利用壳寡糖改善橙皮苷水溶性和抗氧化性的方法与流程

本发明属于食品加工领域，涉及橙皮苷，尤其是一种利用壳寡糖改善橙皮苷水溶性和抗氧化性的方法。

背景技术：

橙皮苷属于黄酮类化合物，广泛存在于柑橘类果实中，具有抗氧化、防癌、降低血管脆性和人体胆固醇含量等功效，是治疗心血管病药物的重要原料。但由于橙皮苷难溶于水，使得它在功能性食品以及制药等领域的应用受到限制。壳寡糖是一种来源丰富的天然高分子，是天然糖中唯一带正电的碱性氨基多糖，具有抗氧化、抑菌、抗糖尿病、抗肿瘤等多种生物活性作用。

多酚和多糖间可以发生非共价和共价的相互作用，多糖能够增强多酚的抗氧化、降血糖、预防心血管疾病、抗凝血等生物活性，并影响多酚生物利用率，能够改善食品风味以及营养价值，抑制氧化以及褐变等。

目前利用壳寡糖改善橙皮苷的溶解性和抗氧化性的研究还未见报道。本发明利用天然多糖改变天然多酚，利用微包埋技术制备两者的复合物，促进天然产物在各个领域的利用率。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供利用壳寡糖改善橙皮苷水溶性和抗氧化性的方法，以橙皮苷和壳寡糖为原料，根据二者活性成分和结构的特点，通过微包埋技术制备橙皮苷和壳寡糖的复合物。测试复合物的水溶性和抗氧化能力均得到显著提高，结果显示了良好的可行性和可重复性。这为橙皮苷在功能性食品，医药和化妆品等领域的创新性应用提供了新的思路。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种利用壳寡糖改善橙皮苷水溶性和抗氧化性的方法，将壳寡糖与橙皮苷按一定比例混合制成橙皮苷-壳寡糖复合物。

而且，所述的橙皮苷-壳寡糖复合物中橙皮苷与壳寡糖的摩尔比为1:1～10。

而且，所述的壳寡糖的分子量为480-980da。

而且，橙皮苷-壳寡糖复合物的制备方法为：将橙皮苷与壳寡糖按比例混合后、离心、取上清液、喷雾干燥制得。

具体步骤如下：

⑴分别配制橙皮苷溶液、壳寡糖溶液，将两者混合，在振荡器上振荡(5～30)min；

⑵混合液在(15～30)℃，以1,000g离心(5～20)min后取上清；

⑶将上清液在(80～120)℃、(0.5～5)l/h的条件下进行喷雾干燥，得到橙皮苷-壳寡糖复合物。

本发明还保护橙皮苷-壳寡糖复合物在功能性食品、医药、化妆品等领域的应用。

本发明的优点和积极效果是：

1、通过高效液相色谱法测定可知，将壳寡糖加入橙皮苷制成橙皮苷-壳寡糖复合物(1:10)，显著增加了橙皮苷在水中的溶解度(3.8倍)。

2、通过对复合物的抗氧化能力进行分析得出，橙皮苷-壳寡糖复合物对abts+与dpph的清除率均明显优于橙皮苷。

3、橙皮苷来源广泛，是天然的抗氧化剂，在功能性食品及医药领域具有广泛的应用前景。因此，改善橙皮苷的水溶性对增加其生物利用率和扩展其应用具有重大的研究意义。本发明采用喷雾干燥的方法制备橙皮苷-壳寡糖复合物，并采扫描电镜、红外、热重等分析技术对该复合物的理化性质进行研究。结果表明橙皮苷与壳寡糖通过氢键或范德华力的非共价键作用形成了稳定的复合物。经高效液相色谱法分析可知，复合物使得橙皮苷在水中的溶解度得到显著提高并且复合物对自由基的清除作用大大增强。这为橙皮苷在功能性食品，医药和化妆品等领域的创新性应用提供了新的思路，尤其是在功能性食品领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为橙皮苷与摩尔比分别为1：1，1：5，1：10的橙皮苷-壳寡糖复合物的红外谱图；

图2a为橙皮苷的扫描电镜图；

图2b为橙皮苷-壳寡糖复合物扫描电镜图(橙皮苷与壳寡糖摩尔比为1：1)；

图2c为橙皮苷-壳寡糖复合物扫描电镜图(橙皮苷与壳寡糖摩尔比为1：5)；

图2d为橙皮苷-壳寡糖复合物扫描电镜图(橙皮苷与壳寡糖摩尔比为1：10)；

图3为橙皮苷与摩尔比分别为1：1，1：5，1：10的橙皮苷-壳寡糖复合物的核磁共振图；

图4为为橙皮苷与摩尔比分别为1：1，1：5，1：10的橙皮苷-壳寡糖复合物的水溶性对比图；

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

材料与试剂

橙皮苷(mw610.5da)，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；壳寡糖(mw980da)，购于浙江金壳药业有限公司；2，2连氨基双二铵盐(abts)、2，4，6-三吡啶基三嗪(tptz)、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(trolox)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)均购于美国sigma公司；甲酸(分析纯)、甲醇(分析纯)、无水乙醇(分析纯)，均购于天津光复科技发展有限公司；重水(d2o)上海迈瑞尔化学技术有限公司。

仪器与设备

yc-015实验型喷雾干燥机上海雅程仪器设备有限公司；tgl-16a型高速冷冻离心机长沙平凡仪器有限公司；xw-80微型涡流混合仪上海泸西分析仪器有限公司；ts50傅立叶变换近红外光谱仪thermofisher公司；su510扫描电子显微镜400mhz核磁共振波谱仪德国布鲁克科技有限公司；高效液相色谱仪安捷伦科技有限公司

实施例1：

一种橙皮苷-壳寡糖复合物，包括橙皮苷、壳聚糖，橙皮苷与壳寡糖的摩尔比为1:1。制备方法如下：

(1)以橙皮苷和壳寡糖(分子量480-980da)为原料；

(2)用超纯水分别配制2mm的橙皮苷溶液和2mm的壳寡糖溶液，两者等体积混合，在旋涡振荡器上振荡10min；

(3)混合液在20℃，以1,000g转速离心10min后取上清；

(4)将上清液进行喷雾干燥(进风温度100℃，1l/h)，得到的成品即橙皮苷-壳寡糖复合物；

(5)对复合物进行分子结构解析(nmr,ftir,sem,tg)，评价复合物的水溶性和抗氧化性，并从分子结构层面解释水溶性和抗氧化性的变化机理。

实施例2：与实施例1不同的是橙皮苷与壳寡糖的摩尔比为1:5。

实施例3：与实施例1不同的是橙皮苷与壳寡糖的摩尔比为1:10。

红外扫描分析

取适量的纯橙皮苷、纯壳寡糖、橙皮苷-壳寡糖的复合物，分别用溴化钾压片后，置于ts50型红外光谱仪中记录其红外光谱。结果见图1。

扫描电镜分析

将导电胶粘于铜板上，分别取适量的纯橙皮苷、纯壳寡糖、橙皮苷-壳寡糖复合物均匀涂布在导电胶上，然后用常规真空喷镀法喷金90s后，将铜板置于扫描电镜下分别对样品进行显微拍摄。结果见图2。

核磁共振氢谱分析

分别将纯橙皮苷、摩尔比为1：1、1：5、1：10的橙皮苷-壳寡糖复合物，溶于重水，采用德国-瑞士bruker400mhz核磁共振波谱仪分析橙皮苷及其复合物的¹h-nmr。核磁共振光谱获得的单脉冲序列参数设置如下：取样时间2.18s，扫描次数16次、延迟时间15s，采样温度为25℃，其他参数为仪器内设值。结果见图3。

dpph清除率测定

取测定液0.5ml，加入2ml2×10^-4mol/ldpph，再加入2.5ml无水甲醇，充分混合，避光静置30min，517nm测定其吸光度a1。同时测定2ml2×10^-4mol/ldpph溶液与3ml无水甲醇混合液的吸光度a2，以及0.5ml测定液与4.5ml无水甲醇混合液的吸光度a0。按照以下公式计算dpph清除率：

a0测定液的本底吸光度；a1，加测定液后的吸光度；a2，未加测定液的吸光度。

abts+清除率的测定

7mmol/l的abts+溶液与2.45mmol/l的过硫酸钾溶液以体积比2：1混合，在室温下置于暗处反应16h，形成abts自由基储备液。abts储备液使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求稀释到30℃，734nm波长下的吸光度为0.70±0.02。取测定液0.2ml，加入5mlabts+工作液，充分混合，室温下反应10min，于734nm测定其吸光度a1。以无水乙醇代替测定液、abts工作液做空白、对照。按照以下公式计算abts+清除率：

a0,未加abts+工作液，测定液的本底吸光度；a1，加测定液后的吸光度；a2未加测定液，abts+工作液的吸光度。

由图1可知，与橙皮苷相比，橙皮苷-壳寡糖复合物在3423.7cm^-1位置出现的-oh特征吸收峰有所增强，在2935cm^-1位置出现的c-h的特征吸收峰有所增强；复合物在1276.82、1205cm^-1位置出现的芳香醚基(＝c—o—c)的特征吸收峰有所减弱；1095、1069cm^-1位置的甲氧基吸收峰有所增强。橙皮苷的红外图谱具有酚羟基(3478cm^-1)，苯环(1445、1520、1470、1607cm^-1)，芳香醚基(1276.82、1205cm^-1)、羰基(1649cm^-1)的特征吸收峰，而在复合物中这些特征峰消失不见。橙皮苷-壳寡糖复合物的红外光谱发生了上述显著的区别，而不同比例的橙皮苷-壳寡糖复合物之间红外光谱并没有太大的变化。橙皮苷的红外光谱吸收峰强度发生变化甚至消失与芳香醚基的拉伸与变形有关，这说明，橙皮苷壳和寡糖发生了分子间的相互作用生成了有新的复合物，使得复合物具有与橙皮苷不同的红外吸收峰谱。

图2为各样品的扫描电镜图，放大倍数均为800倍。从图2中可以发现，橙皮苷壳寡糖颗粒呈现针状结晶凝集而成的球状结构，壳寡糖颗粒呈实心的球状结构，而橙皮苷-壳寡糖复合物均呈明显的片状结构，其形态与橙皮苷、壳寡糖的电镜外观相比发生了非常显著的变化。说明在喷雾干燥的过程中，橙皮苷-壳寡糖相互结合成新的物质，使得外观发生了变化。

随着复合物中壳寡糖摩尔比的增加，橙皮苷中质子h2′，5′，6′(0.018–0.033ppm)；h6，h8(0.007–0.044ppm)和h2(0.010–0.041ppm)的化学位移变化值δδ也在增大(图3)，这是由于橙皮苷和壳寡糖分子之间的相互靠近，从而改变了橙皮苷质子在磁场中的环境而引起的。从δδ值可推断，橙皮苷中h6，h8所在的a环、h2所在的c环比h2′，5′，6′所在的b环更加接近壳寡糖分子。由核磁共振结果分析可知，橙皮苷-壳寡糖复合物的稳定性主要靠橙皮苷芳香环上的羟基(-oh)和壳寡糖的羟基(-oh)之间的氢键来进行维系。

表1为橙皮苷与壳寡糖的摩尔比分别为1:1，1:5，1:10的橙皮苷-壳寡糖复合物抗氧化活性比较。

表1

抗氧化分析

橙皮苷具有良好的抗氧化能力，为了研究橙皮苷-壳寡糖复合物对自由基的清除能力，我们对不同摩尔比例的复合物进行了dpph、abts+自由基清除能力的分析。结果如表1所示，橙皮苷-壳寡糖复合物对dpph的清除率(11.22％-13.55％)与橙皮苷对dpph的清除率(10.60％)相比有所增加，复合物对abts+的清除率(23.8％-25.03％)与橙皮苷对abts+的清除率(19.19％)显著提高，并随着壳寡糖添加量的增加，复合物对自由基清除能力有所提高。有研究表明，黄酮类化合物的抗氧化能力与其结构有直接关系，橙皮苷的抗氧化能力高并且与其在a和c环中提供儿茶酚样结构的5-oh和4-keto的类黄酮相当，这说明，橙皮苷-壳寡糖复合物中橙皮苷的结合位点a，c环发生的结构变化使得复合物抗氧化能力有所提高。然而，表中复合物的抗氧化能力相比壳寡糖要弱，从另一方面也说明复合物的抗氧化能力的提高可能是由于复合物中新引入的壳寡糖中亲水的羟基基团的缘故。

采用高效液相色谱仪测定橙皮苷含量。分别将橙皮苷及橙皮苷-壳寡糖复合物溶于超纯水中，涡旋振荡5min后，放入37℃得培养箱1h，以10，000r/min的转速离心10min，取上清液。色谱柱：xterrarp18column(∮4.6mm×250mm)对样品进行分离；流动相溶剂a：0.1％甲酸水溶液，溶剂b：甲醇溶液(含0.1％甲酸)；梯度洗脱(0—5min，100：0；10.01—30min，0：100；30.01—40min，100：0)，进样量为20l，检测波长为280nm。通过对比橙皮苷的峰面积与相应的标准样品制备的标准曲线计算橙皮苷的含量。

溶解度分析

将壳寡糖加入橙皮苷中大大增加了橙皮苷在水中的溶解度(复合物1：1、1：5、1：10中橙皮苷溶解度分别是纯橙皮苷的1.6倍、2.7倍、3.8倍)如图4所示，并且随着壳寡糖比例的增大，橙皮苷的溶解度也变大。橙皮苷溶解度增大的一个主要原因是由于壳寡糖打乱橙皮苷原有的结晶并与橙皮苷结合为橙皮苷－壳寡糖复合物，使其自身疏水结晶结构的降低。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。