本发明涉及一种利用保加利亚乳杆菌强化酵素功效的方法，属于发酵食品技术领域。
背景技术：
植物酵素是以蔬菜、水果等植物为原料，经酵母菌、醋酸菌、乳杆菌等多种微生物共同发酵而成的一种含有丰富的酶、维生素、矿物质和多种次生代谢产物的微生物制剂。植物酵素也称为酵素。酵素不同于普通酶制剂，由于具有促进消化、润肠通便、抗氧化、抑菌、抑制肿瘤等多种功能，是一种具有很高市场价值的保健产品。现有很多天然植物酵素具有很多限制性因素，如易染杂菌，口感或风味不佳，发酵周期长，难以控制产品质量，受环境影响较大。因此，提高产品抗氧化能力、提高酵素的口感和风味、增强抑菌作用的酵素制备方法，更有利于酵素的工业化生产。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种同时提高果蔬酵素功能因子和风味的方法，所述方法是向以果蔬为原料的酵素中接种酵母菌、葡糖醋杆菌和乳酸菌进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)n85，葡糖醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)q1和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrain)b1，b2。
第二个目的是提供一种益生菌酵素，是以蔬菜和水果为原料，接种酵母菌、葡糖醋杆菌和乳酸菌共同发酵制备而成。
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌酵素是以蔬菜和水果为原料，接种酿酒酵母、葡糖醋杆菌和德氏乳杆菌共同发酵制备而成。
在本发明的一种实施方式中，所述蔬菜和水果包括火龙果、苹果、西红柿和黄豆，
在本发明的一种实施方式中，所述所述酿酒酵母为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)n85，葡糖醋杆菌为木糖葡糖醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)q1，乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrain)b1或德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrain)b2。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母n85为工业化菌株，已公开于2016年题为《代谢工程改造黄酒酿造用酵母低产氨基甲酸乙酯的研究》的论文中。
在本发明的一种实施方式中，所述葡糖醋杆菌q1已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2014353。
在本发明的一种实施方式中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种b1已于2017年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2017370，保藏地址中国武汉，武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种b2来源于内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库(labcc)，编号为labccimau20094dbteml12-2-2。
在本发明的一种实施方式中，所述酵素按下述步骤制备：(1)以火龙果、苹果、西红柿和黄豆为原料，加入原料质量百分比为15～20％的葡萄糖，再加入原料质量百分比为100％的水，充分搅拌均匀；(2)按体积计，接种1％的酵母菌和2％的醋酸菌，置于35～37℃恒温培养，每20～24小时搅拌一次，发酵至第3～4天，接种3～5％的乳酸菌，28～30℃恒温密闭培养，发酵至第12～15天结束发酵。
本发明的第三个目的是提供一种酵素功效的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)以火龙果、苹果、西红柿和黄豆为原料，加入原料质量百分比为15～20％的葡萄糖，再加入原料质量百分比为100％的水，充分搅拌均匀；(2)按体积计，接种1％的酵母菌和2％的醋酸菌，置于35～37℃恒温培养，每20～24小时搅拌一次，发酵至第3～4天，接种5％的乳酸菌，30℃恒温密闭培养，发酵到第15天结束发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母菌、醋酸菌或乳酸菌的菌液浓度为1～9.9×107cfu/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母菌为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)n85。
在本发明的一种实施方式中，所述醋酸菌为葡糖醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)q1。
在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrain)b1或德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrain)b2。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤具体如下：(1)以火龙果、苹果、西红柿和黄豆等为原料，用热水清洗后，风干，切成小块状，准确称量等质量的几种果蔬，均匀混合，放入发酵容器中；(2)加入原料质量百分比为12～15％的葡萄糖，再加入水果质量百分比为100％的水，充分搅拌均匀；(3)添加1％的酵母菌和2％的醋酸菌，置于37℃恒温培养，保持单向排气，并24小时搅拌一次；菌液的浓度均为107cfu/ml；(4)发酵到第4天，添加5％的乳酸菌，30℃恒温密闭培养；菌液的浓度均为107cfu/ml；(5)发酵到第15天结束发酵。
有益效果：本发明通过向果蔬原料中添加酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)n85，葡糖醋杆菌(gluconacetobacter)q1和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrain)b1，强化了酵素的益生功效，还原力相比对照组提高了43.3％，dpph清除率也从88.25％提高到了93.09％，乳酸含量提高了36.1％，乙酸含量提高了35.2％。蛋白酶活力相比于对照组提高了11.9％，增加了挥发性物质的含量，乙酸乙酯含量提高了85.1％，乙酸戊酯含量提高了89.1％，使酵素具有特殊的果香味，并且提高了酵素抑菌能力，能够有效抑制枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和人葡萄球菌。
生物材料保藏
一株德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrain)b1已于2017年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2017370，保藏地址中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1为酪氨酸浓度标准曲线。
具体实施方式
具体实施方式中，黄酒工业用酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)n85已公开于2016年题为《代谢工程改造黄酒酿造用酵母低产氨基甲酸乙酯的研究》的论文中。葡糖醋杆菌(gluconacetobacter)q1，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2014353；德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrain)b1筛选自乳酪，已于2017年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2017370；德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrain)b2已于内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库(labcc)中保藏，保藏编号为labccimau20094dbteml12-2-2。
表1具体实施方式涉及的菌体培养条件
有机酸测定：取待测酵素酶液，用超纯水稀释十倍后，使用注射器将液体吸取，通过有机酸滤膜后，注入液相瓶中。并使用混酸标样定标。使用agilent1200高效液相色谱仪，进行有机酸种类和数量的测量。
dpph自由基清除能力测定：将酵素样品稀释5倍，取2ml样品加入到2ml0.1mg/ml的dpph-乙醇溶液中，充分混匀，25℃避光反应30min，以去离子水为参比溶液，在517nm条件下测定吸光度值，空白组以2ml无水乙醇代替试样。
dpph清除率(/％)＝[1-(a1-a2)/a0]×100
式中：a0为空白组的吸光度，a1为样品溶液的吸光度，a2为样品本底管的吸光度。
还原力的测定：采用铁氰化钾还原法进行测定。将待测酵素样品稀释5倍，取1ml稀释样品加入到装有1ml磷酸缓冲液(0.2mol/l，ph6.6)的试管中，加入2ml质量分数为1％的铁氰化钾，置于50℃水浴锅准确反应30min，加入2ml质量分数为10％的三氯乙酸，3000r/min离心10min，立即取2ml上清液，加入1ml质量分数为0.5％的三氯化铁和1ml去离子水，静置5min后，在700nm条件下测定吸光度值，吸光度值越大，表明还原力越强，同一测定重复两次。
蛋白酶活力的测定：酪氨酸标准曲线的测定：取6支试管分别吸取0、20、40、60、80、100ug/ml的酪氨酸溶液1ml，各加入0.4mol/l的碳酸钠溶液5ml，再加入已稀释3倍的福林试剂1ml。摇匀，置于40℃水浴锅保温发色20min，在波长660nm条件下测定吸光度值。测定三次，取平均值。以吸光度为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。在试管中加入1ml酵素酶液，置于40℃水浴锅中预热5分钟，然后加入1ml2％的酪蛋白溶液，精确计时反应10min，立即加入2ml0.4mol/l的三氯乙酸溶液，15min后用滤纸过滤，取1ml滤液，加5ml0.4mol/l的碳酸钠溶液和1ml福林试剂，40℃保温发色20min，在波长660nm下测定光密度值。根据标准曲线可换算成酪氨酸浓度。蛋白酶活力单位定义：在40℃，ph3.6条件下，每分钟水解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位。
式中：
x为反应液中的酪氨酸浓度；
v为反应液总体积(ml)；
t为反应时间(min)；
n为酶液稀释倍数；
w为酶液体积(ml)。
抑菌能力的测定：采用牛津杯法进行测定。将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿越20ml，凝固后在每皿培养基表面摆放4～6个牛津杯。同时，将已灭菌的半固体培养基(菌种培养基)加热完全融化，分装到已灭菌的50ml离心管中，每管约20ml。待半固体培养基冷却到45℃左右，分别接入稀释倍数为103、104、105、106的菌液100ul，混合均匀后，小心倒入放好牛津杯的培养皿中，要避免将培养基倒入牛津杯内。待培养基凝固后，小心取出牛津杯，在培养皿上就形成了一个个圆形的空环，在空环中加入100ul的待检样品或对照样品，在37℃静置培养16～18h。
挥发性物质测定：采用gc-ms进行测定。
实施例1
1.酵素原料制备：将火龙果、苹果、西红柿和黄豆用热水清洗后，置于洁净的工作台风干，切成小块状；称量每种果蔬各100g，均匀混合，放入发酵容器中，加入蔬果原料质量百分比15％的葡萄糖，再加入蔬果原料质量百分比为100％的水，充分搅拌均匀。
2.接种菌株：
活化菌株：将酿酒酵母n85，葡糖醋杆菌q1从-80℃冰箱取出，分别划线接种于相应培养基。
获得菌体：挑取固体培养基上的单菌落接种到液体培养基中，分别培养到对数生长期，10000rpm离心10min弃上清，用无菌生理盐水以生理盐水：菌液1:1的比例重悬，使菌浓达1～5×107cfu/ml。
接种：按体积计，添加1ml菌液/100g果蔬质量酿酒酵母n85和2ml菌液/100g果蔬质量的葡糖醋杆菌q1，置于37℃恒温密闭发酵，每24小时搅拌一次。
3.获得酵素酶液：发酵到第15天结束发酵，经10000r/min离心，上清为酵素液。
实施例2
1.酵素原料制备：将火龙果、苹果、西红柿和黄豆用热水清洗后，置于洁净的工作台风干，切成小块状；称量每种果蔬各100g，均匀混合，放入发酵容器中，加入蔬果原料质量百分比为15％的葡萄糖，再加入蔬果原料质量百分比为100％的水，充分搅拌均匀。
2.接种菌株：
活化菌株：将酿酒酵母n85和德氏乳杆菌保加利亚亚种b1，从-80℃冰箱取出，划线接种于相应培养基。
获得菌体：挑取固体培养基上的单菌落接种到液体培养基中，分别培养到对数生长期，10000rpm离心10min弃上清，用无菌生理盐水以生理盐水：菌液1:1的比例重悬，使菌浓达1～5×107cfu/ml。
接种：添加1ml菌液/100g果蔬质量的酿酒酵母n85，置于37℃恒温培养，保持单向排气，并24小时搅拌一次。发酵到第4天，添加5ml菌液/100g果蔬质量的德氏乳杆菌保加利亚亚种b1，30℃恒温密闭发酵。
3.获得酵素酶液：发酵到第15天结束发酵，经10000r/min离心，上清为酵素液。
实施例3.
1.酵素原料制备：将火龙果、苹果、西红柿和黄豆用热水清洗后，置于洁净的工作台风干，切成小块状；称量每种果蔬各100g，均匀混合，放入发酵容器中，加入蔬果原料质量百分比为15％的葡萄糖，再加入蔬果原料质量百分比为100％的水，充分搅拌均匀。
2.接种菌株：
活化菌株：将酿酒酵母n85和德氏乳杆菌保加利亚亚种b2，从-80℃冰箱取出，划线接种于相应培养基。
获得菌体：挑取固体培养基上的单菌落接种到液体培养基中，分别培养到对数生长期，10000rpm离心10min弃上清，用无菌生理盐水以生理盐水：菌液1:1的比例重悬，使菌浓达1～5×107cfu/ml。
接种：添加1ml菌液/100g果蔬质量的酿酒酵母n85，置于37℃恒温培养，保持单向排气，并24小时搅拌一次。发酵到第4天，添加5ml菌液/100g果蔬质量的德氏乳杆菌保加利亚亚种b2，30℃恒温密闭发酵。
3.获得酵素酶液：发酵到第15天结束发酵，经10000r/min离心，上清为酵素液。
实施例4.
1.酵素原料制备：将火龙果、苹果、西红柿和黄豆用热水清洗后，置于洁净的工作台风干，切成小块状；称量每种果蔬各100g，均匀混合，放入发酵容器中，加入蔬果原料质量百分比为15％的葡萄糖，再加入蔬果原料质量百分比为100％的水，充分搅拌均匀。
2.接种菌株：
活化菌株：将酿酒酵母n85、葡糖醋杆菌q1和德氏乳杆菌保加利亚亚种b1，从-80℃冰箱取出，划线接种于相应培养基。
获得菌体：挑取固体培养基上的单菌落接种到液体培养基中，分别培养到对数生长期，10000rpm离心10min弃上清，用无菌生理盐水以生理盐水：菌液1:1的比例重悬，使菌浓达1～5×107cfu/ml。
接种：添加1ml菌液/100g果蔬质量的酿酒酵母n85和2ml菌液/100g果蔬质量的葡糖醋杆菌q1，置于37℃恒温培养，保持单向排气，并24小时搅拌一次。发酵到第4天，添加5ml菌液/100g果蔬质量的德氏乳杆菌保加利亚亚种b1，30℃恒温密闭发酵。
3.获得酵素酶液：发酵到第15天结束发酵，经10000r/min离心，上清为酵素液。
实施例5.
1.酵素原料制备：将火龙果、苹果、西红柿和黄豆用热水清洗后，置于洁净的工作台风干，切成小块状；称量每种果蔬各100g，均匀混合，放入发酵容器中，加入蔬果原料质量百分比为15％的葡萄糖，再加入蔬果原料质量百分比为100％的水，充分搅拌均匀。
2.接种菌株：
活化菌株：将酿酒酵母n85、葡糖醋杆菌q1和德氏乳杆菌保加利亚亚种b2，从-80℃冰箱取出，划线接种于相应培养基。
获得菌体：挑取固体培养基上的单菌落接种到液体培养基中，分别培养到对数生长期，10000rpm离心10min弃上清，用无菌生理盐水以生理盐水：菌液1:1的比例重悬，使菌浓达1～5×107cfu/ml。
接种：添加1ml菌液/100g果蔬质量的酿酒酵母n85和2ml菌液/100g果蔬质量的葡糖醋杆菌q1，置于37℃恒温培养，保持单向排气，并24小时搅拌一次。发酵到第4天，添加5ml菌液/100g果蔬质量的德氏乳杆菌保加利亚亚种b2，30℃恒温密闭发酵。
3.获得酵素酶液：发酵到第15天结束发酵，经10000r/min离心，上清为酵素液。
对照例
1.酵素原料制备：将火龙果、苹果、西红柿和黄豆用热水清洗后，置于洁净的工作台风干，切成小块状；称量每种果蔬各100g，均匀混合，放入发酵容器中，加入蔬果原料质量百分比为15％的葡萄糖，再加入蔬果原料质量百分比为100％的水，充分搅拌均匀。
2.接种菌株：
活化菌株：将酿酒酵母n85从-80℃冰箱取出，划线接种于相应培养基。
获得菌体：挑取固体培养基上的单菌落接种到液体培养基中，分别培养到对数生长期，10000rpm离心10min弃上清，用无菌生理盐水以生理盐水：菌液1:1的比例重悬，使菌浓达1～5×107cfu/ml。
接种：添加1ml菌液/100g果蔬质量的酿酒酵母n85，置于37℃恒温密闭发酵，保持单向排气，并24小时搅拌一次。
3.获得酵素酶液：发酵到第15天结束发酵，经10000r/min离心，上清为酵素液。
对实施例1～5和对照例制备的酵素进行抗氧化性、有机酸含量、蛋白酶活、抑菌能力和挥发性物质测定。
抗氧化性能力测定结果如表2所示，经德氏乳杆菌保加利亚亚种b1强化后的酵素，抗氧化能力提高，其中还原力提高43.3％，dpph清除率由88.25％提高到了93.09％，而添加普通德氏乳杆菌保加利亚亚种b2的酵素还原力提高量和dpph清除率仅为21.2％和91.07％。
表2不同实施方式下酵素的抗氧化性能力
有机酸含量测定结果如表3所示，经德氏乳杆菌保加利亚亚种b1强化后的酵素，有机酸含量较未添加前均有所提高，其中乳酸含量提高了36.1％，乙酸含量提高了35.2％；添加德氏乳杆菌保加利亚亚种b2的酵素的乙酸和乳酸含量表现为减少，不利于产品的储存和保质。
表3不同实施方式下酵素的有机酸含量(g/l)
蛋白酶活测定结果如表4所示，酪氨酸标准曲线如图1，经德氏乳杆菌保加利亚亚种b1强化后的酵素，蛋白酶活提高11.9％。
表4不同实施方式下酵素的蛋白酶活
抑菌能力测定结果如表5所示，经德氏乳杆菌保加利亚亚种b1强化后的酵素，表现出了对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和人葡萄球菌的抑制作用，抑菌圈直径分别为15.3mm，16.6mm，14.3mm；而添加德氏乳杆菌保加利亚亚种b2的酵素不具有抑菌能力。
表5不同实施方式下酵素的抑菌能力(d/mm)
挥发性物质测定结果如表6所示，经德氏乳杆菌保加利亚亚种b1强化后的酵素，挥发性物质中，乙醇含量降低了20.1％，适宜更多人群食用，乙酸乙酯含量提高了85.1％，乙酸戊酯含量提高了89.1％，增添了水果香味；添加普通德氏乳杆菌保加利亚亚种的酵素乙醇含量相比于德氏乳杆菌保加利亚亚种b1增加了6.0％，乙酸乙酯含量降低了70.9％，风味不佳。
表6.不同实施方式下酵素的挥发性物质含量(g/l)
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。