一种中药残渣降解菌及其在制备禽用饲料添加剂中的应用的制作方法

本发明涉及中药领域、饲料添加剂领域和生物制药技术领域，具体涉及一种中药残渣降解菌及其在制备禽用饲料添加剂中的应用。

背景技术：

随着现代农业的发展和农业科技的进步，人们更加关注养殖动物的健康问题，同时抗生素大量的不合理的使用，已导致耐药菌和残留等诸多问题的产生，因此近几年中药产品在动物保健和防治疾病方面的应用越来越受到关注，众多企业开始涉入中兽药领域，随之出现的是中药资源消耗量的不断增加，进而导致资源危机，严重制约了现代农业的可持续发展战略。同时，中药提取废弃物大量排放也对环境产生严重影响，据相关统计，中国每年的中药残渣的排放量约为3000多万吨，并且逐年增加。目前由于中药残渣在可循环利用方面非常有限，处理方式主要以堆放、掩埋或焚烧为主，资源消耗大，有效利用率低，还有容易产生二次污染，不仅对周围环境产生严重的破坏，也会造成资源的严重浪费，成为影响环境可持续发展的重点问题，所以发展循环农业经济，杜绝污染浪费，寻找资源的循环利用途径成为目前资源与环境发展战略中的共同目标。

黄芪是一种豆科植物干燥的根，黄芪多糖为其主要活性成分。黄芪多糖作为饲料添加剂可以有效的增强动物机体非特异性免疫和体液免疫，显著提高机体的免疫能力和抗应激能力等功能。

本专利所用降解菌株为从太仆寺旗黄芪种植基地植被中分离筛选得到的cgmccno.16268菌株，具有在黄芪残渣表面生长速度快，酶系丰富，代谢能力强等特点，能够有效增加黄芪残渣中的有效成分，提高可消化性。

本专利所用黄芪残渣是中药材黄芪经过多重水提取处理工艺后剩余的废弃物，虽经过多重水处理，大部分水溶性活性物质已被提取，但残渣内仍残存一定量水溶性活性成分(如黄芪多糖和黄芪甲苷等)和大部分水不溶性活性成分(如黄酮类、皂苷类等)，其中有些活性成本被致密的纤维素细胞包裹于其中，难以有效溶出，在直接饲喂过程中不能在动物肠道内发挥其主要功能进而导致资源的浪费。同时，残渣本身还含有粗蛋白、粗纤维、粗多糖、无机元素、微量元素等营养成分，在农业肥料、禽畜饲料、造纸等方面具有极好的开发价值。

目前，在中药残渣高效利用技术方面出现了新研究内容，例如申请号为cn201310311826.5的中国发明专利公开了“一种中药渣发酵饲料及其制备方法”，申请号为cn201210438591.1的中国发明专利公开了“一种利用真菌发酵中药渣生产饲料的方法”，申请号为cn201310145869.0的中国发明专利公开了“一种混合中药渣饲料的制备方法”，申请号为cn101683124的中国发明专利公开了“利用黄芪药渣发酵生产禽畜饲料添加剂的方法”，申请号为cn200910184046的中国发明专利公开了“黄芪药渣发酵开发的植物源动物用免疫增强剂”，在上述有关利用中药残渣生产饲料的专利中，或者是中药残渣的添加比例较低，不足整个固体培养基组成的50％，甚至更少，既不能实现对中药残渣的大量消纳利用，也难以体现中药残渣的应用价值；或者是中药残渣的发酵周期较长，能源消耗大，易滋生大量杂菌，产品质量不稳定，不易推广；或者是产品的附加值低，饲喂效果不理想；其中专利“利用黄芪药渣发酵生产禽畜饲料添加剂的方法”提供的产品在蛋鸡上应用效果理想，但是其黄芪残渣的使用比例不高，投喂剂量过高，致使黄芪残渣有效价值未能充分发挥。专利“黄芪药渣发酵开发的植物源动物用免疫增强剂”利用药用真菌蝉花菌对黄芪残渣进行双向发酵，极大地提升了发酵物的药用价值，但是该工艺的发酵时间过长，不灭菌或灭菌不彻底极易造成中期杂菌污染，严重影响产品质量，蝉花菌的生长条件较为苛刻，难以满足大规模生产要求。

本专利突破黄芪残渣高效利用的众多瓶颈，利用cgmccno.16268菌株和酵母菌二步发酵模式，彻底解决了黄芪残渣中活性物质利用不充分，产品营养物质单一，发酵周期长，质量控制不稳定等问题，经过临床试验验证该专利产品在提高肉鸡生长性能、增强机体免疫力和抗应激能力方面具有显著的促进作用。目前该产品已经开始车间大规模生产，并在家禽养殖市场中推广应用，市场反馈良好，并得到广大养殖户的广泛认可。现在公司年剩余上百吨的黄芪残渣已基本被消纳，既为公司创造了更多的社会价值，又为社会减轻了环境负担。

技术实现要素：

本发明与现有的中药残渣制备饲料的工艺相比具有以下优势：

1.本发明利用生物技术手段从内蒙黄芪种植基地土壤和植被中初选出85株高纤维素活力霉菌，通过复筛试验最终得到一株能够在以黄芪残渣为唯一培养底物的基质中快速生长，并且分泌丰富纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的微生物菌株，该菌株分类命名为宇佐美曲霉aspergillususamil，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)于2018年8月31日保藏，保藏编号为cgmccno.16268，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。利用该菌自身酶解特性和贯穿特性，将黄芪残渣中致密的纤维结构发生裂解，长链分子降解成短链或小分子物质，使其更易被动物机体吸收利用；同时裂解作用还会使被严密包裹在纤维结构内部的活性物质充分释放，进一步提高了该专利产品的药用价值。

2.本发明采用酵母菌二次发酵，一能降低亚麻籽饼中氰化物含量、均衡亚麻籽蛋白水平，一能通过自身需氧发酵和厌氧发酵充分积累体外代谢产物，既能增加了产品的营养价值，又能丰富了产品的呈味成分。

3.本发明利用黄芪残渣为主要作用底物，利用cgmccno.16268菌株和酵母菌二步发酵模式，菌体与底物之间能量与物质的转化，极大地丰富了产品药用价值和营养价值。

4.本发明均采用单一纯种发酵，通过严格控制发酵条件，能够有效的监控微生物的发酵趋势，保证产品质量的稳定可靠。

5.本发明产品工艺采用超微粉碎，进一步提升了产品消化吸收性能。

本发明提供了一种利用保存菌种cgmccno.16268降解中药残渣制备禽用饲料添加剂的方法，其特征在于工艺步骤如下：

本申请专利利用中药残渣制备禽用饲料添加剂的制作方法，以黄芪残渣为主要原料，农副产品麸皮和亚麻籽饼为辅料，采用保存菌种cgmccno.16268和酵母菌两步发酵模式，好氧与厌氧两种发酵方式，最终经过烘干，超微粉碎得到成品。

本发明还提供了一种利用中药残渣制备禽用饲料添加剂的方法，其实现方法如下：

1.目标微生物筛选：在黄芪植被土壤及腐烂植物潮湿处采集样品，用羧甲基纤维素液体培养基富集培养，分离得到85株菌，利用刚果红培养基分离出22株高纤维素酶活力菌株，再通过定量检测纤维素酶活、葡聚糖酶活、果胶酶活和糖化酶活，最终筛选出能够在黄芪残渣表面快速生长的霉菌——保存编号为cgmccno.16268菌株。

从不同植被的土壤层中分离得到85株菌，对其进行编号统计后得到结果，见下表，其中大部分菌株为丝状真菌。

表不同植被土壤中分离得到的微生物统计表

利用琼脂块扩散法对分离得到的85株菌进行初步筛选试验，以菌落周围产生的透明圈直径与菌落直径的比值(dp/dc)作为评价标准，得到22株dp/dc值较大的菌株，结果见附图1。

通过初步筛选得到22株菌对纤维素降解效果较好，其中从黄芪植被地表分离出的菌株共8株数量最多，说明黄芪植被地表微生物对黄芪植被生长环境的适应性最强。同时，在各个不同植被土壤层中筛选出来微生物菌种的目标特征都存在不同差异，说明不同菌种或同一菌种不同菌株之间在分解纤维素的生理特性上存在差异。菌株m-11、k-15、k-22和c-23在分解基质产生的透明圈直径与菌落直径比值明显低于其他菌株，故将其排除，对其他18株进行下一步复筛试验，结果见下表。

根据上述酶活数据测定结果，总体分析得出在4种酶活特性m-31菌株表现出更适合黄芪残渣的降解发酵。后期对菌株各项生长特性的试验进一步表明，m-31菌株在发酵黄芪残渣方面具有明显优势。具体试验结果见附图2和附图3。后将菌种m-31保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株编号cgmccno.16268，保存时间2018年8月31日。

2.保存菌种cgmccno.16268种曲的制备：将麸皮与自来水按照1:1的比例进行混合，装入三角瓶中厚度不超过2cm，纱布封口，在121℃条件下灭菌20min，待培养基降至室温后，按照无菌操作要求，从cgmccno.16268菌株的斜面试管中挑取少量孢子，接种到固体培养基中，28℃恒温培养，24h后倒瓶培养，3d培养结果，自然晾干或低温烘至干燥，备用。

3.酵母菌选择：为了改善亚麻籽饼中的蛋白水平、降低氰化物含量，本专利从48株酵母菌中筛选出一株能降解亚麻籽饼中氰化物的酵母菌，初步鉴定为假丝酵母。经过工艺优化，该酵母菌能将亚麻籽饼中氰化物含量从352mg/kg降低至162mg/kg。最终保证产品中氰化物含量≤13mg/kg。

4.酵母菌种子液的制备：

三角瓶种子液制备：按照以下质量配比，酵母浸膏1.0％、蛋白胨1.5％、葡萄糖3.0％、氯化钙0.01％、硫酸镁0.04％、磷酸二氢钾0.5％，补足1l的纯化水，完全溶解后，在121℃条件下灭菌20min，降至室温后，按照无菌操作要求，从酵母菌的斜面试管中挑取少量菌苔接种到液体三角瓶培养基中，28℃恒温，震荡培养16h，即可使用。

一、二级种子液制备：培养基的质量配比，糖蜜8.0～15.0％、蛋白胨0.5～1.5％、葡萄糖0.1～1.0％、硫酸铵0.08～0.15％，氯化钙0.01～0.05％、硫酸镁0.04～0.08％、磷酸二氢钾0.1～0.8％，按照已设定原料添加比例配制培养基，充分溶解后，通蒸汽121℃灭菌30min，降至所需温度，接种10％上级种子液，设定温度28℃，转速200rpm，发酵时间18h。

5.黄芪残渣好氧发酵工艺：

固态物料所含组分及各组分的质量分数为：预处理后的黄芪残渣100份，麸皮5～10份，在121℃条件下灭菌30min，降至室温后，按照质量分数0.1％接种量接种保存菌种cgmccno.16268种曲，混合均匀后，装入曲盘，厚度不超过5cm，移入曲盘室恒温28℃发酵2～3天，发酵完成。

6.固体酵母菌发酵工艺：

将步骤3保存菌种cgmccno.16268发酵完成的物料进行二次酵母菌发酵，二次发酵固态物料质量分数比例为保存菌种cgmccno.16268发酵物100份，麸皮30～50份，亚麻籽饼10～30份，尿素0.1～0.5份，按照10％～15％的比例接种酵母菌液，喷洒均匀后，移入密闭的容器内，压实密封，开始进行二次发酵，发酵28℃～40℃，发酵周期2～3天；

7.干燥、粉碎、成品

将步骤4发酵完毕的物料，转移至烘干室进行低温干燥，待水分降至10％以下，超微粉粉碎、过200～500目筛，即得成品；

表饲料预混剂产品的各成分的分析保证值

附图说明

图1为各筛选菌株纤维素酶活性初筛试验结果图，即利用刚果红培养基琼脂块扩散法对分离得到的85株菌进行初步筛选试验，以菌落周围产生的透明圈直径与菌落直径的比值(dp/dc)作为评价标准，得到22株dp/dc值较大的菌株，其中dp/dc指标较低，或没有透明圈的未统计在内。

图2为pda培养基中12h/24h/36h菌丝生长状态图，即利用pda培养基对菌株m-31生长性能和菌落形态进行鉴别观察，图为在25℃条件下的生长12h、24h和36h的菌落状况，可以看出，菌株m-31在12h就开始有大量菌丝生长，不到48h菌丝已经布满培养皿，说明该菌株能够在较短时间内迅速成为优势菌群。

图3为黄芪残渣培养基中0h/24h菌丝生长状态图，即利用黄芪残渣作为唯一培养基质，接种菌株m-31在25℃条件下培养24h，黄芪残渣表面已经布满菌丝，说明该菌株能够以黄芪残渣作为主要营养物质，并在24h成为优势菌群，达到利用该菌充分处理黄芪残渣的目的。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明，但并不仅局限于此。

实施例1

一种利用中药残渣制备禽用饲料添加剂的方法，包括如下步骤：

1.保存菌种cgmccno.16268种曲的制备：将麸皮与自来水按照1:1的比例进行混合，装入三角瓶中厚度不超过2cm，纱布封口，在121℃条件下灭菌20min，待培养基降至室温后，按照无菌操作要求，从保存菌种cgmccno.16268的斜面试管中挑取少量孢子，接种到固体培养基中，28℃恒温培养，24h后倒瓶培养，3d培养结果，自然晾干或低温烘至干燥，备用。

2.酵母菌种子液的制备：

三角瓶种子液制备：按照以下质量配比，酵母浸膏1.0％、蛋白胨1.5％、葡萄糖3.0％、氯化钙0.01％、硫酸镁0.04％、磷酸二氢钾0.5％，补足1l的纯化水，完全溶解后，在121℃条件下灭菌20min，降至室温后，按照无菌操作要求，从酵母菌的斜面试管中挑取少量菌苔接种到液体三角瓶培养基中，28℃恒温，震荡培养16h，即可使用。

一、二级种子液制备：培养基的质量配比，糖蜜8.0％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.1％、硫酸铵0.08％，氯化钙0.015％、硫酸镁0.04％、磷酸二氢钾0.1％，，按照已设定原料添加比例配制培养基，充分溶解后，通蒸汽121℃灭菌30min，降至所需温度，接种10％上级种子液，设定温度28℃，转速200rpm，发酵时间18h。

3.黄芪残渣好氧发酵工艺：

固态物料所含组分及各组分的质量分数为：预处理后的黄芪残渣100份，麸皮5份，在121℃条件下灭菌30min，降至室温后，按照质量分数0.1％接种量接种保存菌种cgmccno.16268种曲，混合均匀后，装入曲盘，厚度不超过5cm，移入曲盘室恒温28℃发酵2天，发酵完成。

4.酵母菌厌氧发酵工艺：

将步骤3保存菌种cgmccno.16268发酵完成的物料进行二次酵母菌发酵，二次发酵固态物料质量分数比例为保存菌种cgmccno.16268发酵物100份，麸皮40份，亚麻籽饼10份、尿素0.1份，按照10％的比例接种酵母菌液，喷洒均匀后，移入密闭的容器内，压实密封，开始进行二次发酵，发酵28℃～30℃，发酵周期3天；

5.干燥、粉碎、成品

将步骤4发酵完毕的物料，转移至烘干室进行低温干燥，待水分降至10％以下，粉碎、过200目筛，即为成品；

实施例2

一种利用中药残渣制备禽用饲料添加剂的方法，包括如下步骤：

1.保存菌种cgmccno.16268种曲的制备：将麸皮与自来水按照1:1的比例进行混合，装入三角瓶中厚度不超过2cm，纱布封口，在121℃条件下灭菌20min，待培养基降至室温后，按照无菌操作要求，从保存菌种cgmccno.16268的斜面试管中挑取少量孢子，接种到固体培养基中，28℃恒温培养，24h后倒瓶培养，3d培养结果，自然晾干或低温烘至干燥，备用。

2.酵母菌种子液的制备：

三角瓶种子液制备：按照以下质量配比，酵母浸膏1.0％、蛋白胨1.5％、葡萄糖3.0％、氯化钙0.01％、硫酸镁0.04％、磷酸二氢钾0.5％，补足1l的纯化水，完全溶解后，在121℃条件下灭菌20min，降至室温后，按照无菌操作要求，从酵母菌的斜面试管中挑取少量菌苔接种到液体三角瓶培养基中，28℃恒温，震荡培养16h，即可使用。

一、二级种子液制备：培养基的质量配比，糖蜜10.0％、蛋白胨10％、葡萄糖0.5％、硫酸铵0.1％，氯化钙0.03％、硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.4％，，按照已设定原料添加比例配制培养基，充分溶解后，通蒸汽121℃灭菌30min，降至所需温度，接种10％上级种子液，设定温度28℃，转速200rpm，发酵时间18h。

3.黄芪残渣好氧发酵工艺：

固态物料所含组分及各组分的质量分数为：预处理后的黄芪残渣100份，麸皮10份，在121℃条件下灭菌30min，降至室温后，按照质量分数0.1％接种量接种保存菌种cgmccno.16268种曲，混合均匀后，装入曲盘，厚度不超过5cm，移入曲盘室恒温28℃发酵2天，发酵完成。

4.酵母菌厌氧发酵工艺：

将步骤3保存菌种cgmccno.16268发酵完成的物料进行二次酵母菌发酵，二次发酵固态物料质量分数比例为保存菌种cgmccno.16268发酵物100份，麸皮30份，亚麻籽饼20份，尿素0.3份，按照10％的比例接种酵母菌液，喷洒均匀后，移入密闭的容器内，压实密封，开始进行二次发酵，发酵30℃，发酵周期3天；

5.干燥、粉碎、成品

将步骤4发酵完毕的物料，转移至烘干室进行低温干燥，待水分降至10％以下，粉碎、过300目筛，即为成品；

实施例3

一种利用中药残渣制备禽用饲料添加剂的方法，包括如下步骤：

1.保存菌种cgmccno.16268种曲的制备：将麸皮与自来水按照1:1的比例进行混合，装入三角瓶中厚度不超过2cm，纱布封口，在121℃条件下灭菌20min，待培养基降至室温后，按照无菌操作要求，从保存菌种cgmccno.16268的斜面试管中挑取少量孢子，接种到固体培养基中，28℃恒温培养，24h后倒瓶培养，3d培养结果，自然晾干或低温烘至干燥，备用。

2.酵母菌种子液的制备：

三角瓶种子液制备：按照以下质量配比，糖蜜15.0％、蛋白胨1.5％、葡萄糖1.0％、硫酸铵0.15％，氯化钙0.05％、硫酸镁0.08％、磷酸二氢钾0.8％，补足1l的纯化水，完全溶解后，在121℃条件下灭菌20min，降至室温后，按照无菌操作要求，从酵母菌的斜面试管中挑取少量菌苔接种到液体三角瓶培养基中，28℃恒温，震荡培养16h，即可使用。

一、二级种子液制备：培养基的质量配比，酵母浸膏1.0％、蛋白胨1.5％、葡萄糖3.0％、氯化钙0.01％、硫酸镁0.04％，按照已设定原料添加比例配制培养基，充分溶解后，通蒸汽121℃灭菌30min，降至所需温度，接种10％上级种子液，设定温度28℃，转速200rpm，发酵时间18h。

3.黄芪残渣好氧发酵工艺：

固态物料所含组分及各组分的质量分数为：预处理后的黄芪残渣100份，麸皮10份，在121℃条件下灭菌30min，降至室温后，按照质量分数0.1％接种量接种保存菌种cgmccno.16268种曲，混合均匀后，装入曲盘，厚度不超过5cm，移入曲盘室恒温28℃发酵3天，发酵完成。

4.酵母菌厌氧发酵工艺：

将步骤3保存菌种cgmccno.16268发酵完成的物料进行二次酵母菌发酵，二次发酵固态物料质量分数比例为保存菌种cgmccno.16268发酵物100份，麸皮20份，亚麻籽饼30份，尿素0.5份，按照10％的比例接种酵母菌液，喷洒均匀后，移入密闭的容器内，压实密封，开始进行二次发酵，发酵30℃，发酵周期3天；

5.干燥、粉碎、成品

将步骤4发酵完毕的物料，转移至烘干室进行低温干燥，待水分降至10％以下，粉碎、过400目筛，即为成品；

动物实验：

1.试验动物

1日龄白羽肉鸡

2.试验设计及分组

选取117只1日龄的肉仔鸡，随机分为3个处理组，每组3个重复，每个重复13只鸡，采取舍内笼养，自由采食、饮水，每次喂料以鸡吃饱后料槽内略有余料为度，连续喂养42天，具体分组及药品用量见表1。

表1临床试验分组表

2.4指标测定

平均日增重＝增重/(试验天数×试验鸡数)

末重＝42日每组鸡群重量

料肉比＝饲料消耗量/增重

免疫指标：分别于42日龄，以重复为单位随机选择5只肉鸡，断颈处死后，采血，取完整的脾脏及法氏囊进行称重，并测定屠体重(除去内脏后的剩余体重)和盲肠大肠杆菌数。

脾指数＝脾重/屠体重

法氏囊指数＝法氏囊重/屠体重

溶菌酶活性：离心制备血清，使用南京建成生物的试剂盒测定

盲肠大肠杆菌计数：使用麦康凯培养基，通过梯度稀释法对盲肠内容物中大肠杆菌的数量进行计数。

3.试验结果与统计分析

3.1产品对肉鸡生产性能的影响

经过42天的饲喂试验，对试验各组的鸡群末重，平均日增重，料肉比指标进行了检测，其结果见表2。

表2各组肉鸡生产性能检测试验结果

由表2可以看出，各实施例组中随着添加量的增加，各生长性能均有很大程度的改善，其中亚麻籽饼添加量越高，各组之间的显著性差异越显著，说明总蛋白水平升高，经过酵母菌发酵后，蛋白水平更加均衡起到积极效果。相比空白对照，该产品在添加量0.2％-0.6％时，各个指标均有所改善，其中添加量0.6％，差异最明显，说明该专利产品在提高日增重，降低料肉比方面具有显著效果。

3.2产品对肉鸡免疫指标的影响

经过42天的饲喂试验，对试验各组的免疫器官指数及溶菌酶活性进行了检测，表3为各组肉鸡21日龄免疫器官指数及溶菌酶活性。

表3各组肉鸡免疫指标检测试验结果

表3可知，各组脾指数及法氏囊指数均有所改善，但差异不显著(p＞0.05)，实施例3组的溶菌酶活性高于实施例1组和实施例2组，显著高于空白对照组，其他各组无显著差异(p＞0.05)。由此可以得出，该产品在改善肉鸡机体免疫能力方面具有向好的趋势。

应当理解的是，本领域普通技术人员可根据本说明进行改进或转换，而这些改进和转换都应该属于本发明所附权利要求的保护范围。