本发明属于动物饲料添加剂领域，具体涉及胆汁酸在制备用于大口黑鲈的饲料添加剂中的应用。
背景技术：
胆汁酸(bileacid)分子结构具有两性，一端为烷基，具有亲油性，可以和油脂类结合；另一端为羟基和羧基，具有亲水性。两类性质不同的基团位于环成烷多氢菲核的两侧，使胆汁酸具有较强的表面活性，能降低油水两相间的表面张力，促进脂类乳化，扩大脂肪和脂肪酶的接触面，加速脂类的消化吸收(hillmj，1995)。胆固醇难溶于水，须掺入卵磷脂-胆汁酸盐微团中，使胆固醇通过胆道运送到小肠而不致析出。临床常用鹅脱氧脱酸及熊脱氧胆酸治疗胆固醇结石(podda等，1989)。
技术实现要素：
本发明的目的是提供了胆汁酸在制备用于大口黑鲈的饲料添加剂中的应用，本发明通过在大口黑鲈基础饲料中添加胆汁酸，研究其对大口黑鲈的生长性能、血浆脂肪代谢指标、抗氧化能力、肠道消化酶活性及胆酸含量、胆囊胆汁酸含量等的影响，以确定胆汁酸在水产饲料中添加的有效性。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
本发明提供了胆汁酸在制备用于大口黑鲈的饲料添加剂中的应用。
进一步的：所述胆汁酸包括以下成分：以质量比计，猪胆酸5％-20％、猪去氧胆酸55％-75％和鹅去氧胆酸10％-20％。
进一步的：所述胆汁酸的制备方法如下：
(1)皂化
称取粉碎的胆膏，加入反应釜中，加入氢氧化钠溶液，升温并保持沸腾状态6-24h，将皂化液冷却至固液分层，将上清液去除，固体即为胆膏皂化品；
(2)脱色
向胆膏皂化品中加水并加热使胆膏皂化品完全溶解，然后加入双氧水，搅拌均匀后反应，反应完毕后，将反应溶液过滤得滤液；
(3)酸化
将所述滤液冷却至室温，缓慢加入盐酸溶液，并搅拌，待溶液ph值在3-4时，停止加酸，此时得到白色固形物；
(4)纯化
将所述白色固形物过滤后，加水冲洗，待过滤出的水检测呈中性为水洗结束；将过滤后的白色固形物放入烘箱中干燥至水分不高于10％，得胆汁酸粗品；
(5)重结晶
将得到的胆汁酸粗品投入萃取罐中，加入乙酸乙酯搅拌溶解，待胆汁酸粗品溶解，加入无水硫酸钠脱水，收集溶液，将溶液进行减压浓缩，将浓缩液压滤得到胆汁酸；
(6)干燥
将得到的胆汁酸放入烘箱，通蒸汽进行真空干燥，待胆汁酸水分不超过1％，则得到所述胆汁酸。
进一步的：大口黑鲈饲料中胆汁酸的添加量为200mg/kg-450mg/kg。
进一步的：以特定生长率为指标，大口黑鲈饲料中胆汁酸最适添加量为440.5mg/kg。
进一步的：以摄食率为指标，大口黑鲈饲料中胆汁酸最适添加量为283.3mg/kg。
进一步的：以肝脏中总胆汁酸含量为指标，大口黑鲈饲料中胆汁酸最适添加量为253.8mg/kg。
进一步的：饲料中添加300mg/kg胆汁酸，大口黑鲈获得最高生长性能。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明通过试验结果证明饲料中添加适量胆汁酸可有效促进摄食和生长性能，方差分析结果显示饲料中添加300mg/kg胆汁酸，大口黑鲈获得最高生长性能，且肝脏胆汁酸含量与d240组没有差异。在以上添加范围内，胆汁酸有效降低大口黑鲈肝脏中mda含量，提高抗氧化能力；通过提高血浆中hdl-c含量显著促进脂肪代谢，同时有效提高了肠道淀粉酶和脂肪酶活性。本发明通过实验证明了将胆汁酸添加在大口黑鲈饲料中的切实可行性，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1表示胆汁酸含量对大口黑鲈特定生长率的影响关系；
图2表示饲料中胆汁酸含量对大口黑鲈摄食率的影响关系；
图3表示饲料中胆汁酸含量对大口黑鲈肝脏中总胆汁酸含量的影响关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的描述。
实施例1
1、材料与方法
1.1试验鱼
试验用水产靶动物为大口黑鲈(micropterussalmoides)，购自佛山市三水白金水产种苗有限公司，试验正式开始前，试验鱼在养殖系统中暂养2周，暂养期间投喂不含外源胆汁酸的基础饲料。
治疗和预防措施(原因、时间、种类、持续时间等)：实验前用2％食盐水消毒实验鱼及养殖系统。试验期间无疾病发生。
1.2受试物
试验所用胆汁酸包括猪胆酸、猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，本发明所述的胆汁酸经过皂化、脱色、酸化、纯化和重结晶五个步骤制得，其详细步骤如下：
1、皂化
称取粉碎的胆膏200kg，加入r201反应釜中，按照固液比1∶10加入10％的氢氧化钠溶液2000l。待r201反应釜中的溶液升温至100℃时开始计时，保持沸腾状态12h。将皂化液冷却至固液分层，用管道离心泵将上清液打至储槽中，反应釜中的剩余固体即为胆膏皂化品。
2、脱色
向反应釜中加1200kg自来水加热至80℃，使胆膏皂化品完全溶解(加水体积∶胆膏质量＝6∶1)。然后加入60l双氧水，搅拌均匀后，在80℃下反应2h。反应完毕后，将溶液经管道中的过滤网装置过滤至酸化罐中。管道中的过滤网可将皂化后产生的絮状杂质过滤掉。
3、酸化
通过管道离心泵打至酸化罐中之后，在罐体夹层中通冷凝水将溶液冷却至室温。通过酸计量罐往酸化槽中缓慢加入5％的盐酸溶液，不断搅拌。待溶液ph值在3左右时，停止加酸，此时得到白色固形物。
4、纯化
将板框过滤机连接至酸化罐上。将白色固形物用板框过滤机过滤。过滤后，加水冲洗，待过滤出的水检测呈中性为水洗结束。水洗的目的是将附着在胆汁酸固形物表面的水溶性杂质去除。将过滤后的白色固形物放入烘箱中，在100℃下干燥至水分不高于10％，得胆汁酸粗品。
5、重结晶
将得到的胆汁酸粗品投入萃取罐中，加入乙酸乙酯(加入乙酸乙酯的体积与胆汁酸粗品质量之比为10∶1)，搅拌溶解，待胆汁酸粗品基本溶解，加入无水硫酸钠脱水，收集溶液。将溶液打入浓缩罐中进行减压浓缩，回收乙酸乙酯。将浓缩液用压滤机压滤得到胆汁酸。
6、干燥
将得到的胆汁酸平铺在不锈钢烘干盘中，放入烘箱，通蒸汽进行真空干燥，干燥温度为100℃。待胆汁酸变成白色粉末状时，取样检测，如水分不超过1％，则视为干燥完毕。
对胆汁酸的相关卫生指标进行了检测，受试物重金属含量均符合国家饲料卫生标准，结果见表1。
表1本发明所述受试物胆汁酸的卫生指标
1.3试验料
在大口黑鲈的基础饲料中分别添加0、80、160、240、300、600mg/kg的胆汁酸，制成6种直径为2.0mm的膨化挤压浮性颗粒料，自然晾干后备用。6个处理组依次命名为d0、d80、d160、d240、d300、d600。
饲料中的水分、粗蛋白质、粗脂肪、灰分和总能分别采用105℃常压干燥法、凯氏定氮法、酸水解全脂肪测定法、550℃灼烧法和氧弹仪燃烧法测定。饲料配方及营养成分分析(见表2)。
表2.基础饲料配方及成分分析(风干基础，％)
*胆汁酸在预混料中添加。
1.4分组及试验管理
试验在国家水产饲料安全评价基地(北京)室内循环流水养殖系统中进行。随机挑选体质健康、个体均匀的大口黑鲈(起始平均体重6.17±0.02g)，分配到容积为0.26m的圆锥形养殖桶中。本试验设计5个处理组，每处理组6个重复，每桶30尾鱼。
每天表观饱食投喂2次，投喂时间分别为8：00，16：00。定期检测水质，水质条件保持在溶氧do＞7.0mg/l，水温25±3℃；总氨氮nh4+-n＜0.3mg/l；ph＝7.5-8.5；水温25±3℃。
养殖试验从2014年7月14日到2014年9月21日，共70天。
2、评价指标
2.1生长指标
试验期间，记录每日摄食量，试验70天后，分别对各桶鱼称重并统计存活率饲料系数、增重率、特定生长率等。
各指标计算公式：
存活率(survivalrate，sr，％)＝100×终末鱼数量/初始鱼数量；
相对增重率(weightgainrate，wgr，％)＝100×(末鱼均重一初始鱼均重+死鱼重)/初始鱼均重；
特定生长率率(specificgrowthrate，sgr％/d)＝100×[n(fbw)-n(ibw)]/t；其中ibw为鱼体初始均重(g)；fbw为终末均重(g)；t为实验天数。
饲料系数(feedconversionratio，fcr)＝摄食量/(末鱼重+死鱼重一初始鱼重)；
摄食率(feedingrate，fr％bodyweight/d)＝100×c/((w0+wt+wd)/2)/t，其中w0为鱼体初始总重(g)，wt为终末总重(g)，wd为死亡鱼体总重(g)；c为摄食量(g)，t为试验天数。
2.2脏器指数
每桶随机取3尾鱼测量体长、体重、内脏重、肝脏重、脾脏重。
各指标计算公式：
肥满度(conditionfactor，cf，g/cm3)＝平均体重(g)/[平均体长(cm)]3；
肝体比(hepatosomaticindex，hsi，％)＝100×肝脏重/全鱼重；
脏体比(viscerasomaticindex，vsi％)＝100×内脏重/体重；
脾脏指数(sp1eenindex，ssi，％)＝100×脾脏重/全鱼重；
2.3血浆脂肪代谢指标及抗氧化指标
每桶随机取3尾鱼，三氯叔丁醇麻醉后尾静脉取血，加入抗凝剂(2％naf+4％草酸钾)，用量为30ul/ml血液。将抗凝血在4℃，400omp的条件下离心10min，取上清血浆保存于-80℃的冰箱中待测。检测指标有：血浆脂肪代谢指标：总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、总胆红素(tbili)、高密度脂蛋白(ihdl)、碱性磷酸酶(alp)；血浆抗氧化指标：丙二醛(mda)、总超氧化物歧化酶(sod)、总抗氧化能力(t-aoc)、谷胱甘肽-s转移酶每(gst)、谷胱甘肽过氧化物酶(gshi-px)等。
2.4肝脏抗氧化指标、淀粉酶、脂肪酶及胆汁酸含量
每桶随机取2尾鱼的肝脏，保存于-80℃的冰箱中。
肝脏组织样品制备：取组织03-0.5g，加入介质匀浆(匀浆介质根据检测指标确定)，组织充分粉碎混匀后，3000mp，离心10分钟，取上清液，进行检测。
2.5肠道消化酶活性
每桶随机取2尾鱼的中肠和后肠(取中部靠中间1cm长作为中肠，取后一部分靠近肛门处1cm作为后肠)，保存于-80℃的冰箱中肠道组织样品制备；取组织0.2-0.5g，加入介质匀浆(胆汁酸匀浆介质为无水乙醇，淀粉酶及脂肪酶匀浆介质为0.7％6的生理盐水)，组织充分粉碎混匀后3000转/分钟，离心10分钟，取上清液，用用于检测淀粉酶、脂肪酶活性。
2.6胆囊胆汁酸含量
每桶随机取2尾鱼的胆囊的胆汁，保存于-80℃的冰箱中胆汁样品制备：取取出胆汁，加入无水乙醇匀浆，充分混匀后，300omp，离心10分钟，取上清液，进行检测。本试验所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
3、数据统计
试验数据以平均数士标准误(mean±s.e.)表示，所有数据用spssstatistics17.0软件进行单因子方差分析(anova)，duncan′s多重比较检验差异的显著性，显著性水平以p＜0.05计。
4、试验结果
4.1饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈生长性能的影响
在饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈生长性能的影响见表3。各组大口黑鲈存活率均高于96.67％，且各组没有显著差异。d300组末均重显著高于其他组，其wgr和sgr亦达到最高，并显著高于对照组和d80，d160组。该组摄食率也达到最高水平，并显著高于对照组(p＜0.05)。各组饲料系数没有显著差异(p＞-0.05)。依据特定生长率和摄食率结果进行回归模型分析，获得饲料中胆汁酸最适添加量为440.5mg/kg和283.3mg/kg(图1和图2)。
表3不同剂量胆汁酸对大口黑鲈生长性能的影响(mean±s.e.)
4.2饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈形体指标的影响
饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈形体指标的影响见表4。肝体比呈现先上升后下降趋势，d80组肝体比显著高于d240，d300和和d600组，和对照组没有显著差异。6个处理组之间的肥满度、脾脏指数、脏体比均没有显著差异(p＞0.05)。
表4不同剂量胆汁酸对大口黑鲈形体指标的影响(mean±s.e.)
4.3饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈血浆脂眆代谢指标及抗氧化功能的影响
饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈血浆脂肪代谢指标的影响见表5。各个处理组之间tg和alp没有显著差异(p＞0.05)。tc和hdl-c随饲料中胆汁酸的添加水平呈上升趋势，并在d240组达到最高(p＜0.05)：tbili星现不规律显著差异(p＜0.05)，其中d0组与其余各组均差异不显著(p＞0.05)。
饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈血浆抗氧化指标的影响见表6。由表6可以得出，mda、gst各组均无差异(p＞-0.05)，sod、t-aoc、gsh1-px呈显著上升趋势(p＜0.05)。
表5不同剂量胆汁酸对大口黑鲈血浆脂肪代谢指标的影响(mean±s.e)
表6不同剂量胆汁酸对大口黑鲈血浆抗氧化指标的影响(mean±s.e.)
4.4饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈肝脏组织中抗氧化指标及胆汁酸和胆固醇含量的影响
饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏抗氧化指标及胆汁酸和胆固醇含量的影响见表表7。由表7可得，gsh1-px、t-aoc呈现不规律显著差异(p＜0.05)，且d0组与其余各组无显著性差异。d600组gst最低，并显著低于do，d160和d240组(p＜0.05)。mda呈下降趋势且d300组最低。sod呈显著上升趋势(p＜0.05)。肝脏中tc没有显著差异，肝脏tba随饲料中胆汁酸的添加呈现上升趋势，并在d240组达到平台期(p＞0.05)。依据折线回归模型，以大口黑鲈肝脏总胆汁酸含量为指标时，饲料中胆汁酸的最适添加量为253.8mgkg(图3)。
表7不同剂量胆汁酸对大口黑鲈肝脏组织中抗氧化及胆汁酸代谢相关指标的影响(mean±s.e.)
4.5饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈肠道消化酶活性及胆囊胆汁酸含量的影响
由表8可见，大口黑鲈中肠淀粉酶含量显示不规律上升趋势，d300组达到最高(p＜0.05)，中肠脂肪酶显示不规律性差异(p＜0.05)。后肠淀粉酶在d600达到最高，显著高于其他各组；后肠脂肪呈先升后降的趋势，d80组达到最高，但各组均与对照组没有显著差异。各组胆囊胆汁酸含量呈显著上升趋势，且最高的d600组胆囊胆汁酸含量约为对照组的4.9倍。
表8不同剂量胆汁酸对大口黑鲈肠道消化酶活性及胆囊胆汁酸含量的影响(mean±s.e.)
本发明通过实验检测了以下项目：生长性能：存活率、特定生长率、增重率、饲料系数、摄食率、肥满度、肝体比、脏体比；血浆脂肪代谢及抗氧化性能：alp、tpro、alb、tbili、tc、tg、hdl、sod、mda、t-aoc、gst、gst-px；以及肝脏及胆囊的胆汁酸含量。
本发明通过试验结果表明：饲料中添加适量胆汁酸可有效促进摄食和生长性能，但同时增加肝脏总胆汁酸含量。分别以特定生长率、摄食率和肝脏中总胆汁酸含量为指标，通过回归模型分析获得大口黑鲈饲料中胆汁酸最适添加量分别为440.5mg/kg、283.3mg/kg和253.8mg/kg。方差分析结果显示饲料中添加300mg/kg胆汁酸，大口黑鲈获得最高生长性能，且肝脏胆汁酸含量与d240组没有差异。在以上添加范围内，胆汁酸有效降低大口黑鲈肝脏中mda含量，提高抗氧化能力；通过提高血浆中hdl-c含量显著促进脂肪代谢，同时有效提高了肠道淀粉酶和脂肪酶活性。综合生长性能，免疫抗氧化指标及胆汁酸在肝脏中的蓄积水平建议大口黑鲈饲料中胆汁酸推荐添加量为253.8mg/kg-283.3mg/kg，最高推荐剂量为300mg/kg。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。