本发明涉及水产养殖技术领域，具体地涉及以农产品加工下脚料和/或海产品加工下脚料为制作原料的水产养殖用益生菌饲料的制备方法。
背景技术：
生物发酵产品生产在国内已有一定年份了，大部分企业生产模式只是套用了传统酿造发酵技术，只能解决原料熟化问题，与真正意义上生物产品生产及产品内涵还有很大距离。
生物发酵产品是以农副产品和畜禽的废弃物(残渣、果核、果皮、秸杆、粪便等)，通过筛选、消毒杀菌、除害等初级措施后，应用传统技术或微生物发酵技术----酶工程、发酵工程、细菌分离培育工程等，制成免疫调节及微生态制剂用于水产品养殖、畜禽养殖的投入品，替代一部分饲料、无机肥料、营养保健品、药物。
农产品加工下脚料和海产品加工下脚料(或称为废弃物)，原本被抛弃荒野或海滩，严重污染环境。而其中又饱含丰富的营养物质，再利用价值极高，直接丢弃实在可惜。因此，将农产品加工下脚料和/或海产品加工下脚料利用生物发酵技术加工成水产养殖用饲料的技术具有极可贵的社会效益和经济价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种水产养殖用益生菌饲料的制备方法。本发明的方法以农产品加工下脚料和/或海产品加工下脚料为原料，利用生物发酵技术，制得水产养殖用益生菌饲料，实现了农海产品加工下脚料的回收再利用，不仅有利于保护环境，而且将极大缓解我国面临的制作饲料用的原材料短缺问题，势必产生极可贵的社会效益和经济价值。此外，用本发明方法制得的水产养殖用益生菌饲料还具有提高鱼类、贝类、虾蟹等养殖物种体质的作用，有效提高养殖产出。
本发明的技术方案：水产养殖用益生菌饲料的制备方法，包括以下步骤：
a.以农产品加工下脚料和/或海产品加工下脚料为发酵原料，对发酵原料进行粉碎，用40～60目的网筛进行筛选，备用；
b.向步骤a中筛选出的发酵原料中加入水，制得水分含量在55～65wt％之间的发酵物；
c.一次发酵：将发酵物置于发酵罐中，加入发酵剂，密封，控制发酵温度55～65℃，发酵时间20～30小时，制得二次发酵用的益生菌载体；本步骤中，发酵剂的用量为每吨发酵物使用1.5～2kg的发酵剂。
d.二次发酵制备A物料、B物料和C物料，具体如下：
i.向步骤c中制得的益生菌载体中喷洒嗜酸乳杆菌菌株，并搅拌均匀，常温厌氧发酵使嗜酸乳杆菌含量不低于6.0×107CFU/g，制得A物料；
ii.向步骤c中制得的益生菌载体中喷洒枯草芽孢杆菌菌株，并搅拌均匀，常温好氧发酵使枯草芽孢杆菌含量不低于6.0×107CFU/g，制得B物料；
iii.向步骤c中制得的益生菌载体中喷洒酿酒酵母菌株，并搅拌均匀，常温兼性发酵使酿酒酵母菌含量不低于6.0×107CFU/g，制得C物料；
e.将步骤d中制得的A物料、B物料和C物料按3～4：2～3：4的重量比例进行混合，制得产品。
与现有技术相比，本发明具有如下显著的进步：
(1)以农产品加工下脚料和/或海产品加工下脚料为原料制作水产养殖用益生菌饲料，变废为宝，不仅能够减少环境污染，而且能够极大缓解我国正面临的饲料加工用原材料短缺的问题；
(2)本发明通过采用厌氧发酵技术杀灭杂菌实现一次发酵制得益生菌载体，然后向益生菌载体中添加不同的益生菌菌株，并根据益生菌的习性，分别采用厌氧发酵、好氧发酵、兼性发酵方法，二次发酵制得三种富含不同习性益生菌的物料，然后将三种物料按照特定的比例混合，制得富含三种不同习性益生菌的益生菌饲料。经检验，用本发明方法制得的益生菌饲料中：益生菌原液不低于33wt％，有效活菌数≥6×107CFU/g；粗蛋白含量不低于48wt％，粗脂肪含量不低于15wt％，粗灰分含量不超过6wt％，糖分含量不低于6wt％；且富含钙、磷、钠、氯、镁、钾、硫等常量元素，铁、铜、锌、碘、锰、氟、铬、钼、硒等微量元素。将用本发明方法制得的益生菌饲料用于水产养殖，不仅能极大的丰富营养结构，显著提高鱼、虾、蟹等养殖物种的抗病害能力，从而获得更高的经济效益，且因制作过程没有使用任何化学品对原料进行杀菌消毒，可以提高水产品无公害水平，增加食品安全程度。
作为优化，前述的水产养殖用益生菌饲料的制备方法中，所述步骤a中，发酵原料包含85～90wt％的海产品加工下脚料，余量为农产品加工下脚料。试验表明，此时，制得的益生菌饲料中富含植物酶，可以进一步提高产品的抗病害功效。作为进一步优化，所述发酵原料中，海产品加工下脚料含量为90wt％，农产品加工下脚料含量为10wt％。作为更进一步的优化，所述农产品加工下脚料包含米糠、麸皮、玉米糠、薯渣、水果皮核中的一种或多种；所述海产品加工下脚料包含鱼加工下脚料、虾加工下脚料、海藻加工下脚料、贝类加工下脚料中的一种或多种。再进一步，所述农产品加工下脚料为红薯渣；所述海产品加工下脚料为南美白对虾加工下脚料。
作为优化，前述的水产养殖用益生菌饲料的制备方法中，所述步骤e中，A物料、B物料和C物料按4：2：4或3：3：4的重量比例进行混合，制得产品。按照上述比例配置的益生菌饲料能够获得较高的养殖产出。
作为优化，前述的水产养殖用益生菌饲料的制备方法中，所述步骤c中，发酵剂的用量为每吨发酵物使用2kg的发酵剂。
作为优化，前述的水产养殖用益生菌饲料的制备方法中，所述步骤d中，制备C物料时，先进行常温好氧发酵使酿酒酵母菌含量不低于5.5×107CFU/g，然后进行常温厌氧发酵使酿酒酵母菌含量不低于6.0×107CFU/g，制得C物料。
具体实施方式
下面结合具体实施方式(实施例)对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。以下用量单位“份”为重量份。
本发明方法的步骤a中，网筛目数越大，制得饲料颗粒就越小，但网筛目数过大，又会出现无法完成筛选的情况，试验表明，网筛目数在40～60之间既能保证饲料质量，又能保证筛选效率；发酵原料可以是农产品加工下脚料(如：米糠、麸皮、玉米糠、薯渣、水果皮核等)或海产品加工下脚料(如：虾头虾壳、渔皮骨、海带渣、牡蛎粉等)，也可以是农产品加工下脚料和海产品加工下脚料的组合，试验研究表明，发酵原料以海产品加工下脚料为主，辅以少量的农产品加工下脚料，制得的益生菌饲料品质最佳，发挥出的抗病害作用更为明显。经反复试验，发酵原料以90wt％的海产品加工下脚料和10wt％的农产品加工下脚料较为合适，更受水产养殖物种的喜爱，有利于提高养殖产出。
本发明方法的步骤b中，制得的发酵物水分含量过高或过低都会影响生产效率和产品品质，试验表明，发酵物中的水分含量控制在55～65wt％之间时，有利于提高产品质量和规模化生产。
本发明方法的步骤c中，一次发酵的目的在于熟化发酵原料和去除杂菌，发酵温度控制在60℃左右即可，如果检测到温度超过65℃，通过搅拌，将发酵物重新堆砌，实现降温。发酵时间控制在20～30小时，可以保证达到熟化和去除杂菌的目的，杂菌数小于2.0×107CFU/g。一次发酵用的发酵剂可以采用苏绿科生物科技有限公司生产的生物饲料发酵剂。
本发明方法的步骤d中，二次发酵用的嗜酸乳杆菌菌株、枯草芽孢杆菌菌株和酿酒酵母菌株可以按照以下方法培育。(当然也可以直接从市场采购)
I.培育嗜酸乳杆菌菌株
向100份的MRS培养基中加入番茄汁5份，琼脂3份，调节PH＝6.4，获得嗜酸乳杆菌菌种培养基，备用。
向100份纯化水中加入乳清粉4份，乳糖1份，低聚异麦芽糖4份，琼脂2份，吐温802份，调节PH＝6.2，115℃灭菌20分钟，获得嗜酸乳杆菌菌群培养基，备用。
从畜禽肠道物中分离出嗜酸乳杆菌，按1％的接种量接种到嗜酸乳杆菌菌种培养基中，控制温度处于36～38℃之间，PH处于5.5～6.2之间，培育2～3天，获得嗜酸乳杆菌菌种；然后，按4％的接种量将嗜酸乳杆菌菌种接种于菌群培养基中，34～37℃厌氧静置培养2～3天，获得嗜酸乳杆菌菌株。
II.培育枯草芽孢杆菌菌株
取玉米浆4份、蛋白胨3份、甘蔗5份、牛肉汤20份、黄麻子3份、香附4份、牛筋草5份、黄耆3份、三白草根4份、氯化铵0.1份、碳酸氢钙0.05份、磷酸氢锌0.05份和硫酸氢钠0.1份，按照以下步骤配制枯草芽孢杆菌菌种培养基。
第一步，按照配比取甘蔗、黄麻子、香附、牛筋草、黄耆和三白草根，加入其总量1倍量的水浸泡2小时后进行蒸煮30分钟，过滤药渣，得到滤液；
第二步，将剩余组分按照配比混合，并加入第一步得到的滤液，搅拌并加热到60℃，持续加热搅拌30分钟，得到混液；
第三步，向第二步得到的混液中加入70％的NaOH溶液，调节PH＝7.1，然后在110℃、110kPa条件下灭菌15分钟，得到枯草芽孢杆菌菌种培养基，备用。
将1000份淀粉加入到4000份已经预热至60℃的纯化水中，在搅拌下煮沸，制成淀粉糊，带淀粉糊冷却至常温，加入蔗糖20份，淀粉20份，酵母膏1份，蛋白胨5份，NaNO3 3份，KH2PO4 5份，CaCO310份，纯化水1000份，调节PH＝7.0，获得枯草芽孢杆菌菌群培养基，备用。
对发酵罐进行空罐灭菌，然后将相当于发酵罐容积1/3的枯草芽孢杆菌菌种培养基倒入发酵罐中，密封，105℃下灭菌15分钟，之后，采用火焰接种法，在接种口放置酒精圈，点燃后，将从土壤中分离出枯草芽孢杆菌按1～5％的接种量通过火焰圈迅速倒入发酵罐内，完成接种。接种完成后，控制温度36～37℃，以200转/分的搅拌速度，在通风条件下培养6小时，获得培育枯草芽孢杆菌菌种。
按4％的接种量将枯草芽孢杆菌菌种接种于枯草芽孢杆菌菌群培养基中，进料口清洁、消毒并密封，34～37℃下静置培养，每6小时向发酵罐内吹净化空气5分钟，培养36小时，获得培育枯草芽孢杆菌菌株。
III.培育酿酒酵母菌菌株
采用先进的液体-固体两相发酵工艺，在液体发酵、好氧增殖基础上增加液体厌氧代谢和固体发酵的生物节点过程，发酵结束后，通过酵母自溶技术处理，使酵母细胞有效破碎和酵母细胞物质彻底释放并溶入培养基质，经低温干燥技术处理后形成半成品，最后经粉碎、包装获得酿酒酵母菌菌株备用。具体如下：
向1000份纯化水中加入20份蛋白胨、10份酵母抽提物，15份0.2％腺嘌呤溶液，120℃高压灭菌15min，制得酿酒酵母菌液体培养基，室温贮存，备用。
取玉米10份、麸皮份、豆粕16份、琼脂粉2份、葡萄糖2份，120℃下高压灭菌15分钟，铺板，待凝固后4℃贮存，获得酿酒酵母菌固体培养基，备用。
从水果中分离出酿酒酵母菌，然后进行种子培养，得到酿酒酵母菌种子培养物；将酿酒酵母菌种子培养物接种于酿酒酵母菌液体培养基中进行有氧发酵，得到酿酒酵母菌液体培养物；然后将酿酒酵母菌液体培养物按15％v/m接种到固体培养基中，在30～35℃的条件下厌氧发酵48小时，再在55～65℃下保持24h；最后在烘干出风温度为60～80℃的条件下，采用气流干燥的方法进行烘干，获得酿酒酵母菌菌株。
实施例1
本实施例中，发酵原料为10wt％红薯渣和90wt％的南美白对虾下脚料；二次发酵用益生菌菌株按照上述方法获得，用量为1吨益生菌载体使用1kg嗜酸乳杆菌菌种，2kg枯草芽孢杆菌菌种，1kg酿酒酵母菌菌种。
具体步骤如下：
a.对发酵原料进行粉碎，用40目的网筛进行筛选，备用；
b.向步骤a中筛选出的发酵原料中加入水，制得水分含量为55wt％的发酵物；
c.一次发酵：将发酵物置于发酵罐中，加入发酵剂，密封，控制发酵温度55～65℃，发酵时间30小时，制得二次发酵用的益生菌载体；本步骤中，发酵剂的用量为每吨发酵物使用2kg的发酵剂。
d.二次发酵制备A物料、B物料和C物料，具体如下：
i.向步骤c中制得的益生菌载体中喷洒嗜酸乳杆菌菌株，并搅拌均匀，常温厌氧发酵使嗜酸乳杆菌含量不低于6.0×107CFU/g，制得A物料；
ii.向步骤c中制得的益生菌载体中喷洒枯草芽孢杆菌菌株，并搅拌均匀，常温好氧发酵使枯草芽孢杆菌含量不低于6.0×107CFU/g，制得B物料；
iii.向步骤c中制得的益生菌载体中喷洒酿酒酵母菌株，并搅拌均匀，常温兼性发酵使酿酒酵母菌含量不低于6.0×107CFU/g，制得C物料；
e.将步骤d中制得的A物料、B物料和C物料按3：3：4的重量比例进行混合，制得产品。
喂食试验：将本实施例制得的益生菌饲料用于青蟹养殖，与常规饲料按2:8的比例组合使用，青蟹增产20％，个体平均重量增长10％。
上述对本申请中涉及的发明的一般性描述和对其具体实施例的描述不应理解为是对该发明技术方案构成的限制。本领域所属技术人员根据本申请的公开，可以在不违背所涉及的发明构成要素的前提下，对上述一般性描述或/和实施例中的公开技术特征进行增加、减少或组合，形成属于本申请保护范围之内的其它的技术方案。