本发明涉及饲料添加剂领域，特别涉及一种中草药内生真菌发酵的中草药饲料添加剂的制备方法。
背景技术
现代人们对食品安全高度重视，对畜禽水产产品品质要求不断提高，在饲料中广泛添加抗生素类物质虽然可以达到促进动物生长和提高动物免疫力的作用，但由于畜禽水产养殖中非法添加和超量添加抗生素的情况比较普遍，其负面影响日渐突出，致病菌的耐药性增强和药物残留等问题越来越引起人们的关注，因此，研发安全、高效、绿色的新型饲用抗生素替代品已成为畜牧水产业的重大课题。在保证饲料添加剂符合国家规定的基础上，天然中草药饲料添加剂逐渐体现出了自己的优势。
野马追、益母草、穿心莲和瓜篓均为传统中药材，富含黄酮类化合物、萜内酯、绿原酸、聚成烯醇等对人和畜禽具有显著生物活性的化合物。这些活性物质能有效增强动物机体的免疫功能，促进机体免疫器官的发育，而且能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌等常见各种病原微生物，促进养殖动物健康。近年来的研究表明了以野马追、益母草、穿心莲和瓜篓及其提取物作为家禽、家畜、水产品的饲料添加剂，不仅能预防动物疾病的发生，调节动物免疫功能，减少预防用药，增加食用安全性，还能提高肉制品食用品质和口感。但由于中草药饲料添加剂的应用和研究存在用药成分复杂、剂量大、营养物质浓度低、适口性差、效果不稳定等问题，阻碍了中草药饲料添加剂的规模化推广应用。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种中草药内生真菌发酵的中草药饲料添加剂的制备方法，制备出的中草药饲料添加剂的抑菌活性和酶活性均有很大提高。
技术方案：本发明提供了一种中草药内生真菌发酵的中草药饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：s1：使用由野马追、益母草、穿心莲和瓜篓四种中草药配制成的中草药复方分别制备中草药浸煮液和发酵培养基；s2：使用所述中草药浸煮液配制真菌分离培养基；s3：将切碎的四种中草药的新鲜植株置于所述真菌分离培养基上培养至切口处长出菌丝；s4：将所述菌丝转接至添加有20%所述中草药浸煮液的所述真菌分离培养基上培养出内生真菌菌株，并筛选出生长良好的内生真菌菌株；s5：将筛选出的内生真菌菌株接种于液体种子培养基上培养出种子液；s6：将所述种子液接种到所述发酵培养基上进行发酵，得中草药饲料添加剂。
优选地，在所述s1中，所述中草药复方中，野马追、益母草、穿心莲和瓜篓四种中草药的质量比为1:1:1:1。
优选地，在所述s1中，所述中草药浸煮液的配制方法如下：将所述中草药复方粉碎至40目，加入20倍的蒸馏水，煎煮30min后粗过滤，取滤液于8000r/min离心15min，取上清液，减压浓缩5倍后得所述中草药浸煮液。
优选地，在所述s1中，所述发酵培养基的组成为：中草药复方70%，麦麸25%，葡萄糖3%，（nh4）2so41.5%，kh2po40.3%，mgso40.2%以及水50-60%。
优选地，在所述s2中，所述真菌分离培养基的配制方法如下：在马丁氏固体培养基中加入5%所述中草药浸煮液的所述真菌分离培养基，ph自然。
优选地，在所述s5中，所述液体种子培养基的组成为：葡萄糖5%，豆饼粉1.5%，酵母粉0.5%，kh2po40.2%，mgso4·7h2o0.1%，caco30.4%。
优选地，在所述s5中，所述种子液的培养条件为：28℃，180r/min，72h。
优选地，在所述s6中，所述发酵培养基的含水量为50~60%，ph自然,灭菌30min后，将所述种子液按体积质量比为10%的接种量接种到所述发酵培养基上，32℃发酵72h后，50℃烘干，得所述中草药饲料添加剂。
有益效果：本发明中从野马追、益母草、穿心莲和瓜篓四种中草药中分离出的内生真菌在生长代谢过程中，可以产生各种不同的酶，将中草药饲料添加剂中大分子物质和抗营养因子分解或转化成小分子物质，还可以产生防病助生长的次级代谢产物，能有效增强抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌等各种病原微生物的活性，从而提高饲料适口性和饲料转化率，增强药效和降低饲养成本，促进动物生长发育，提高动物的繁殖能力和生长性能等。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的介绍。
使用质量比为1:1:1:1的野马追、益母草、穿心莲和瓜篓四种中草药配制成的中草药复方，称取20g粉碎至40目的中草药复方，加入20倍的蒸馏水，煎煮30min后粗过滤，取滤液于8000r/min离心15min，取上清液，减压浓缩5倍，得中草药浸煮液，4℃冰箱中保存备用；配制发酵培养基，其中中草药复方占70%，麦麸占25%，葡萄糖占3%，（nh4）2so4占1.5%，kh2po4占0.3%，mgso4占0.2%，含水量占50%；在马丁氏固体培养基中加入5%中草药浸煮液配制成真菌分离培养基，ph自然。
将新鲜的四种中草药用清水将表面尘土冲洗干净，用去离子水超声振荡10min。在无菌条件下，对中草药进行表面消毒，具体步骤如下：无菌水冲洗3次，0.1%升汞溶液浸泡10min，8%次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次，75%乙醇浸泡5min，无菌水冲洗3次。消毒后的中草药用无菌手术剪剪成叶(2-5)mm×(2-5)mm，根和茎5-10mm的片段，置于真菌分离培养基上，用封口膜将培养皿密封，28℃恒温培养3-5d；每皿接4-5个样品，观察材料切口处长出菌丝(菌落)，取切口处菌丝，转接至加有20%中草药浸煮液的真菌分离培养基上继续培养，采用尖端菌丝挑取法在培养出的内生真菌菌株中筛选出生长良好的菌株。
将筛选出的所有内生真菌菌株分别接种于液体种子培养基（葡萄糖5%，豆饼粉1.5%，酵母粉0.5%，kh2po40.2%，mgso4·7h2o0.1%，caco30.4%。）中，28℃，180r/min条件下培养72h，得种子液。按配方称取发酵培养基30g于250ml三角瓶中，ph自然,自来水调节含水量50%，110℃灭菌30min后，按10%（v/m）的接种量接种培养好的种子液，同时以接种无菌水的中草药发酵物为对照组。32℃培养72h后，50℃烘干，得中草药内生真菌发酵的中草药饲料添加剂。
通过组织块法，从中草药复方中共筛选出6株在含药浓度逐步递增的真菌分离培养基上生长良好的内生真菌菌株。
将分离出的内生真菌种子液对中草药复方进行发酵得发酵物浸提液，以接种无菌水的中草药发酵物为对照组，研究发酵物浸提液对指示菌株大肠杆菌（e.coli）、金黄色葡萄球菌（s.aureus）、普通变形杆菌（p.vulgaris）和鼠伤寒沙门氏菌（s.typhimurium）四株指示菌的抑菌活性。实验结果如下表1和表2。
表1发酵物浸提液抑菌实验
从表1抑菌实验数据可知，从中草药复方中分离出的6株内生真菌的发酵物浸提液的抑菌活性较对照组抑菌活性均有所增强。其中编号为fg-b和fy-b的两株菌株的抑菌活性较对照组抑菌活性增强最为明显。
菌株fg-b发酵物浸提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性分别较对照组提高60.91%、47.42%、48.84%、40.34%；菌株fy-b发酵物浸提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性较对照组分别提高62.73%、52.58%、54.65%、38.66%。
表2发酵物浸提液酶活实验
从表2酶活实验数据可知，从中草药复方中分离出的6株内生真菌的发酵物浸提液的酶活性活性较对照组酶活性均有所增强。其中编号为fy-b的菌株的酶活性较对照组酶活性增强最为明显。cncase、fpa、蛋白酶酶活性分别达到2397u/ml、821u/ml、1657u/ml。
综合分析抑菌实验和酶活实验数据可得，从中草药饲料添加剂复方中筛选出的六株生长良好的菌种的发酵物浸提液的抑菌活性和酶活性较对照组的抑菌活性和酶活性都有较大的提高，其中编号为fy-b的菌株的抑菌活性和酶活性较对照组抑菌活性和酶活性增强最为明显。菌株fy-b发酵物浸提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性较对照组分别提高62.73%、52.58%、54.65%、38.66%；cncase、fpa、蛋白酶酶活性分别达到2397u/ml、821u/ml、1657u/ml。
对筛选出的抑菌活性及酶活性较好的内生真菌进行形态观察与初步分类鉴定。通过菌落观察和常规镜检，根据真菌鉴定手册和半知菌属图解，初步鉴定为米曲霉，命名为米曲霉fy-b。结果如表3。
表3内生真菌形态特征
上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。