一种促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂及制备方法与流程

本发明涉及动物饲料添加剂
技术领域：
，具体是涉及一种促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂及制备方法。
背景技术：
：现代养殖技术中，提高生产性能即意味着提高经济效益。但在饲养管理过程中，由于外源疾病的感染、特殊生理状态，如断奶、或幼畜（幼雏）胃肠功能不完善等，造成动物免疫水平较低，食欲变差、消化功能紊乱、腹泻等情况的发生，从而出现动物的生长抑制，甚至死亡等现象，降低养殖者的经济效益。针对上述等问题，饲养者往往会在仔猪饲养过程中大量应用抗生素，以此提高仔猪动物的生产性能。但抗生素滥用造成的抗药性、体内药物残留、体内微生态平衡被破坏等问题严重影响动物身体机能乃至生产性能的提高。因此，安全、环保的饲料原料的研制越来越收到人们的重视。木醋液是以醋酸为主的酚类和有机酸溶液，它是木头在制成木炭的过程中产生的气体冷凝再通过蒸馏或静置而得到的液体。主要成分由酮、醇、维生素、焦油以及矿物质等多种微量元素组合而成。木醋液在农林生产中应用广泛，主要可以应用于促进植物生长、防虫抑菌以及果蔬保鲜等方面。木醋液可以调节土壤ph值、增加有益微生物及改善土壤透气性，有效的解决了土壤的盐碱化等问题；木醋液对青霉菌及大肠杆菌等腐病菌有抑制作用；木醋液中含有的酚类有很好的抗氧化活性，可以作为保鲜剂来降低水果的腐烂指数和失水率，从而达到保鲜作用。木醋液在畜牧生产的应用虽不常见，但木醋液作为饲料添加剂添加在日粮中可以提高动物的生长性能，降低腹泻率；改善畜禽的肉质，提高畜禽免疫力并降低抗生素残留和胆固醇含量；提高肌肉中的谷氨酸等氨基酸含量，从而使畜禽的肉质和营养价值得到了全面提高。且木醋液在育肥饲料中的添加效果比单独添加抗生素的作用效果表现优异，还能够减小抗生素对人类健康的危害。木醋液是一种天然物质，加工方法简单易行，作用效果显著且来源广泛不污染环境，可以节约能源以避免不必要的浪费，由此可见，木醋液的应用前景十分广阔，势必对我国的农业发展做出重大贡献。然而，在木醋液的生产和应用中还存在诸多问题：（1）粗木醋液提纯或蒸馏工艺还不完善，质量难以保证；（2）木醋液直接添加到饲料中难以发挥木醋液的作用；（3）木醋液如何与其他添加剂配合使用发挥更好的效果还需要进一步研究。如何制备安全木醋液产品是畜牧学科亟待解决的问题。技术实现要素：为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一种促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂及制备方法，其中木醋液的制备工艺提高了木醋液的纯度，同时有效降低了有害杂质；以木醋液和纳豆芽孢杆菌菌液为主要成分的添加剂促进了纳豆芽孢杆菌在肠道的快速定植和增殖，抑制肠道有害菌的生长，从而增强机体的抵抗力和抗病能力，二者协同增效，提高动物免疫力的性能优异。一种促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂，其技术要点是：所述添加剂原料所占质量百分比为：纳豆芽孢杆菌菌液99.8-99.95%，精制木醋液0.05%-0.2%；所述促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂的的制备方法，包括如下步骤：（1）配置lb基础培养基：用1mol/l的hcl溶液和naoh溶液控制ph值在6.9-7.1之间，在121℃下高压灭菌15min、冷却至室温；（2）制备纳豆芽孢杆菌菌液：将活化的纳豆芽孢杆菌按2%（质量百分数）接种到上述lb基础培养基中，将瓶口封死，在37℃、180r/min培养箱中恒温震荡培养23-25h；（3）制备木醋液纳豆芽孢杆菌菌液：将精制木醋液按0.05%-0.2%（质量百分数）加入到上述纳豆芽孢杆菌菌液中，于37℃，180r/min震荡培养箱中培养7-9h；所得黄褐色菌液即为木醋液芽孢杆菌菌液，其活菌数为1.7×109-1.8×109log10cfu/ml。所述精制木醋液的制备方法为：（1）木棒的制备：以果木、柞木废枝、木屑、地板边角料的一种或几种为原料，放入烘干釜內，密闭绝氧，采用外加温进行排潮处理，加温温度为140~160℃，持续加温9~11小时，然后用机器粉碎，并烘干将水分降到10%以下，用成型设备将锯末制成直径4-6cm，长30-40cm木棒；（2）粗木醋液的制备：将制备好的木棒放入干馏热解釜内，经四阶段干馏热解、三级冷却、气液分离、蒸馏制得粗木醋液；所述四阶段干馏热解的具体方法为：第一阶段热解温度由常温均匀升温到155~170℃，升温时间9~12h；第二阶段热解温度由160℃左右均匀升温到260~280℃，升温时间为2~4h；第三阶段热解温度由270℃左右均匀升温到360~380℃，升温时间为3~5h；第四阶段热解温度由370℃左右均匀升温到500~800℃，升温时间为2~4h；根据温度传感器指示的釜内温度，当温度达到300℃时关闭进风口，缺氧燃烧。所述三级冷却的具体方法为：将干馏热解所产生的气液混合物输送到三级冷却装置，一级冷却使气液混合物温度将降至360-380℃，冷却25~35秒；二级冷却使气液混合物温度降至190~220℃，冷却10~15秒；三级冷却使温度降至60-70℃，冷却15~20秒；所述气液分离的具体方法为：将三级冷却产生的气、液输送到气液分离器，将温度降至30~40℃，10秒，打开底座的进风口，将气体送入储气罐，液体为焦油和醋液，实现气液分离；液体进入油液分离器；所述蒸馏的具体方法为：将气液分离器中分离出的液体，即油液（焦油和醋酸）输送蒸馏反应釜中，蒸馏温度60-70℃，经30秒，分离出木焦油和木醋液原液；其中釜内底部油状物为木焦油，上部为液态物质为木醋液原液，即为粗木醋液；蒸馏釜的压力控制在负压3左右；（3）精制木醋液制备：将步骤（2）中所得粗木醋液进行蒸馏、精馏、冷凝、过滤，得黄褐色液体，为精制木醋液；所述蒸馏过程参数设置：将所述粗木醋液输送入蒸馏器，粗木醋液由液态转变为气态。温度为90℃~120℃，时间为50~80分钟；所述精馏过程参数设置：将气态物质输送入精馏器中。精馏器温度80℃~100℃，时间为50~80分钟；所述冷凝过程参数设置：将上述精馏后的气态物质输送入冷凝器，温度30~40℃，10~15秒。气态物质变成液态物质；所述过滤过程：液态物质经滤网和活性炭过滤；所述精制木醋液理化指标，见表1；表1精制木醋液理化指标进一步的，所述木棒制备加温温度为150℃，持续加温10小时；进一步的，纳豆芽孢杆菌的活化方法：将所有玻璃试验器皿及lb液体培养基进行高压灭菌，用酒精擦拭无菌操作台并用紫外线灯照射灭菌；（1）活化第一代：将100mllb液体培养基分别倒入四个试管中，每个试管接种一针纳豆芽孢杆菌进行恒温振荡（180r/min37℃）培养24h；（2）活化第二代：制作100mllb液体培养基分别倒入四支试管中，每只吸取一代中的500μl菌液，进行恒温振荡（180r/min37℃）培养24h；（3）第二代扩增培养，也算作活化第三代：制作300mllb液体培养基，吸取第二代菌液6ml进行恒温振荡培养（180r/min37℃）；将活化的第一代、第二代放入-80℃冰箱中保存备用；第三代作为活化好的芽孢杆菌进行试验。本发明还提出了一种促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂应用方法：将所述木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂添加在全价饲料中，添加浓度为1ml-5ml/kg，现喂现拌。本发明的有益效果：（1）本发明制备的木醋液是由林木植物的加工废弃物、废材（料）的并经生物质碳化热解制备的，在废弃物的再加工和综合利用上具有积极作用。（2）本发明的木醋液菌液饲料添加剂由精制木醋液和纳豆芽孢杆菌菌液在一定条件下培养而成。木醋液为菌生长提供酸性条件，促进纳豆芽孢杆菌在动物体肠道内定植，提高其对多种酶及胃肠道胆盐的耐受性，从而增强机体的免疫能力，提高生产性能。两者协同增效，效果优于单独添加。附图说明图1为精制木醋酸制备流程图；图2不同浓度木醋液对纳豆芽孢杆菌生长的影响。具体实施方式实施例1一种促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂，所述添加剂原料所占质量百分比为：纳豆芽孢杆菌菌液99.9%，精制木醋液0.1%；所述促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂的的制备方法，包括如下步骤：（1）配置lb基础培养基：用1mol/l的hcl溶液和naoh溶液将ph值调至7，在121℃下高压灭菌15min、冷却至室温；（2）制备纳豆芽孢杆菌菌液：将活化的纳豆芽孢杆菌按2%（质量百分数）接种到上述lb基础培养基中，将瓶口封死，在37℃、180r/min培养箱中恒温震荡培养24h；纳豆芽孢杆菌购于饲料市场，厂家为扬州市海诚生物科技有限公司。（3）制备木醋液纳豆芽孢杆菌菌液：将精制木醋液按0.1%（质量百分数）加入到上述纳豆芽孢杆菌菌液中，于37℃，180r/min震荡培养箱中培养8h；所得黄褐色菌液即为木醋液芽孢杆菌菌液，其活菌数为1.8×109log10cfu/ml；上述精制木醋液的制备方法为：（1）木棒的制备：以果木、柞木废枝、木屑、地板边角料的一种或几种为原料，放入烘干釜內，密闭绝氧，采用外加温进行排潮处理，加温温度为140~160℃，持续加温9~11小时，然后用机器粉碎，并烘干将水分降到10%以下，用成型设备将锯末制成直径4-6cm，长30-40cm木棒。优选加温温度为150℃，持续加温10小时；（2）粗木醋液的制备：将制备好的木棒放入干馏热解釜内，经四阶段干馏热解、三级冷却、气液分离、蒸馏制得粗木醋液；所述四阶段干馏热解的具体方法为：第一阶段热解温度由常温均匀升温到155~170℃，升温时间9~12h；第二阶段热解温度由160℃左右均匀升温到260~280℃，升温时间为2~4h；第三阶段热解温度由270℃左右均匀升温到360~380℃，升温时间为3~5h；第四阶段热解温度由370℃左右均匀升温到500~800℃，升温时间为2~4h；根据温度传感器指示的釜内温度，当温度达到300℃时关闭进风口，缺氧燃烧。所述三级冷却的具体方法为：将干馏热解所产生的气液混合物输送到三级冷却装置。一级冷却使气液混合物温度将降至360-380℃，冷却25~35秒；二级冷却使气液混合物温度降至190~220℃，冷却10~15秒；三级冷却使温度降至60-70℃，冷却15~20秒。所述气液分离的具体方法为：将三级冷却产生的气、液输送到气液分离器，将温度降至30~40℃，10秒，打开底座的进风口，将气体送入储气罐，液体为焦油和醋液，实现气液分离；液体进入油液分离器；所述蒸馏的具体方法为：.将气液分离器中分离出的液体，即油液（焦油和醋酸）输送蒸馏反应釜中，蒸馏温度60-70℃，经30秒，分离出木焦油和木醋液原液；其中釜内底部油状物为木焦油，上部为液态物质为木醋液原液，即为粗木醋液；蒸馏釜的压力控制在负压3左右；（3）精制木醋液制备：将上述粗木醋液进行蒸馏、精馏、冷凝、过滤，得黄褐色液体，为精制木醋液；所述蒸馏过程参数设置：将上述粗木醋液输送入蒸馏器，粗木醋液由液态转变为气态。温度为90℃~120℃，时间为50~80分钟；所述精馏过程参数设置：将气态物质输送入精馏器中。精馏器温度80℃~100℃，时间为50~80分钟；所述冷凝过程参数设置：将上述精馏后的气态物质输送入冷凝器，温度30~40℃，10~15秒。气态物质变成液态物质；所述过滤过程：液态物质经滤网和活性炭过滤；所述精制木醋液理化指标见表1；上述纳豆芽孢杆菌的活化方法：将所有玻璃试验器皿及lb液体培养基进行高压灭菌，用酒精擦拭无菌操作台并用紫外线灯照射灭菌；（1）活化第一代：将100mllb液体培养基分别倒入四个试管中，每个试管接种一针纳豆芽孢杆菌进行恒温振荡（180r/min37℃）培养24h；（2）活化第二代：制作100mllb液体培养基分别倒入四支试管中，每只吸取一代中的500μl菌液，进行恒温振荡（180r/min37℃）培养24h；（3）第二代扩增培养，也算作活化第三代：制作300mllb液体培养基，吸取第二代菌液6ml进行恒温振荡培养（180r/min转37℃）；将活化的第一代、第二代放入-80℃冰箱中保存备用；第三代作为活化好的芽孢杆菌进行试验。应用方法：将上述木醋液菌液饲料添加剂添加在全价饲料中，添加浓度为1ml-5ml/kg，现喂现拌。实施例2一种促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂，所述添加剂原料所占质量百分比为：纳豆芽孢杆菌菌液99.85%，精制木醋液0.15%；所述促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂的的制备方法，包括如下步骤：（1）配置lb基础培养基：用1mol/l的hcl溶液和naoh溶液将ph值调至6.9，在121℃下高压灭菌15min、冷却至室温；（2）制备纳豆芽孢杆菌菌液：将活化的纳豆芽孢杆菌按2%（质量百分数）接种到上述lb基础培养基中，将瓶口封死，在37℃、180r/min培养箱中恒温震荡培养23h；纳豆芽孢杆菌购于饲料市场，厂家为扬州市海诚生物科技有限公司。（3）制备木醋液纳豆芽孢杆菌菌液：将精制木醋液按0.15%（质量百分数）加入到上述纳豆芽孢杆菌菌液中，于37℃，180r/min震荡培养箱中培养9h；所得黄褐色菌液即为木醋液芽孢杆菌菌液，其活菌数为1.78×109log10cfu/ml；其精制木醋酸制备和纳豆芽孢杆菌的活化方法同实施例1。应用方法：同实施例1。实施例3一种促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂，所述添加剂原料所占质量百分比为：纳豆芽孢杆菌菌液99.80%，精制木醋液0.2%；所述促生长木醋液纳豆芽孢杆菌菌液添加剂的制备方法，包括如下步骤：（1）配置lb基础培养基：用1mol/l的hcl溶液和naoh溶液将ph值调至7，在121℃下高压灭菌15min、冷却至室温；（2）制备纳豆芽孢杆菌菌液：将活化的纳豆芽孢杆菌按2%（质量百分数）接种到上述lb基础培养基中，将瓶口封死，在37℃、180r/min培养箱中恒温震荡培养25h；纳豆芽孢杆菌购于饲料市场，厂家为扬州市海诚生物科技有限公司。（3）制备纳豆木醋液芽孢杆菌菌液：将精制木醋液按0.2%（质量百分数）加入到上述纳豆芽孢杆菌菌液中，于37℃，180r/min震荡培养箱中培养7h；所得黄褐色菌液即为木醋液芽孢杆菌菌液，其活菌数为1.79×109log10cfu/ml；其精制木醋酸制备和纳豆芽孢杆菌活化方法同实施例1。应用方法：同实施例1。实施例4结合体外试验、动物饲养试验和微生物学检验，对本发明作进一步的描述：1木醋液纳豆芽孢杆菌菌液生长情况1.1材料与方法1.1.1试验材料在纳豆芽孢杆菌菌液中加入浓度为0.00%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的木醋。将上述培养液于37℃-180r/min培养箱中。每2h取样，于4℃冰箱，待测od值。在不同培养时间下，木醋液纳豆芽孢杆菌菌液的生长情况。利用公式g=(t2-t1)/3.322(lgx2-lgx1)计算代时g，根据纳豆芽孢杆菌在每个时间段代时g的大小来判定该时间段木醋液纳豆芽孢杆菌的繁殖能力。本实验所用木醋液菌液饲料添加剂为实施例1所述。测定木醋液菌液的活菌数。1.1.2试验方法od值测定方法：酶标仪测定木醋液菌液培养，每2h测定菌液的od610值。活菌数测定方法：采用平板菌落计数法进行检测。在无菌操作台上进行以下操作：取1g粪样于装有9ml灭菌生理盐水的试管中，振荡器混匀；然后取稀释液1ml置于有9ml灭菌盐水的试管中，混匀；以此类推，稀释至10-7。选10-4、10-5、10-6三个梯度，每梯度三个重复。取50vl稀释液，置于lb培养基中，37℃，恒温培养24h，取菌落个数为30-300的菌落进行平板计数，并进行统计分析，结果以cfu/ml表示。1.2结果与分析纳豆芽孢杆菌菌液中添加不同浓度木醋液，其od值随着培养时间呈先上升后下降的变化。纳豆芽孢杆菌菌液中添加0.05%-0.20%的木醋液且培养时间为10-14h其od值高。木醋液是富含有机酸的液体，纳豆芽孢杆菌在适宜的酸性环境下生长繁殖最快，且木醋液的酸性成分与纳豆芽孢杆菌产生了协同作用。本试验说明较低和较高浓度的的木醋液均不利于纳豆芽孢杆菌的生长，适宜的木醋液浓度可以促进纳豆芽孢杆菌的生长。表2不同浓度木醋液对纳豆芽孢杆菌的生长影响（od值）时间0%0.01%0.05%0.10%0.20%0.30%0.40%合计0h0.04150.04150.04150.04150.04150.04150.04150.29052h0.05410.05850.06030.06260.05660.05240.04920.39374h0.09130.09820.10670.11350.10230.08910.07340.67456h0.27420.28910.30140.32350.29200.26850.22141.97018h0.86170.87970.90420.94270.89310.85020.71516.046710h1.16111.20161.24851.27821.20811.15850.98448.240412h1.23111.33201.34481.38911.31541.18411.07068.867114h1.15331.21911.26421.31281.24031.14710.97128.308024h1.06511.17461.20261.22621.18831.04760.88327.7876合计5.93346.29436.47426.69016.33765.8395.01纳豆芽孢杆菌-木醋液菌液活菌数通过利用平板菌落计数法进行检测，经检测得出活菌数为1.8×109log10cfu/ml。2木醋液菌液饲料添加剂对断奶仔猪生长、免疫和抗氧化性能的影响2.1材料与方法2.1.1试验动物和基础日粮选用21日龄（平均体重为4.72kg）的“大白×长白×杜洛克”三元杂交断奶仔猪144头。本试验基础日粮是以玉米-豆粕型为主的全价饲料。2.1.2试验设计采用完全随机化试验设计，分成4组，每组6个重复，每个重复6头猪。分别饲喂基础日粮（对照组）、基础日粮+0.1%木醋液（木醋液组）、基础日粮+纳豆芽孢杆菌（芽孢杆菌组）、基础日粮+0.1%木醋液+纳豆芽孢杆菌（木醋液菌液组）。试验期21d，预饲期3d。试验第21d，停止饲喂，正常饮水，每个重复选2头，静脉采血10ml，4℃、3000r/min离心，分离血清于冰箱保存。本实验所用木醋液菌液饲料添加剂为实施例1所述。2.1.3指标测定方法生长性能测定:：在试验期第1和21d早晨，空腹称重，记录每天采食量，计算平均日采食量（adfi）、平均日增重（adg）和料重比（f/g）。腹泻率测定：试验期间，早上喂料前，观察并记录试验猪每天的腹泻发生情况，试验结束后计算各组的腹泻率，计算公式如下：腹泻率(%)=试验期腹泻头次总数/（试验猪头数×试验天数）×100%。血清免疫指标的测定：细胞白介素4（il-4）、免疫球蛋白m（igm）、白细胞介素6（il-6）、免疫球蛋白a（iga）、免疫球蛋白g（igg）。血清抗氧化指标：丙二醛（mda）、总抗氧化能力（t-aoc）。2.2结果与分析2.2.1木醋液菌液对断奶仔猪生产性能的影响木醋液菌液组的adg显著高于对照组和纳豆芽孢杆菌组（p<0.05），分别比对照组、纳豆芽孢杆菌组高出13.22％和8.43％。各处理组的日采食量没有差异（p>0.05）。木醋液菌液组的料重比最最低，与对照组相比降低了12.95%（p<0.05）。且木醋液菌液组无腹泻仔猪，显著优低于其他处理组（p<0.05）纳豆芽孢杆菌和木醋液可以增强仔猪的免疫能力，同时提高仔猪抗应激能力，有利于维持肠道的正常功能，提高了断奶仔猪的消化吸收能力。木醋液可以有效的协同纳豆芽孢杆菌调整改善断奶仔猪肠道内的微生物平衡，增强动物抗病能力，促进生长水平以及提高饲料利用率。又因其有抑菌作用，所以对各种病因引起的断奶仔猪腹泻均有一定的防治作用。表3木醋液菌液对断奶仔猪生长性能影响项目对照组木醋液组纳豆芽孢杆菌组木醋液菌液组adg(g)335.56±22.67b373.52±22.23ab354.08±23.36b386.68±23.86aadfi(g)645.71±9.81653.47±8.55641.11±5.43655.05±5.80f/g1.93±0.03a1.74±0.03b1.83±0.02a1.68±0.02b腹泻率（%）10.68±0.03a2.58±0.07b2.26±0.11b0.00±0.00b注：同行不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；不标字母表示差异不显著（p>0.05）。下表同。2.2.2木醋液菌液对断奶仔猪免疫指标的影响从表4中可知，日粮中添加木醋液菌液显著提高了血清中iga、igm和igg含量，与对照组差异显著（p<0.05）。木醋液菌液显著提高了断奶仔猪血清中il-4和il-6的含量（p<0.05）。木醋液是一种以醋酸为主的有机酸和酚类溶液，具有提高动物体免疫力的协同作用。纳豆芽抱杆菌是作为一种微生态制剂可以在动物体肠道内定植，同时又对多种酶及胃肠道胆盐也有很好的耐受性，可以有效的增强机体的免疫能力。纳豆芽孢杆菌和木醋液中含有多种活性物质，可以调节免疫器官的发育（如肾上腺素、淋巴、脾脏、胸腺等），还可通过神经—内分泌—免疫调节来发挥其免疫功能。表4断奶仔猪免疫球蛋白和白介素含量项目对照组木醋液组纳豆芽孢杆菌组木醋液菌液组iga（g/l）4.68±0.66a5.54±0.41ab6.11±0.42ab7.41±0.42bigm（g/l）4.46±0.64bc5.32±0.41b5.97±0.48b7.04±0.51aigg（g/l）13.38±1.16b14.69±1.92ab15.58±0.97a16.28±0.57ail-4（ng/l）75.08±5.961b89.75±6.13a90.45±8.61a92.33±7.89ail-6（ng/l）123.64±10.14b144.13±9.84a149.76±12.22a150.86±14.54a2.2.3木醋液菌液对断奶仔猪抗氧化指标的影响表5结果显示，木醋液菌液组的mda含量较低，且木醋液菌液组、木醋液组的t-aoc含量显著高于对照组（p<0.05）。mda是一种脂质过氧化物，能使生物的生物膜变性导致组织老化和破坏，其含量高低反映脂质过氧化的强度和速率，从而反映氧自由基的代谢情况。研究表明，应激状态下mda含量升高。总抗氧化能力（t-aoc）是机体抗氧化机制的综合体现，常用于评价抗氧化能力的高低（张君志等，2006）。本发明的木醋液纳豆芽孢杆菌菌液具有很好的抗氧化物性能，它可以提高动物体抗氧化能力。表5断奶仔猪血清t-aoc和mda含量3木醋液菌液饲料添加剂对断奶仔猪粪中菌群数量的影响3.1材料与方法3.1.1试验动物和基础日粮选用21日龄（平均体重为4.72kg）的“大白×长白×杜洛克”三元杂交断奶仔猪144头。本试验基础日粮是以玉米-豆粕型为主的全价饲料。3.1.2试验设计采用完全随机化试验设计，分成4组，每组6个重复，每个重复6头猪。分别饲喂基础日粮（对照组）、基础日粮+0.1%木醋液（木醋液组）、基础日粮+纳豆芽孢杆菌（芽孢杆菌组）、基础日粮+0.1%木醋液+纳豆芽孢杆菌（合生元组）。试验期21d，预饲期3d。本实验所用木醋液菌液饲料添加剂为实施例1所述。3.1.3粪中菌群测定试验第15d，每个重复取2头，收集新鲜粪便，于无菌自封袋中，即刻送入实验室，进行菌群测定。粪样菌群计数方法：菌落计数方法为平板涂布法。在无菌操作台上进行以下操作：取1g粪样于装有9ml灭菌生理盐水的试管中，振荡器混匀；然后取稀释液1ml置于有9ml灭菌盐水的试管中，混匀；以此类推，稀释至10-7。选10-4、10-5、10-6三个梯度，每梯度三个重复。取50vl稀释液，置于相应的培养基中，芽孢杆菌、大肠杆菌37℃恒温培养24h，乳酸杆菌与双歧杆菌在厌氧培养箱37℃恒温培养48h。取菌落个数为30-300的菌落进行平板计数，并进行统计分析，结果以cfu/ml表示。3.2结果与分析如表6所示，木醋液组、纳豆芽孢杆菌组和木醋液菌液组均显著降低断奶仔猪粪中大肠杆菌的数量（p<0.05）。木醋液菌液组显著提高了乳酸杆菌和纳豆杆菌的数量，提高效果优于木醋液组和纳豆芽孢杆菌组。肠道内有害菌大量增殖，使肠道对内、外毒素的吸收量增加，也使其吸收氯离子与钠离子的能力下降，出现腹泻病症。纳豆芽孢杆菌作为一种微生态制剂可以很好的在动物体肠道内定植，同时可耐受对多种酶及胃肠道胆盐作用，并可抑制大肠杆菌，还可以有效的起到增强机体免疫力起到抑制有害菌的作用。木醋液是一种富含有机酸的酸性液体，木醋液抑制肠道有害菌的生长，促进有益菌的繁殖。木醋液能够有效的抑制有害菌的生长繁殖，调整改善断奶仔猪的肠道菌群，并且可以有效的协同纳豆芽孢杆菌增强其在动物肠道内的定植能力，提高动物机体的免疫力，减少产生不必要的应激。表6断奶仔猪粪中菌群数量项目对照组木醋液组纳豆芽孢杆菌组木醋液菌液组大肠杆菌(log10cfu/g)8.92±0.10a8.50±0.15b8.48±0.18b8.42±0.15b乳酸杆菌(log10cfu/g)8.13±0.19b8.44±0.13a8.43±0.13a8.53±0.07a纳豆杆菌(log10cfu/g)7.95±0.32b8.12±0.34b9.10±0.22a9.72±0.32a本发明的原理：纳豆芽抱杆菌作为一种微生态制剂可以在动物体肠道内定植，同时可耐受多种酶及胃肠道胆盐作用，抑制大肠杆菌等有害菌的生长，有效的增强机体的免疫能力。木醋液富含醋酸等有机酸，可以为纳豆芽孢杆菌提供的酸性环境和养分，使其大量生长；通过促进有益菌的繁殖，扼制有害菌的生长，从而对肠道菌群进行调整改善，使其达到促进机体健康的目的。本发明的木醋液纳豆芽孢杆菌菌液的发明依据是木醋液的酸性成分促进了纳豆芽孢杆菌的生长繁殖，并与其产生的协同作用，从而促进动物的生长性能。当前第1页12