本发明属于食品加工技术领域，涉及调味品的制备，尤其是一种通过多菌种在酱汁中透析培养研究多菌种协同控制发酵的方法。
背景技术：
传统发酵酱油作为一种调味品，有独特的营养风味。酱油具有十分复杂的风味物质系统，主要是原料中的大分子物质经酶水解后，生成的数量繁杂的次级产物以及终产物，由微生物发酵产生的代谢产物，以及物质之间产生的十分复杂的生化反应。酱油中含有多种氨基酸类物质、醛类物质、酯类物质、醇类物质、有机酸、酮类物质等，还有天然棕红色素。酱油中的香气化合物主要由挥发性化合物组成，香气可分为焦糖香味、坚果香味、水果香味等成分。
酱油的风味物质一直备受关注，高盐稀态产生的风味物质种类较多，且口感也较于低盐固态酱油好。有研究证明添加菌种对酱油的风味有较大的影响作用，但多菌种的作用情况并不是很成熟，且调控机制并不十分清楚。基于高盐稀态酱油发酵周期较长，在研究过程中既耗时又耗力，适量的缩短研究酱油风味工艺的周期，对工业生产以及实验过程的研究都有很大的帮助。由于酱醪系统复杂，且很难实现菌种的分离。
通过检索，目前没有将多菌种在酱汁中的透析培养的相关专利公开文献。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服高盐稀态的发酵工艺周期长的缺点，提供一种通过多菌种在酱汁中透析培养研究多菌种协同控制发酵的方法，该方法通过将不同菌种在酱汁中透析培养，快速达到测定酱汁中指标以及风味物质差异来验证添加多种菌对酱汁发酵调控的影响作用，可以为酱油的成品发酵提供基础数据，缩短实验周期。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种通过多菌种在酱汁中透析培养研究多菌种协同控制发酵的方法，所述方法通过改变不同菌种在酱汁中的透析培养，将菌种进行分离培养并定期测定菌浓的变化情况，测定酱汁的菌种浓度变化、指标和风味物质来分析菌种对酱汁的发酵调控作用。
而且，所述改变不同菌种在酱汁中的透析培养为取酱汁后定期接入2～3种菌种。
而且，所述菌种为：鲁氏酵母和/或球拟酵母和/或嗜盐四联球菌。
而且，所述透析培养的方法为：
取发酵30天后的酱醪离心取汁，之后将不同的菌种按不同时间分装于不同的透析袋中，置于酱汁中继续培养至56天，在培养过程中测定酱汁中各菌种浓度和酱汁的指标和风味物质。
而且，具体步骤如下：
⑴透析袋的选择：因需要将各菌种相互分隔开，因此选择透析袋的分子截留量需小于细菌和酵母细胞的直径，细菌的细胞直径为0.2-30μm，酵母菌的直径为0.3-8μm，根据要求选择了分子截留量为8000-14000d的透析袋；
⑵透析袋的预处理：把透析袋剪成长度为20cm的小段，然后在大体积的质量浓度为2％的碳酸氢钠和1mmol/ledta的混合水溶液中将透析袋煮沸10分钟，所述混合水溶液的ph为8.0；用蒸馏水彻底清洗透析袋；放在1mmol/ledta的水溶液中将之煮沸10分钟；冷却后，透析袋清洗后放在体积浓度为50％的酒精溶液存于4℃冰箱中，且必须确保透析袋始终浸没在溶液内；
⑶酱汁的制备：30天后，酱醪中的曲霉对大颗粒的原料分解完成，因此，取发酵30天的酱醪在离心机中于4摄氏度低温条件下进行离心，得酱汁于发酵容器中；
⑷透析装置：透析袋在使用前，需将其用蒸馏水充满后，将蒸馏水排出后，将接入了菌种的液体培养基置于透析袋中，液体培养基与酱汁形成一定比例的透析装置即可，无特殊比例要求，且透析袋中小分子物质及水分会互相流通，不会影响酱汁的发酵，用透析夹两端封口后，得透析装置，后续将其置于酱汁中形成透析系统；
⑸透析培养：取酱汁后，按⑷的操作方法安装好透析装置后，继续在30℃条件下进行多菌种透析培养；
⑹杀菌：56天后将所得发酵后的酱汁进行杀菌即得发酵完成的酱汁，在培养过程中测定酱汁中各菌种浓度和酱汁的指标和风味物质，酵母菌与乳酸菌添加时数值上不能超过一个数量级，酵母菌添加浓度为106(个/ml)，乳酸菌的添加浓度为2×105(个/ml)。酱汁的指标中氨基酸态氮含量不得低于0.4(g/100ml)，全氮含量不得低于0.7(g/100ml)，初步根据风味物质种类和有机酸含量确定各菌种对酱汁的调控作用。
而且，所述步骤⑸中多菌种透析培养的方法为：
第1天透析袋中放入接入了嗜盐四联球菌的液体培养基，第7天透析袋中放入接入了接入了鲁氏酵母的液体培养基。
而且，所述步骤⑸中多菌种透析培养的方法为：
第1天透析袋中放入接入了嗜盐四联球菌的液体培养基，第14天透析袋中放入接入了接入了球拟酵的液体培养基母。
而且，所述步骤⑸中多菌种透析培养的方法为：
第1天透析袋中放入接入了嗜盐四联球菌的液体培养基，第7天透析袋中放入接入了接入了鲁氏酵母的液体培养基，第14天透析袋中放入接入了接入了球拟酵母的液体培养基。
而且，所述步骤⑸的透析培养在封闭条件下操作。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明方法在原有高盐稀态发酵工艺的基础上，通过多菌种在酱汁中透析培养调控酱汁的发酵，缩短了实验周期，通过菌种的透析培养测定酱汁的菌浓度、指标以及最终的风味物质分析菌种之间的调控作用。在酱汁中发酵与成品发酵条件保持一致，既能测定出各菌种浓度的实际变化情况，又能模拟酱油复杂的发酵过程，且酱汁在封闭条件下风味物质不会过分损失，为成品酱油发酵提供了理论依据，提高实验效率，减少人力物力。
2、本发明方法在酱汁中通过多菌种在酱汁中透析培养协同调控酱汁的发酵，得到的酱油产品营养足够丰富，且产品质量符合国家标准，改变透析培养菌种添加时间，并未对酱汁品质有影响。
3、本发明方法通过多菌种在酱汁中透析培养协同调控酱汁的发酵，实验周期更短，且可降低生产成本，易于操作容易实现。
4、本发明方法将发酵一定时间后的酱醪取酱汁，将菌种分别放在不同的透析袋中进行分别培养，既能模拟酱醪的复杂系统实现菌种的分离，又能使小分子物质透过透析袋，实现菌种间的相互调控作用，既缩短了发酵周期，又可以很好的分析菌种之间的调控作用。
具体实施方式
下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种通过多菌种在酱汁中透析培养研究多菌种协同控制发酵的方法，所述方法通过改变不同菌种在酱汁中的透析培养，将菌种进行分离培养，测定酱汁的菌浓度、指标以及最终的风味物质分析菌种对酱汁发酵的影响。
具体地，第1天透析袋中接入嗜盐四联球菌，第7天透析袋中接入鲁氏酵母。
更具体地，步骤如下：
⑴透析袋的选择：因实验需要将各菌种相互分隔开，因此选择透析袋的分子截留量需小于细菌和酵母细胞的直径。细菌的细胞直径为0.2-30μm，酵母菌的直径为0.3-8μm，根据要求本专利选择了分子截留量为8000-14000d的透析袋。
⑵透析袋预处理：把透析袋剪成适当长度20cm的小段，注意带手套，然后在大体积的质量浓度为2％的碳酸氢钠和1mmol/ledta的混合水溶液中将透析袋煮沸10分钟，所述混合水溶液的ph为8.0；用蒸馏水彻底清洗透析袋；放在1mmol/ledta的水溶液中将之煮沸10分钟；冷却后，透析袋清洗后放在体积浓度为50％的酒精溶液存于4℃冰箱中，且必须确保透析袋始终浸没在溶液内；
⑶酱汁的制备：30天后，酱醪中的曲霉对大颗粒的原料分解基本完成。因此，取发酵30天的酱醪在离心机中于4摄氏度低温条件下进行离心，得酱汁于发酵容器中；
⑷透析装置:透析袋在使用前，需将其用蒸馏水充满后，将蒸馏水排出后，将接入了菌种的液体培养基置于透析袋中，液体培养基与酱汁形成一定比例的透析装置即可，无特殊比例要求，且透析袋中小分子物质及水分会互相流通，不会影响酱汁的发酵，用透析夹两端封口后，置于酱汁中形成透析系统。
⑸透析培养：取酱汁后，按⑷的操作方法安装好透析装置后，继续在30℃条件下进行多菌种透析培养；
⑹杀菌：56天后将所得发酵后的酱汁进行杀菌即得发酵完成的酱汁，在培养过程中测定酱汁中各菌种浓度和酱汁的指标和风味物质，酵母菌与乳酸菌添加时数值上不能超过一个数量级，酵母菌添加浓度为106(个/ml)，乳酸菌的添加浓度为2×105(个/ml)。酱汁的指标中氨基酸态氮含量不得低于0.4(g/100ml)，全氮含量不得低于0.7(g/100ml)，初步根据风味物质种类和有机酸含量确定各菌种对酱汁的调控作用。
实施例2
一种通过多菌种在酱汁中透析培养研究多菌种协同控制发酵的方法，所述方法通过改变不同菌种在酱汁中的透析培养，将菌种进行分离培养，测定酱汁的菌浓度、指标以及最终的风味物质分析菌种对酱汁发酵的影响。
具体地，第1天透析袋中接入嗜盐四联球菌，第14天接透析袋中接入球拟酵母。
更具体地，步骤如下：
⑴透析袋的选择：因实验需要将各菌种相互分隔开，因此选择透析袋的分子截留量需小于细菌和酵母细胞的直径。细菌的细胞直径为0.2-30μm，酵母菌的直径为0.3-8μm，根据要求本专利选择了分子截留量为8000-14000d的透析袋。
⑵透析袋的处理：把透析袋剪成适当长度20cm的小段，注意带手套，然后在大体积的质量浓度为2％的碳酸氢钠和1mmol/ledta的混合水溶液中将透析袋煮沸10分钟，所述混合水溶液的ph为8.0；用蒸馏水彻底清洗透析袋；放在1mmol/ledta的水溶液中将之煮沸10分钟；冷却后，透析袋清洗后放在体积浓度为50％的酒精溶液存于4℃冰箱中，且必须确保透析袋始终浸没在溶液内；
⑶酱汁的制备：30天后，酱醪中的曲霉对大颗粒的原料分解基本完成。因此，取发酵30天的酱醪在离心机中于4摄氏度低温条件下进行离心，得酱汁于发酵容器中；
⑷透析装置:透析袋在使用前，需将其用蒸馏水充满后，将蒸馏水排出后，将接入了菌种的液体培养基置于透析袋中，液体培养基与酱汁形成一定比例的透析装置即可，无特殊比例要求，且透析袋中小分子物质及水分会互相流通，不会影响酱汁的发酵，用透析夹两端封口后，置于酱汁中形成透析系统。
⑸透析培养：取酱汁后，按⑷的操作方法安装好透析装置后，继续在30℃条件下进行多菌种透析培养；
⑹杀菌：56天后将所得发酵后的酱汁进行杀菌即得发酵完成的酱汁，在培养过程中测定酱汁中各菌种浓度和酱汁的指标和风味物质，酵母菌与乳酸菌添加时数值上不能超过一个数量级，酵母菌添加浓度为106(个/ml)，乳酸菌的添加浓度为2×105(个/ml)。酱汁的指标中氨基酸态氮含量不得低于0.4(g/100ml)，全氮含量不得低于0.7(g/100ml)，初步根据风味物质种类和有机酸含量确定各菌种对酱汁的调控作用。
实施例3
一种通过多菌种在酱汁中透析培养研究多菌种协同控制发酵的方法，所述方法通过改变不同菌种在酱汁中的透析培养，将菌种进行分离培养，测定酱汁的菌浓度、指标以及最终的风味物质分析菌种对酱汁发酵的影响。
具体地，酱汁第1天透析袋中接入嗜盐四联球菌，第7天透析袋中接入鲁氏酵母，第14天透析袋中接入球拟酵母。
更具体地，步骤如下：
⑴透析袋的选择：因实验需要将各菌种相互分隔开，因此选择透析袋的分子截留量需小于细菌和酵母细胞的直径。细菌的细胞直径为0.2-30μm，酵母菌的直径为0.3-8μm，根据要求本专利选择了分子截留量为8000-14000d的透析袋。
⑵透析袋的处理：把透析袋剪成适当长度20cm的小段，注意带手套，然后在大体积的质量浓度为2％的碳酸氢钠和1mmol/ledta的混合水溶液中将透析袋煮沸10分钟，所述混合水溶液的ph为8.0；用蒸馏水彻底清洗透析袋；放在1mmol/ledta的水溶液中将之煮沸10分钟；冷却后，透析袋清洗后放在体积浓度为50％的酒精溶液存于4℃冰箱中，且必须确保透析袋始终浸没在溶液内；
⑶酱汁的制备：30天后，酱醪中的曲霉对大颗粒的原料分解基本完成。因此，取发酵30天的酱醪在离心机中于4摄氏度低温条件下进行离心，得酱汁于发酵容器中；
⑷透析装置:透析袋在使用前，需将其用蒸馏水充满后，将蒸馏水排出后，将接入了菌种的液体培养基置于透析袋中，液体培养基与酱汁形成一定比例的透析装置即可，无特殊比例要求，且透析袋中小分子物质及水分会互相流通，不会影响酱汁的发酵，用透析夹两端封口后，置于酱汁中形成透析系统。
⑸透析培养：取酱汁后，按⑷的操作方法安装好透析装置后，继续在30℃条件下进行多菌种透析培养；
⑹杀菌：56天后将所得发酵后的酱汁进行杀菌即得发酵完成的酱汁，在培养过程中测定酱汁中各菌种浓度和酱汁的指标和风味物质，酵母菌与乳酸菌添加时数值上不能超过一个数量级，酵母菌添加浓度为106(个/ml)，乳酸菌的添加浓度为2×105(个/ml)。酱汁的指标中氨基酸态氮含量不得低于0.4(g/100ml)，全氮含量不得低于0.7(g/100ml)，初步根据风味物质种类和有机酸含量确定各菌种对酱汁的调控作用。
试验例：
对实施例1、2、3所得酱油产品利用高效液相色谱技术和气相色谱-质谱联用技术，对有机酸和酱汁中风味物质测定进行测定，试验结果如表1所示。
表1不同发酵组酱汁的理化指标及有机酸含量和风味物质数量
综上所述，本发明方法在原有发酵工艺的基础上，通过多菌种的透析培养调控酱汁的发酵，最终检测出酱汁中风味物质的种类以及有机酸含量相对空白组均有所提高，且所得酱汁中氨基酸态氮和全氮含量都符合国家标准。
因此，本发明通过多菌种在酱汁中透析培养研究多菌种协同控制发酵，是一种快捷检测酱油发酵差异的方法，通过本发明对菌浓度、各种指标和风味物质的测定对发酵结果进行分析，可以有效地节省时间与材料。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。