本发明涉及乳制品发酵的技术领域，具体涉及一种高果香酸奶及其制备方法。
背景技术
酸奶是以优质的牛奶为原料，用纯乳酸菌发酵剂发酵后加工制成的一种乳制品，产品浓稠，质地均匀，具有独特的酸香味，且营养丰富，既可作为便捷小食直接食用，又可作为膳食补充品。
有研究表明影响消费者购买酸奶的主要因素依次是口感，风味，价格，功能和品牌(汤志庆.酸奶消费者行为研究(1)-主要的消费需求[j].乳业科学与技术,2006,28(1):23-24)。酸奶的典型风味物质主要有乙醛、2,3-丁二酮和乙酸乙酯等，贡献出甜味、奶香味和果香味三大酸奶特色风味(r.j.mcgorrin,a.m.spanier,f.shahidi,etal.advancesindairyflavorchemistry[c].usa:specialpublication-royalsocietyofchemistry,2001:67-84.)。其中，果香味是酸奶的主要风味之一，乙酸乙酯是果香味的主要贡献者。文献“volatileorganicaromacompoundsproducedbythermophilicandmesophilicmixedstraindairystartercultures”(imhofretc.wt-foodscienceandtechnology,1995,28(1):78-86)研究单菌发酵实验时列举了各种发酵菌株的风味组成及其特征，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种在38℃下经30h发酵后最高可产6.17μg/kg的乙酸乙酯。文献“不同品牌酸奶香气成分研究”(牛云蔚,肖作兵,张喆,等.[j].粮食与油脂,2013(9):49-52.)中发现5种品牌的市售酸奶中酯类物质含量均较低，仅有1种酸奶含有乙酸乙酯，其余4种市售酸奶的乙酸乙酯含量均为0μg/kg，表明市售酸奶中乙酸乙酯含量普遍较低。酸奶酸度高，对发酵剂的耐酸特性具有一定要求。因此，研究一种乙酸乙酯含量高，果香味浓郁的酸奶，具有重要的意义。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种高果香的酸奶及其制备方法。
具体地，本发明提供了一种高果香酸奶的制备方法，所述方法以脱脂牛乳为原料，通过加入白砂糖调整固形物含量，经均质、杀菌后冷却，加入德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146进行发酵。
本发明利用德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146作为发酵剂进行发酵。本发明人研究发现，德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)cgmccno.15146菌株发酵时ph降低较快，6h时将ph降为5.17，10h将ph降为4.33；菌株发酵时的酸度值升高较快，6h时酸度值为58.25°t，10h时酸度值为97.50°t；该菌株产乙酸乙酯高，6h可产165.59μg/kg，10h时仍可维持乙酸乙酯含量稳定，含量约为164.07μg/kg，该菌株在发酵后期可维持乙酸乙酯含量基本稳定不变，应用于酸奶的制备中可显著增强最终产品的果香味。
进一步的，添加4-6％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为15-18％，优选的调整固形物含量为16％。
进一步的，所述均质的压力为14-21mpa，温度为40-85℃。
进一步的，所述杀菌为65℃下巴氏杀菌30min或105℃下巴氏杀菌10min。
优选的，将德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146菌株在改良mrs培养基中活化，然后按1-3％的体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中。
或者优选的，将德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146直投式发酵剂按0.05-0.2％的重量比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中。
其中，直投式发酵剂是将德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146的浓度调整至109cfu/ml以上，经冷冻干燥处理后得到。
进一步的，所述发酵的温度为37-42℃，时间为4-12h。
本发明还提供了所述制备方法制得的高果香酸奶。由于所用发酵剂德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146高产乙酸乙酯，使得制备得到的酸奶中乙酸乙酯的含量较高，具有突出的果香味。
本发明的有益效果为：
本发明制备方法以德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146为发酵剂，德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146产乙酸乙酯高，增香快。该菌株能够在6h内生成高含量的乙酸乙酯，且乙酸乙酯含量可维持较长时间不变，赋予酸奶怡人的果香味。
生物材料保藏信息：
本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)，已于2018年01月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，该菌株的保藏编号为：cgmccno.15146。
附图说明
图1为不同发酵剂制得的酸奶的感官评定结果；
图2为本发明高果香酸奶发酵过程中的ph变化；
图3为本发明高果香酸奶发酵过程中的酸度值变化。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1德氏乳杆菌保加利亚亚种的分离与鉴定
(1)制备合适的样品稀释梯度并培养
将-80℃冰箱中贮藏的四川阿坝传统牦牛酸乳甘油样品取出，置于冰上解冻。震荡混匀后取0.5ml样品加入4.5ml无菌生理盐水中，完成一次10倍稀释，振荡混匀后再从该稀释液中取出0.5ml稀释液加入4.5ml无菌生理盐水中，完成第二次10倍稀释，以此类推，直至稀释到10-6，从每个梯度的稀释液中吸取100μl，均匀涂布于lbs固体培养基平板上，平行制备两块平板，倒置，放于37℃厌氧下培养36-48h，并及时观察。
(2)划线分离与纯化
将长出菌落的平板取出后，选取单菌落明显的梯度平板，挑取不同菌落形态的菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。
(3)革兰氏染色和过氧化氢酶实验
挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录革兰氏染色结果；并挑取单菌落于载玻片上，加入3％过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，并记录过氧化氢酶接触结果。
(4)菌种保藏
将纯化完成后的每种菌株的单菌落挑入5ml液体lbs培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20-24h，吸取1ml菌液至保菌管中，6000rpm3min离心，去上清，加入1ml30％无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。
(5)16srdna序列扩增
吸取1ml菌液6000rpm3min离心，去上清，水洗两次，得菌泥，加入sds裂解液破碎细胞壁，再加入酚-氯仿萃取核酸dna，12000rpm10min离心取上清，乙醇溶液水洗两次，12000rpm5min离心去上清，烘干，加入50μl无菌水重悬，即得菌株dna模板。以此为模板，进行pcr扩增，流程如下：
1)扩增体系25μl：
其中模板量为1μl，taq酶mix为12.5μl，27f为0.5μl，1492r为0.5μl，ddh2o为10.5μl。所用引物为27f:agagtttgatcctggcctca(seqidno1)和1492r:ggttaccttgttacgactt(seqidno2)。扩增片段的核苷酸序列如seqidno3所示，长度为1399bp。
2)扩增条件：
预变性温度：105℃
第一步变性：95℃7min；95℃30s
第二步退火：55℃30s
第三步延伸：72℃90s
循环次数：95℃30s，33次循环
第四步最后延伸：72℃5min
第五步保持：12℃10min
(6)琼脂糖凝胶电泳
称取80ml琼脂糖加入锥形瓶中，加入80ml1xtae，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入2‰核酸染料，摇匀，无气泡，倒入胶板槽中，冷却40min凝固后，置于电泳槽中，排气泡，依次加入pcr扩增产物，每个孔中加入4μlpcr扩增产物，120v30min跑胶结束后取出，置于凝胶电泳成像仪中拍照保存，记录pcr成功样品的编号，将成功的pcr产物置于-20℃冰箱中保藏。
(7)菌株序列送测与鉴定
将pcr成功的样品送到华大基因进行检测，根据华大基因反馈的序列结果，结合ncbi菌株序列数据库进行blast检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录。结果显示，本发明提供的菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)。
该菌株的菌落特征为：该菌株在固体lbs培养基上由浅灰色至白色，12h左右时菌落呈浅灰色，有光泽，边缘雪花状，透明，扁平，中等大小；40h左右时菌落呈白色，无光泽，边缘不规则，不透明，微凸起，较大。
实施例2德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146发酵酸奶
德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146应用于酸奶的发酵时可增大乙酸乙酯的含量。
1、德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在酸奶发酵过程中乙酸乙酯含量变化
(1)gc-ms测稀酸奶发酵过程中乙酸乙酯含量
气谱条件为：rtx-wax毛细管柱；柱子规格：30m×0.25mm×0.25mm，进口温度为240℃，分流比10，柱流速1ml/min，载气为氦气；程序升温：初始温度40℃，保持3min；10℃/min升温至90℃；5℃/min升温至200℃，保持5分钟。
质谱条件为：离子化方式ei，发射能量为70ev，发射电流为200μa，检测器电压为1.4kv，离子源温度240℃，接口温度230℃，四级杆温度：150℃，质荷比30-500。化合物检索结果与nist和varian2个标准谱库进行匹配，相似度达到80％以上确认为目的化合物。以2μl的0.05mg/ml癸酸乙酯为内标，计算乙酸乙酯含量。
(2)酸奶的模拟发酵
以市售菌株c1、c2为对照菌，将-80℃保存的本发明所述德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146接种于改良mrs液体培养基中，其中改良mrs培养基配方为：胰蛋白胨(10g)、酵母膏(5g)、葡萄糖(20g)、柠檬酸二铵(2g)、乙酸钠(25g)、硫酸镁(0.58g)、硫酸锰(0.11g)、吐温80(1ml)、磷酸二氢钾(6g)、硫酸亚铁(0.03g)、蒸馏水(1000ml)，ph5.5。在37℃下培养12-14h，传代培养2-3次，取菌液100μl接种于顶空气相瓶内(含5ml16％固形物的酸奶)，置于42℃下培养10h，分别于0h、6h、10h取样，测其挥发性风味物质含量变化。实验使用的菌株信息如表1所示。
表1菌株信息表
(3)发酵过程中乙酸乙酯的含量变化
发酵过程中乙酸乙酯的含量变化如表2所示。由表2可知，德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在各个发酵时间段内乙酸乙酯产量都高于c1和c2，6h时，c1的乙酸乙酯产量为0μg/kg，c2为123.71μg/kg，德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146为165.59μg/kg，高于imhofr检测的乙酸乙酯(6.17μg/kg)，且高于对照菌株c1和c2，10h时c1酸奶中仍无乙酸乙酯检出，c2酸奶中的乙酸乙酯含量有较大幅度下降，德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146发酵的酸奶中的乙酸乙酯的含量为164.07μg/kg，与6h的含量相近，故德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146产乙酸乙酯的能力强，酸奶的感官雷达图如图1所示，德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在酸奶中的应用，提高了酸奶的果香味。
表2不同发酵时间段乙酸乙酯产量(μg/kg)
注：不同字母表示同一列间的差异性(p﹤0.05)
2、德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在酸奶发酵过程中ph值变化
将-80℃保存的本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146接种于改良mrs液体培养基中，在37℃下培养12-14h，传代培养2-3次，取菌液100μl接种于5ml的16％固形物的新鲜脱脂牛乳中，置于42℃下培养10h，分别于0h、6h、10h取样，测其ph变化。实验结果如表3及图2所示。由图2可知，c1在6h内ph降到5.63，c2降到5.33，德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146降到5.17，ph下降程度高于c1和c2，c1在10h内ph降低到4.40，c2降到4.45，德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146降到4.33，ph下降程度高于c1，低于c2，故德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146降低ph的能力较强。
表3不同发酵时间段的ph变化
注：不同字母表示同一列间的差异性(p﹤0.05)
3、德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在酸奶发酵过程中酸度值变化
将-80℃保存的本发明所述德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146接种于改良mrs液体培养基中，在37℃下培养12-14h，传代培养2-3次，取菌液100μl接种于5ml的16％固形物的新鲜脱脂牛乳中，置于42℃下培养10h，分别于0h、6h、10h取样，测其酸度值变化。实验结果如表4及图3所示。由图3可知，c1在6h内酸度值升高到46.75°t，c2升到48.25t，德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146升到58.25°t，酸度值升高程度高于c1和c2，c1在10h内酸度值升高到61.75°t，c2升到92.00°t，德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146升到97.50°t，酸度值升高程度高于c1，低于c2，故德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146的产酸能力较强。
表4不同发酵时间段的酸度值变化(°t)
注：不同字母表示同一列间的差异性(p﹤0.05)
实施例3利用德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146制备酸奶
本发明高果香酸奶的制备方法包括以下步骤：
(1)调整固形物含量：在新鲜的脱脂牛乳中添加4％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为15％；
(2)均质：均质的压力为14mpa，温度为85℃；
(3)巴氏杀菌：105℃下巴氏杀菌10min；
(4)接种：酸奶冷却到21℃，投入重量比为0.1％的cgmccno.15146直投式发酵剂，搅拌均匀，在37℃下发酵12h；直投式发酵剂是将活化后的德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146的浓度调整至109cfu/ml以上，经冷冻干燥处理后得到；
(5)发酵至终点时酸度值为70°t以上，ph为4.70，凝乳后在3℃下过夜放置，并保持24h。
上述制备方法制得的高果香酸奶的乙酸乙酯的含量为76.16μg/kg，果香味浓郁。
实施例4利用德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146制备酸奶
本发明高果香酸奶的制备方法包括以下步骤：
(1)调整固形物含量：在新鲜的脱脂牛乳中添加5％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为16％；
(2)均质：均质的压力为18mpa，温度为60℃；
(3)巴氏杀菌：105℃下巴氏杀菌10min；
(4)接种：酸奶冷却到21℃，将德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在改良mrs液体培养基中活化2代后，接第3代于脱脂乳培养基中得到凝乳，凝乳中德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146的活菌浓度在3×108cfu/ml，然后将凝乳按2％的体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中，搅拌均匀，在40℃下发酵10h；
(5)发酵至终点时酸度值为70°t以上，ph为4.50，凝乳后在5℃下过夜放置，并保持48h。
上述制备方法制得的高果香酸奶的乙酸乙酯的含量为38.05μg/kg，果香味浓郁。
实施例5利用德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在制备酸奶
本发明高果香酸奶的制备方法包括以下步骤：
(1)调整固形物含量：在新鲜的脱脂牛乳中添加6％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为18％；
(2)均质：均质的压力为21mpa，温度为40℃；
(3)巴氏杀菌：105℃下巴氏杀菌10min；
(4)接种：酸奶冷却到21℃，将德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在改良mrs液体培养基中活化2代后，接第3代于脱脂乳培养基中得到凝乳，凝乳中德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146的活菌浓度在2×108cfu/ml，然后将凝乳按4％的体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中，搅拌均匀，在42℃下发酵6h；
(5)发酵至终点时酸度值为70°t以上，ph为4.70，凝乳后在5℃下过夜放置，并保持48h。
上述制备方法制得的高果香酸奶的乙酸乙酯的含量为51.98μg/kg，果香味浓郁。
实施例6利用德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在制备酸奶
本发明高果香酸奶的制备方法包括以下步骤：
(1)调整固形物含量：在新鲜的脱脂牛乳中添加6％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为18％；
(2)均质：均质的压力为21mpa，温度为40℃；
(3)巴氏杀菌：在65℃下巴氏杀菌30min；
(4)接种：酸奶冷却到21℃，将德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146在改良mrs液体培养基中活化2代后，接第3代于脱脂乳培养基中得到凝乳，凝乳中德氏乳杆菌保加利亚亚种cgmccno.15146的活菌浓度在2×108cfu/ml，然后将凝乳按4％的体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中，搅拌均匀，在42℃下发酵4h；
(5)发酵至终点时酸度值为70°t以上，ph为4.70，凝乳后在5℃下过夜放置，并保持48h。
上述制备方法制得的高果香酸奶的乙酸乙酯的含量为39.75μg/kg，果香味浓郁。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>光明乳业股份有限公司
<120>一种高果香酸奶及其制备方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(未知)
<400>1
agagtttgatcctggcctca20
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(未知)
<400>2
ggttaccttgttacgactt19
<210>3
<211>1399
<212>dna
<213>16srdna
<400>3
ccgactttgggcattgcagacttccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaa60
cgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccagcttcgtgcaggcgag120
ttgcagcctgcagtccgaactgagaacagctttaagagatccgcttaccctcgcgggttc180
gcttctcgttgtactgcccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatg240
acttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctctttagagtgcccaa300
cttaatgatggcaactaaagacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctc360
acgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtctctgcgtccccgaagggaaccacc420
tatctctaggtgtagcacaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaat480
taaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttg540
cggtcgtactccccaggcggagcgcttaatgcgtttgctgcggcactgaggaccggaaag600
tccccaacacctagcgctcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttc660
gctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttgcagaccagagagccgccttcgccactg720
gtgttcttccatatatctacgcattccaccgctacacatggaattccactctcctcttct780
gcactcaagaatgacagtttccgatgcagttccacggttgagccgtgggctttcacatca840
gacttatcattccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacc900
tacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtgactttctggttgattaccgtca960
aataaagaccagttactgcctctatccttcttcaccaacaacagagctttacgatccgaa1020
aaccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccc1080
tactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcagtct1140
ctcaactcggctacgcatcattgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatgcg1200
ccgcgggctcatcctaaagtgacagcttacgccgcctttcaaacttgaatcatgcgattc1260
atgttgttatccggtattagcacctgtttccaagtggtatcccagtctttagggcagatt1320
gcccacgtgttactcacccatccgccgctagcgtccaacaaatcaccccgaagggatctt1380
tgaattcagctcgctcgac1399