本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及一种食用菌固态发酵大豆粕制备饲用级蛋白添加剂的方法。
背景技术：
大豆作为重要的经济作物，是我国主要的食用油来源之一。大豆粕是大豆经过榨油工艺处理后剩余的残留物，因其较高的营养价值、相对完善的营养结构以及不含不饱和脂肪酸等特点常常被作为蛋白源添加在饲料中。与其他榨油植物的加工剩余物相比大豆粕的主要优势体现在其较高的产量、较低的碳氮比以及相对完整的氨基酸组成。然而，在饲料工业的实际生产中，大豆粕的应用却受到诸多制约。作为水产饲料的蛋白源时，大豆粕的含量通常不得超过20％；作为牲畜饲料的蛋白源时，大豆粕不应用于幼年动物的饲养。限制大豆粕在饲料加工业广泛应用的主要原因是未经处理的豆饼、豆粕中含有抗胰蛋白酶、尿毒酶、皂角苷、甲状腺肿诱发因子等，对动物及饲料的消化利用会产生不良影响。
灰盖鬼伞菌作为典型的模式真菌之一具有生命周期短、代谢以及基因组学背景清晰等特点，其菌丝体与幼年子实体均可食用。与单细胞益生菌相比，可食用真菌的菌丝具有更强的鲁棒性与改造培养基基质的能力。
技术实现要素：
为了解决大豆粕固态发酵工艺的技术问题，本发明提供了一种食用菌固态发酵大豆粕制备饲用级蛋白添加剂的方法，该方法以灰盖鬼伞菌为基础发酵菌株，通过固态混合发酵工艺提高大豆粕的饲料系数，制备以大豆粕为原料的饲用蛋白添加剂。
本发明的技术方案为：一种食用菌固态发酵大豆粕饲用级蛋白添加剂，以灰盖鬼伞菌为主要发酵菌株固态发酵大豆粕制备得到饲用级蛋白添加剂，所述的饲用级蛋白添加剂中胰蛋白酶抑制因子≤0.25(mg···g-1)-1，蛋白大小降低至20kd以下的百分比＞45％，组氨酸含量占干物质的质量百分比≥4％，同时富含原料中缺乏的维生素a、b1、b2多种维生素以及粗多糖，其中，维生素a含量为0.40-0.90mg/100g；维生素b1含量为0.50mg-0.10/100g；维生素b2含量为0.50mg-0.90/100g；粗多糖含量为120-180mg/100g。
具体是以灰盖鬼伞菌为主要发酵菌株液体发酵制备一级菌种，一级菌种再以麦粒为主要原料固态发酵制备二级菌种，二级菌种再固态发酵大豆粕得到饲用级蛋白添加剂。
以灰盖鬼伞菌为主要发酵菌株，同时针对不同饲养对象的不同氨基酸需求，添加以下灰盖鬼伞菌共生菌株中的一种或数种作为辅助发酵菌株：米曲霉、纳豆芽孢杆菌、产朊假丝酵母以及兼性厌氧乳酸菌。
制备所述的食用菌固态发酵大豆粕饲用级蛋白添加剂的方法，以灰盖鬼伞菌为主要发酵菌株液体发酵制备一级菌种，一级菌种再以麦粒为主要原料固态发酵制备二级菌种，二级菌种再固态发酵大豆粕得到饲用级蛋白添加剂。
所述的制备食用菌固态发酵大豆粕饲用级蛋白添加剂的方法，包括下述的步骤：
d)一级菌种的制备：灰盖鬼伞菌母种在pda平板上活化，接种发酵培养基，25-35℃，100-150r/min恒温震荡培养72-96小时；
e)二级菌种的制备：一级菌种活化完成后，接种麦粒培养基，25-35℃，静置培养，96-120小时；
f)大豆粕发酵：大豆粕培养基灭菌并冷却至室温，按大豆粕培养基物料质量的5％-10％接入准备好的二级菌种，于25-35℃发酵48-96小时，干燥后得到饲用级蛋白添加剂。
所述步骤a中，发酵培养基是按质量百分比向马铃薯标准培养基内添加硫酸镁0.1％-0.3％以及氯化钙1％-3％。
所述步骤b中，麦粒培养基以质量百分比计组成为：成熟新鲜的带麸皮小麦粒40-50％、葡萄糖1-3％、酵母膏0.1％-0.5％、硫酸镁0.1-0.3％、氯化钙1-3％其余为水。
所述步骤c中，大豆粕培养基以质量百分比计组成为：大豆粕35-45％、玉米粉3-5％、小麦麸皮1-5％、蔗糖1-2％、碳酸钙2-5％、硫酸镁0.1-0.3％其余为水。
所述的大豆粕为粒径小于等于20目的。
有益效果
经发酵处理后，大豆粕中的抗营养因子显著降低，蛋白分子量降低、致敏性降低、营养价值提高、适口性提高。具体表现为：胰蛋白酶抑制因子降低90％以上，蛋白大小降低至20kd以下，组氨酸含量提高200％以上，同时富含维生素a、b、d、e，以及矿物元素与粗多糖。
灰盖鬼伞分泌的抑菌蛋白具有破坏原核生物细胞壁的能力，在豆粕发酵以及存储过程中安全、稳定地抑制有害微生物的生长代谢。
本发明采用的一级菌种培养基可用于本发明使用的多种微生物单独或混合发酵；采用的二级菌种培养基为半天然固体培养基，该培养基可有效保持菌种活力、防止菌种早衰。
本发明提供的一种食用菌固态发酵大豆粕制备饲用级蛋白添加剂的方法制备的发酵大豆粕表面颜色洁白、质感强韧、具有鬼伞菌菌丝体特有的清香，同时大量菌丝体形成的疏水结构使其得以长时间漂浮水面、不宜分散，是极佳的渔用蛋白饲料来源。
以灰盖鬼伞为基础发酵菌株制备的发酵大豆粕与传统霉菌或单细胞益生菌发酵豆粕相比具有以下优势：首先，其氨基酸模式得到优化，解除了特定条件下必须氨基酸缺乏带来的营养短板效应；其次，以胰蛋白酶抑制剂为代表的拮抗物质显著降低，提高了蛋白质消化吸收率；最后，该工艺制备的发酵大豆粕颜色洁白、气味清香、不易粘连、不易吸潮。综上所述，该发酵工艺能够满足饲料添加剂工业对于营养、风味、安全的要求，填补了饲用发酵大豆粕市场的空白。
具体实施方式
本发明的食用菌固态发酵大豆粕制备饲用级蛋白添加剂的方法，以灰盖鬼伞菌为基础发酵菌株，根据饲养对象不同的氨基酸需求添加米曲霉、纳豆芽孢杆菌、产朊假丝酵母以及兼性厌氧乳酸菌中的一种或几种作为辅助发酵菌株，通过液态混合发酵与固态混合发酵两个步骤改善大豆粕的营养学性能。
包括下述的步骤：
a)一级菌种的制备：母种在pda平板上活化，接种发酵培养基，25-35℃，100-150r/min恒温震荡培养72-96小时。发酵培养基是按质量百分比向马铃薯标准培养基内添加硫酸镁0.1％-0.3％以及氯化钙1％-3％，如不添加硫酸镁和氯化钙则会影响发酵效果，马铃薯浸提液90％-96％、葡萄糖1％-2％、酵母膏0.3％、。
b)二级菌种的制备：一级菌种活化完成后，接种麦粒培养基，25-35℃，静置培养，96-120小时。
c)大豆粕发酵：大豆粕培养基灭菌并冷却至室温，按大豆粕培养基物料质量的5％-10％接入准备好的二级菌种，于25-35℃发酵48-96小时。成品饲用级蛋白添加剂中胰蛋白酶抑制因子≤0.25(mg···g-1)-1，蛋白大小降低至20kd以下的百分比＞45％，组氨酸含量占干物质的质量百分比≥4％，较原料豆粕提高250％-400％；同时富含原料中缺乏的维生素a、b1、b2等多种维生素以及粗多糖。其中，维生素a由0mg/100g提高至0.40-0.90mg/100g；维生素b1由0.45mg/100g提高至0.50mg-0.10/100g；维生素b2由0.2mg/100g提高至0.50mg-0.90/100g；粗多糖由75mg/100g提高至120-180mg/100g。
本发明的灰盖鬼伞菌购买自美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection)，保藏编号为atcc18450，保藏中心地址为americantypeculturecollection(atcc),p.o.box1549,manassas,va20108usa；米曲霉购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc2014，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号；纳豆芽孢杆菌购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc10023，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号；产朊假丝酵母购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc1314，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号；乳酸菌购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc21790，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号。
实施例1
单一菌种灰盖鬼伞菌发酵大豆粕制作饲用蛋白添加剂
灰盖鬼伞菌购买自美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection)，保藏编号为atcc18450，保藏中心地址为americantypeculturecollection(atcc),p.o.box1549,manassas,va20108usa。
母种选用pda平板上活化后灰盖鬼伞菌菌丝体，接种于一级种子培养基，35℃，150r/min恒温震荡培养96小时。一级菌种活化完成后，以10％接种量接种麦粒培养基，35℃，静置培养，120小时。大豆粕培养基灭菌并冷却至室温，按大豆粕培养基物料质量的10％接入准备好的二级菌种，于35℃发酵96小时。50℃干燥6小时。
表1发酵指标
实施例2
灰盖鬼伞菌与纳豆芽孢杆菌混合发酵大豆粕制作饲用蛋白添加剂
灰盖鬼伞菌购买自美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection)，保藏编号为atcc18450，保藏中心地址为americantypeculturecollection(atcc),p.o.box1549,manassas,va20108usa；米曲霉购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc2014，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号。
母种选用pda平板上活化后灰盖鬼伞菌菌丝体以及米曲霉菌体，接种于一级种子培养基，32℃，150r/min恒温震荡培养72小时。一级菌种活化完成后，以10％接种量接种麦粒培养基，32℃，静置培养，96小时。大豆粕培养基灭菌并冷却至室温，按大豆粕培养基物料质量的10％接入准备好的二级菌种，于32℃发酵96小时。50℃干燥6小时。
表2发酵指标
实施例3
灰盖鬼伞菌、乳酸菌混合发酵大豆粕制作饲用蛋白添加剂
灰盖鬼伞菌购买自美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection)，保藏编号为atcc18450，保藏中心地址为americantypeculturecollection(atcc),p.o.box1549,manassas,va20108usa；乳酸菌购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc21790，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号。
母种选用pda平板上活化后灰盖鬼伞菌菌丝体以及mrs培养基中活化的乳酸菌菌体，接种于一级种子培养基，32℃，100r/min恒温震荡培养96小时。一级菌种活化完成后，以10％接种量接种麦粒培养基，32℃，静置培养，120小时。大豆粕培养基灭菌并冷却至室温，按大豆粕培养基物料质量的10％接入准备好的二级菌种，于32℃发酵72小时。50℃干燥6小时。
表3发酵指标
实施例4
灰盖鬼伞菌与产朊假丝酵母混合发酵大豆粕制作饲用蛋白添加剂
灰盖鬼伞菌购买自美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection)，保藏编号为atcc18450，保藏中心地址为americantypeculturecollection(atcc),p.o.box1549,manassas,va20108usa；产朊假丝酵母购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc1314，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号；乳酸菌购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc21790，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号。
母种选用pda平板上活化后灰盖鬼伞菌菌丝体以及lb培养基活化的产朊假丝酵母，接种于一级种子培养基，35℃，150r/min恒温震荡培养96小时。一级菌种活化完成后，以10％接种量接种麦粒培养基，35℃，静置培养，120小时。大豆粕培养基灭菌并冷却至室温，按大豆粕培养基物料质量的10％接入准备好的二级菌种，于35℃发酵96小时。50℃干燥6小时。
表1发酵指标
实施例5
灰盖鬼伞菌、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌与产朊假丝酵母共发酵大豆粕制作饲用蛋白添加剂
灰盖鬼伞菌购买自美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection)，保藏编号为atcc18450，保藏中心地址为americantypeculturecollection(atcc),p.o.box1549,manassas,va20108usa；米曲霉购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc2014，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号；纳豆芽孢杆菌购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc10023，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号；产朊假丝酵母购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc1314，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号；乳酸菌购买自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc21790，保藏中心地址为北京市朝阳区霄云路32号。
母种选用pda平板上活化后灰盖鬼伞菌菌丝体以及米曲霉菌体、mrs培养基活化的乳酸菌以及lb培养基活化的产朊假丝酵母，接种于一级种子培养基，35℃，150r/min恒温震荡培养96小时。一级菌种活化完成后，以10％接种量接种麦粒培养基，35℃，静置培养，120小时。大豆粕培养基灭菌并冷却至室温，按大豆粕培养基物料质量的10％接入准备好的二级菌种，于35℃发酵96小时。50℃干燥6小时。
表5发酵指标
采用本发明制备的发酵大豆粕气味清香、适口性好，保留原料大豆粕固有营养成分不被破坏的同时大大降低其拮抗因子水平。此外大豆粕中所含蛋白大多被转化为小肽的形式，使得其固有抗原蛋白失活，避免了在哺乳动物幼崽进食过程中易引发的免疫反应问题。