可有效减少亚硝酸盐的危害。
君迁子(diospyroslotusl)为柿树科柿属植物，别名黑枣、软枣、牛奶枣等，广泛分布于我国辽宁、河北、山东、陕西、山西及西南各地，资源丰富，研究已表明君迁子叶富含维生素c、多酚和黄酮类物质，具有保肝、预防癌症等多种生理功能。早在80年代，山西就将其开发为多维茶饮用，是一种天然、安全的原料。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种天然食品添加剂及其制备方法和应用；所述天然食品添加剂的制备是以君迁子叶为原料，且方法简单；所制备的天然食品添加剂具有较强的抗氧化、抑菌、亚硝酸盐清除的作用，可作为抗氧化剂、防腐剂、亚硝酸盐清除剂在食品中应用。
本发明提供的一种天然食品添加剂的制备方法，包括如下步骤：
1)提取：取干燥君迁子叶，加入8～10倍质量的去离子水，浸泡1～2h，80～90℃回流提取1～2h，过滤；按上述操作将滤渣提取2～3次；合并滤液，并在60～70℃减压条件下将滤液浓缩至原体积的1/10～1/15，得到浓缩液a；
2)醇沉：将浓缩液a用10～15倍体积的乙醇溶液醇沉处理，混合溶液的乙醇浓度控制在70％，过滤；滤渣用8～10倍体积的70％乙醇溶液重复浸提2～3次，每次浸提1～2小时，过滤；合并滤液，并在55℃减压浓缩至比重为1.10～1.15的浓缩液b；
3)分离、干燥：将浓缩液b载入大孔吸附树脂柱中，依次分别用水和20％的乙醇水溶液淋洗2～4个柱体积，至流出的淋洗液呈浅黄，再用40％乙醇水溶液淋洗2～4个柱体积，收集40％乙醇水溶液淋洗液，并在55℃减压浓缩，得到浓缩液c，将浓缩液c冷冻干燥，得棕红色粉末，即为目标产物。利用福林酚法测定此添加剂中的总多酚含量，含量最高可达51.28±0.22g/100g(以没食子酸当量计算)。
步骤3)中的大孔吸附树脂柱的材料为弱极性大孔吸附树脂ab-8或非极性大孔吸附树脂d101。
经实验证明，本发明制备的添加剂呈天然红棕色，具有较强的抗氧化、抑菌、亚硝酸盐清除作用，使蒸煮肠具有稳定的红棕色，可抑制蒸煮肠中脂肪、蛋白质氧化，延长蒸煮肠保质期，降低蒸煮肠中亚硝酸盐的残留量，可作为抗氧化剂、防腐剂、亚硝酸盐清除剂在食品中应用，优选在肉制食品中应用。
本发明具有如下优点：
1)本发明以多维茶即君迁子叶为原料，经水提、醇沉、大孔树脂柱分离有效组分、冷冻干燥制备天然食品添加剂，原料天然、安全，制备工艺简便，可操作性强。
2)本发明制备的食品添加剂多酚含量达50％，具较强的抗氧化作用，可作为抗氧化剂在食品中应用。
3)本发明制备的添加剂呈天然红棕色，可使肉制品呈稳定的红棕色，可代替亚硝酸盐着色。
4)本发明制备的添加剂具有较强的抑菌作用，可作为防腐剂在食品中应用。
5)本发明制备的添加剂具有亚硝酸盐清除作用，可在无硝或低硝食品生产中应用，以减少食品中亚硝酸盐的残留量，降低亚硝酸盐的危害。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1君迁子叶制备天然食品添加剂
取干燥君迁子叶，加入10倍质量的去离子水，浸泡1.5h，80℃回流提取1h，过滤；按上述操作将滤渣提取2次；合并滤液，并在65℃减压条件下将滤液浓缩至原体积的1/10，得到浓缩液a；将浓缩液a用10倍体积的乙醇溶液进行醇沉处理，混合溶液的乙醇浓度控制在70％，过滤；滤渣用10倍体积的70％乙醇溶液重复浸提2次，每次浸提1h，过滤；合并滤液，并在55℃减压浓缩至比重为1.10的浓缩液b；将b载入用d101大孔吸附树脂柱层析分离，依次分别用水和20％的乙醇水溶液淋洗4个柱体积，再用40％乙醇水溶液淋洗4个柱体积，收集40％乙醇水溶液淋洗液，并在55℃减压浓缩得到浓缩液c，将浓缩液c冷冻干燥，即得天然食品添加剂。利用福林酚法测定添加剂中的总多酚，含量为49.79±0.18g/100g(总酚含量以没食子酸当量计算)。
实施例2君迁子叶制备天然食品添加剂
取干燥君迁子叶，加入9倍质量的去离子水，浸泡1.5h，80℃回流提取1h，过滤；按上述操作将滤渣提取2次；合并滤液，并在65℃减压条件下将滤液浓缩至原体积的1/10，得到浓缩液a；将浓缩液a用10倍体积的乙醇溶液进行醇沉处理，混合溶液的乙醇浓度控制在70％，过滤；滤渣用10倍体积的70％乙醇溶液重复浸提2次，每次浸提1h，过滤，合并滤液，并在55℃减压浓缩至比重为1.10的浓缩液b，将b载入用ab-8大孔吸附树脂柱层析分离，依次分别用水和20％的乙醇水溶液淋洗4个柱体积，再用40％乙醇水溶液淋洗4个柱体积，收集40％乙醇水溶液淋洗液，55℃减压浓缩得到浓缩液c，将浓缩液c冷冻干燥，即得天然食品添加剂。利用福林酚法测定添加剂中的总多酚，含量为51.28±0.22g/100g(总酚含量以没食子酸当量计算)。
实施例3添加剂的抗氧化活性
准确称取9.86mg的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)溶解在无水乙醇中，定容到250ml棕色容量瓶，得0.1mm的dpph·溶液。
将抗坏血酸(vc)和本发明制备的添加剂用50％乙醇配制成不同浓度的溶液，现用现配。
精密移取dpph·乙醇溶液2ml，分别加入2ml不同浓度的vc或样品溶液，摇匀，室温下避光静置30min后，测定在522nm处吸光度值ax。2ml无水乙醇加2ml样品溶液做样品空白，记为aj，2ml50％乙醇加2mldpph·溶液测得的吸光度值为a0，2ml的无水乙醇加入2ml50％乙醇测得的吸光度值为ab，重复操作3次，根据下式计算dpph·的清除率。
表1样品对dpph·的清除作用
结果：本发明方法制备的添加剂对dpph·自由基的清除作用与vc相当。提示本发明方法制备的添加剂具有较强的抗氧化作用。
实施例4添加剂的抑菌作用
1)菌悬液的制备
受试菌用无菌生理盐水配制成108cfu/ml的菌液，再用无菌生理盐水稀释到106cfu/ml，备用。
2)样品溶液的配制
本发明制备的添加剂，用少量二甲基亚砜溶解后，用液体培养基稀释到10ml。取1ml采用二倍稀释法，制备出不同浓度梯度的添加剂溶液，备用。
3)微量稀释法测最小抑菌浓度(mic)值
采用微量稀释法测定不同浓度添加剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的mic值。在96孔板中先加入100μl添加剂溶液或液体培养基，再加入10μl步骤2)中配制的菌悬液，每个浓度做3个平行，在微量振荡器上振摇5min后，于37℃培养箱中培养24h。采用int(碘硝基四唑紫)染色法，确定最小抑菌浓度mic。
结果表明：本发明制备的添加剂对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(mic＝0.3125mg/ml)及革兰氏阴性菌大肠杆菌(mic＝1.25mg/ml)均具有较强的抑制作用。
实施例5添加剂对亚硝酸盐的清除作用
1)标准曲线制作
称取1mgnano2溶解到去离子水中，定容于100ml的容量瓶中，得10μg/mlnano2标准溶液。
分别取nano2标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2ml于10ml容量瓶中，再加入0.5ml50％乙醇和0.4ml0.4％对氨基苯磺酸，摇匀、静置5min后，加入0.2ml0.2％盐酸萘乙二胺，定容到10ml容量瓶中，摇匀、静置15min。于538nm下测定反应液的吸光度值。以吸光度a作纵坐标，nano2浓度(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，对该曲线进行线性回归后，得到其线性回归方程y＝0.6844c(r2＝0.9985)，线性检测范围为0.2～1.2μg/ml。
2)样品测定
本发明制备的添加剂，用50％乙醇配制成不同浓度的溶液，现用现配。取1ml柠檬酸钠-盐酸缓冲液(ph＝3，0.5m)置于10ml容量瓶中，取0.5ml不同浓度添加剂溶液依次加入容量瓶中，再分别加入10μg/ml的nano2溶液1ml，在37℃恒温水浴中反应30min，取出后立即加入0.4％的对氨基苯磺酸溶液0.4ml，混匀，静置5min后加入0.2％的盐酸萘乙二胺溶液0.2ml，加缓冲液到刻度，混匀，静置15min，于538nm处测定吸光度值，平行测定三次。同时各做3份nano2标准管和清除剂本底标准管。用下式计算清除率。
式中：a0为未加清除剂的标准管吸光度；ax为加入不同浓度清除剂的反应液吸光度；axi为加入不同浓度清除剂本底的吸光度。
结果表明：本发明制备的添加剂对亚硝酸盐具有较强的清除作用(半抑制浓度ic50＝47.79μg/ml)。
实施例6添加剂的应用效果(以蒸煮肠中的应用为例介绍)
将本发明制备的添加剂分三个剂量组jqz低(0.5％)、jqz中(1％)、jqz高(1.5％)添加到蒸煮肠中(以蒸煮肠原料的总质量计)，在第0、1、2、3、4周取样，进行各项指标的测定，与空白对照组和抗坏血酸钠组(vc-na)(添加0.05％的抗坏血酸钠)进行比较。
1)ph值的测定
参照gb/t9695.5-2008进行。取10g样品研碎后加入具塞锥形瓶中，再加入90ml蒸馏水，25℃恒温摇床振摇30min后，过滤，测ph值。
表2样品对蒸煮肠贮存过程中ph的影响
备注：同行差异用不同字母a,b,c,d,e表示，同列差异用不同字母a,b,c,d,e表示
由表可以看出，添加剂中、高剂量组ph值下降速度均低于空白组和vc-na组，表明本发明制备的添加剂可有效延缓蒸煮肠酸败。
2)添加剂对蒸煮肠脂质氧化的抑制作用
①蒸煮肠中过氧化值(pov)的测定
参照gb/t5009.37-2003，以吸光度a为纵坐标，fe的浓度(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，对该标准曲线进行线性回归后，得线性回归方程y＝0.295c+0.0008(r2＝0.9998)，线性检测范围为0.2～4μg/ml。
称取2g蒸煮肠样品，加入15ml冰冷的氯仿甲醇溶液(chcl3:ch3oh＝7:3)，13000r/min下均质30s，加入3ml的nacl(0.5％)溶液，在4℃下3000r/min离心10min。取下层溶液5ml到具塞比色管中，加入5ml冰冷的氯仿甲醇溶液(chcl3:ch3oh＝7:3)，再加入50μl的fecl2(3.5g/l)，摇匀后，再加入50μl的硫氰酸钾(300g/l)，混匀，静置5min后，测500nm处吸光度值，根据标准曲线计算蒸煮肠中的过氧化值(pov)。
②硫代巴比妥酸值的测定
参照gb5009.181-2016进行样品处理。称取5g蒸煮肠样品于100ml具塞锥形瓶中，加入50ml三氯乙酸混合液，摇匀，在50℃恒温摇床振摇30min。取出，冷却至室温，用双层慢速滤纸过滤，弃去初滤液。取续滤液5ml置于含5ml硫代巴比妥酸(tba，0.02mol/l)溶液中，另取5ml三氯乙酸混合液作为样品空白，摇匀，置于90℃水浴中反应30min，冷却至室温，测532nm处吸光度值。同时绘制标准曲线，并对标准曲线进行线性回归，得线性回归方程：y＝0.7798c+0.0005(r2＝1)，线性检测范围为0.0179-0.6265μg/ml。利用标准曲线计算蒸煮肠中的硫代巴比妥酸值(tbars)。
表3添加剂对蒸煮肠贮存过程中脂质氧化的抑制作用
备注：同行差异用不同字母a,b,c,d,e表示，同列差异用不同字母a,b,c,d,e表示
从表中可以看出，本发明制备的添加剂可有效抑制蒸煮肠中脂肪氧化初级产物(pov值)及终产物丙二醛(tbars值)的形成。提示本发明制备的添加剂可延缓蒸煮肠中脂肪的氧化变质。
3)添加剂对蒸煮肠蛋白质氧化的抑制作用
参照gb5009.228-2016中第一法进行。称取10g样品置于250ml的具塞锥形瓶中，加入100ml的去离子水，摇匀，静置30min后，过滤。取滤液10ml于半微量凯氏定氮装置的小玻管中，再加入5ml氧化镁混悬液(10g/l)，同时向接受瓶内加入10ml硼酸溶液(20g/l)和5滴混合指示剂(1g/l甲基红乙醇溶液与1g/l的溴甲酚绿乙醇溶液按1:5混合)蒸馏1min。以0.01mol/l的盐酸标准溶液滴定到紫红色。根据消耗盐酸的量计算蒸煮肠中挥发性盐基氮(tvb-n)的含量。
表4添加剂对蒸煮肠蛋白质氧化的抑制作用
备注：同行差异用不同字母a,b,c,d,e表示，同列差异用不同字母a,b,c,d,e表示
结果：本发明制备的添加剂能有效减少蒸煮肠中蛋白质的氧化产物tvb-n的生成，提示本发明制备的添加剂能有效抑制蒸煮肠中蛋白质的氧化腐败。
4)添加剂对蒸煮肠中亚硝酸盐的清除作用
称取1g样品，加入2.5ml饱和硼砂溶液，制成匀浆，用60ml的去离子水(70℃)洗入100ml的容量瓶中，于沸水浴中提取15min，冷却至室温。再加入106g/l的亚铁氰化钾溶液1ml和220g/l的乙酸锌溶液1ml，加水到刻度，摇匀。静置30min后，除去上层脂肪，取上清液，用定量慢速滤纸过滤。
吸取滤液20ml置于25ml的具塞比色管中，加入0.4％对氨基苯磺酸1ml，摇匀、静置。5min后，加入0.2％盐酸萘乙二胺0.5ml，加水到刻度，摇匀、静置15min。于538nm下测定吸光度值。同时绘制亚硝酸钠标准曲线。
表5添加剂对蒸煮肠中亚硝酸盐的清除作用
备注：同行差异用不同字母a,b,c,d,e表示，同列差异用不同字母a,b,c,d,e
结果：本发明制备的添加剂可有效降低蒸煮肠中亚硝酸盐的残留量，减少亚硝酸盐的危害。