本发明属于食品加工辅料技术领域，具体涉及一种强凝胶性肌原纤维蛋白的制备方法。
背景技术：
肌原纤维蛋白是一类具有重要生物学功能特性的盐溶性蛋白，也是构成肌肉纤维的主要蛋白质，占总蛋白含量的50-55％，主要包括肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白等。肌原纤维蛋白参与肌肉的收缩、影响肉的嫩度和肉制品的功能特性，如凝胶性、流变学特性、保水性、弹性、质地等。其中，肌原纤维蛋白的凝胶特性是鱼糜制品加工中最重要的功能特性。凝胶是一种介于固体和液体之间、外观均匀、并保持一定形态的弹性半固体。蛋白能够形成凝胶是因为蛋白质受外界条件的调节或受热后使非共价键解离，表面的结构发生改变，尤其是，疏水基团的暴露促进了蛋白质之间的相互作用，使蛋白质分子在聚合作用下形成均匀的网络状凝胶体。
研究表明，在漂洗及贮藏过程中，马鲭鱼肉易被氧化，使鱼肉中羰基含量明显增多(sylvie，carolinepetal.2015)；虹鳟鱼肉中蛋白质氧化改变了化学作用力，如疏水作用力、二硫键、非共价键等，促使蛋白质分子构象及其聚集方式发生变化(herreraandmackie2004)，鱼肉中蛋白质氧化也是由自由基链式反应所引起的，自由基首先进攻带有活性侧链的肽链骨架(sante-lhoutellier，aubryetal.2007)，如半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸，会产生羰基衍生物，削减巯基的数量等，导致氧化后的鱼肉蛋白凝胶能力变差、弹性降低、持水力下降。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种强凝胶性肌原纤维蛋白的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种强凝胶性肌原纤维蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)向搅碎后的鱼糜中加入第一分离缓冲液，依次经均质处理和离心，除去可溶性蛋白，得第一沉淀，再向该第一沉淀中加入第二分离缓冲液，依次经均质处理、过滤和离心，得第二沉淀；上述第一分离缓冲液的ph为6.9～7.1，包括0.08～0.12mkcl，1.8～2.2mmmgcl2，0.8～1.2mmegta、0.4～0.6mmdtt和8～11mmk2hpo4；上述第二缓冲液的ph为5.9～6.1，包括0.08～0.12mnacl和0.8～1.2mmnan3；
(2)向上述第二沉淀中加入冷的溶解缓冲液，均质后于～1～2℃放置25～40min，然后离心取上清，再用超滤管浓缩，得浓缩液；上述溶解缓冲液为0.5～0.7mnacl溶液，ph为7.9～8.1；
(3)再上述浓缩液中加入焦性没食子酸，混合均匀，常温下放置1～5h后，得到混合蛋白溶液；上述焦性没食子酸在浓缩液中的浓度为6u～300umol/g蛋白；
(4)将上述混合蛋白溶液进行真空包装，置于超高压100～600mpa下处理5～25min；
(5)将步骤(4)所得的物料置于18～22℃的水浴中，以0.8～1.2℃/min的速率升温至82～86℃，保温25～40min，然后立即于0℃放置10～13h，即得所述强凝胶性肌原纤维蛋白。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一分离缓冲液的ph为7.0，包括0.1mkcl，2mmmgcl2，1mmegta、0.5mmdtt和10mmk2hpo4。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第二缓冲液的ph为6.0，包括0.1mnacl和1mmnan3。
在本发明的一个优选实施方案中，所述溶解缓冲液为0.6mnacl溶液，ph为8.0。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中的均质处理的条件为7000～10000rpm，3～8min。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)和(2)中的离心的条件为7000～9000rpm，10～30min，4～8℃。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)为：将上述混合蛋白溶液进行真空包装，置于超高压400mpa下处理15min。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(5)为：将步骤(4)所得的物料置于20℃的水浴中，以1℃/min的速率升温至85℃，保温30min，然后立即于0℃放置12h，即得所述强凝胶性肌原纤维蛋白。
本发明的有益效果是：本发明利用焦性没食子酸的抗氧化性将肌原纤维蛋白的体系被氧化的程度弱化，并结合超高压处理，从而改变肌原纤维蛋白的内部结构，形成均匀的三维网络凝胶结构。本发明适用于食品加工辅料领域，调节鱼肉制品的品质。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为本发明实施例1至4中不同处理条件下所获得的强凝胶性肌原纤维蛋白的扫描电镜图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
如图1所示，一种强凝胶性肌原纤维蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)向搅碎后的鱼糜中加入第一分离缓冲液，依次经均质处理和离心，除去可溶性蛋白，得第一沉淀，再向该第一沉淀中加入第二分离缓冲液，依次经均质处理、三层纱布过滤得液体和离心，得第二沉淀；上述第一分离缓冲液的ph为7.0，包括0.1mkcl，2mmmgcl2，1mmegta、0.5mmdtt和10mmk2hpo4；上述第二缓冲液的ph为6.0，包括0.1mnacl和1mmnan3；该步骤中，均质处理的条件为8000rpm，5min，离心的条件为8000rpm，15min，4℃；
(2)向上述第二沉淀中加入冷的溶解缓冲液，均质后于0℃放置30min，然后离心取上清，再用超滤管浓缩，得浓度为20mg/ml的浓缩液；上述溶解缓冲液为0.6mnacl溶液，ph为8.0；该步骤中离心的条件为8000rpm，15min，4℃
(3)再上述浓缩液中加入焦性没食子酸，混合均匀，常温下放置2h后，得到混合蛋白溶液；上述焦性没食子酸在浓缩液中的浓度为300umol/g蛋白；
(4)将上述混合蛋白溶液进行袋装抽真空30s、热封2.5s真空包装，置于超高压400mpa下处理15min；
(5)将步骤(4)所得的物料置于20℃的水浴中，以1℃/min的速率升温至85℃，保温30min，然后立即于0℃放置12h，即得所述强凝胶性肌原纤维蛋白。
实施例2
(1)向搅碎后的鱼糜中加入第一分离缓冲液，依次经均质处理和离心，除去可溶性蛋白，得第一沉淀，再向该第一沉淀中加入第二分离缓冲液，依次经均质处理、三层纱布过滤得液体和离心，得第二沉淀；上述第一分离缓冲液的ph为7.0，包括0.1mkcl，2mmmgcl2，1mmegta、0.5mmdtt和10mmk2hpo4；上述第二缓冲液的ph为6.0，包括0.1mnacl和1mmnan3；该步骤中，均质处理的条件为8000rpm，5min，离心的条件为8000rpm，15min，4℃；
(2)向上述第二沉淀中加入冷的溶解缓冲液，均质后于0℃放置30min，然后离心取上清，再用超滤管浓缩，得浓度为20mg/ml的浓缩液；上述溶解缓冲液为0.6mnacl溶液，ph为8.0；该步骤中离心的条件为8000rpm，15min，4℃
(3)将上述浓缩液进行袋装抽真空30s、热封2.5s真空包装，置于超高压400mpa下处理15min；
(4)将步骤(3)所得的物料置于20℃的水浴中，以1℃/min的速率升温至85℃，保温30min，然后立即于0℃放置12h，即得。
实施例3
(1)向搅碎后的鱼糜中加入第一分离缓冲液，依次经均质处理和离心，除去可溶性蛋白，得第一沉淀，再向该第一沉淀中加入第二分离缓冲液，依次经均质处理、三层纱布过滤得液体和离心，得第二沉淀；上述第一分离缓冲液的ph为7.0，包括0.1mkcl，2mmmgcl2，1mmegta、0.5mmdtt和10mmk2hpo4；上述第二缓冲液的ph为6.0，包括0.1mnacl和1mmnan3；该步骤中，均质处理的条件为8000rpm，5min，离心的条件为8000rpm，15min，4℃；
(2)向上述第二沉淀中加入冷的溶解缓冲液，均质后于0℃放置30min，然后离心取上清，再用超滤管浓缩，得浓度为20mg/ml的浓缩液；上述溶解缓冲液为0.6mnacl溶液，ph为8.0；该步骤中离心的条件为8000rpm，15min，4℃
(3)再上述浓缩液中加入焦性没食子酸，混合均匀，常温下放置2h后，得到混合蛋白溶液；上述焦性没食子酸在浓缩液中的浓度为300umol/g蛋白；
(4)将上述混合蛋白溶液置于20℃的水浴中，以1℃/min的速率升温至85℃，保温30min，然后立即于0℃放置12h，即得。
实施例4
(1)向搅碎后的鱼糜中加入第一分离缓冲液，依次经均质处理和离心，除去可溶性蛋白，得第一沉淀，再向该第一沉淀中加入第二分离缓冲液，依次经均质处理、三层纱布过滤得液体和离心，得第二沉淀；上述第一分离缓冲液的ph为7.0，包括0.1mkcl，2mmmgcl2，1mmegta、0.5mmdtt和10mmk2hpo4；上述第二缓冲液的ph为6.0，包括0.1mnacl和1mmnan3；该步骤中，均质处理的条件为8000rpm，5min，离心的条件为8000rpm，15min，4℃；
(2)向上述第二沉淀中加入冷的溶解缓冲液，均质后于0℃放置30min，然后离心取上清，再用超滤管浓缩，得浓度为20mg/ml的浓缩液；上述溶解缓冲液为0.6mnacl溶液，ph为8.0；该步骤中离心的条件为8000rpm，15min，4℃
(3)将步骤(2)所得的浓缩液置于20℃的水浴中，以1℃/min的速率升温至85℃，保温30min，然后立即于0℃放置12h，即得。
由图2可知，实施例1，即添加焦性没食子酸协同超高压处理的肌原纤维蛋白，蛋白凝胶孔洞小，颗粒均匀细小，凝胶网络均匀有序，所以凝胶特性优于其他实施例。
本领域普通技术人员可知，本发明的技术方案在下述范围内变化时，仍然能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果，仍然属于本发明的保护范围：
一种强凝胶性肌原纤维蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)向搅碎后的鱼糜中加入第一分离缓冲液，依次经均质处理和离心，除去可溶性蛋白，得第一沉淀，再向该第一沉淀中加入第二分离缓冲液，依次经均质处理、过滤和离心，得第二沉淀；上述第一分离缓冲液的ph为6.9～7.1，包括0.08～0.12mkcl，1.8～2.2mmmgcl2，0.8～1.2mmegta、0.4～0.6mmdtt和8～11mmk2hpo4；上述第二缓冲液的ph为5.9～6.1，包括0.08～0.12mnacl和0.8～1.2mmnan3；
(2)向上述第二沉淀中加入冷的溶解缓冲液，均质后于～1～2℃放置25～40min，然后离心取上清，再用超滤管浓缩，得浓缩液；上述溶解缓冲液为0.5～0.7mnacl溶液，ph为7.9～8.1；
(3)再上述浓缩液中加入焦性没食子酸，混合均匀，常温下放置1～5h后，得到混合蛋白溶液；上述焦性没食子酸在浓缩液中的浓度为6u～300umol/g蛋白；
(4)将上述混合蛋白溶液进行真空包装，置于超高压100～600mpa下处理5～25min；
(5)将步骤(4)所得的物料置于18～22℃的水浴中，以0.8～1.2℃/min的速率升温至82～86℃，保温25～40min，然后立即于0℃放置10～13h，即得所述强凝胶性肌原纤维蛋白。
所述步骤(1)中的均质处理的条件为7000～10000rpm，3～8min。所述步骤(1)和(2)中的离心的条件为7000～9000rpm，10～30min，4～8℃。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。