一种促小麦蛋白高效脱酰胺降敏的方法与流程

本发明具体涉及一种促小麦蛋白高效脱酰胺降敏的方法。

背景技术：

小麦是世界三大消费谷物之一，年产量6亿吨，而我国是世界第二小麦消费大国。小麦蛋白作为小麦的副产物，是一种营养丰富、物美价廉的植物蛋白，在食品领域及其他领域方面有着广泛的应用。但存在部分遗传易感人群（中国北方患病人数>5%）摄入极少量麦醇溶蛋白后会发生乳糜泻——一种小麦醇溶蛋白不耐受引起的慢性小肠吸收不良综合症，这限制了乳糜泻病人对小麦蛋白的食用。

在食品生物技术领域，酸、酶解随机脱酰胺是目前较好可产业化实施，且安全、低成本的小麦蛋白去毒降敏的方法。但酸、酶脱酰胺基本为随机脱酰胺，且随机脱酰胺的酸原料局限于盐酸，同时，针对小麦蛋白的改性降敏（乳糜泻）仍存在脱酰胺程度域值差异大、效果差异显著等问题。

技术实现要素：

基于以上研究和技术现状，本发明提出了一种超高脱酰胺（脱酰胺＞90%）降敏策略，即使用新型廉价、绿色环保的有机酸型天然低共熔溶剂促进小麦蛋白高效脱酰胺降敏的方法，其可在较高蛋白浓度条件下实现小麦蛋白的高效脱酰胺降敏，从而可有效降低乳糜泻患者因食用小麦蛋白而引起的致敏。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效脱酰胺降敏的小麦蛋白，其是利用有机酸型天然低共熔溶剂作为溶剂，实现小麦蛋白的高效脱酰胺降敏；其制备方法具体是在室温下将有机酸型天然低共熔溶剂加水稀释4倍后，加入小麦蛋白溶解，配成20-40mg/ml的小麦蛋白悬浮液，35℃水化2-12h后在120℃下反应10-30min，再经冷却、离心，-4℃透析24h除去盐离子后冻干，获得高效脱酰胺降敏的小麦蛋白。

所述有机酸型天然低共熔溶剂是将氢键供体化合物和氢键受体化合物以摩尔比2:1配合，加水溶解后在50℃-80℃条件下磁力搅拌30-120min，形成组分总浓度为2.0mol/l-5.0mol/l的澄清透明液体；

其中，所述氢键供体化合物为葡萄糖、果糖、蔗糖中的任意一种，所述氢键受体化合物为柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸中的任意一种。

所得脱酰胺程度＞90%，降敏程度达到80%。

本发明的突出优点是：

（1）天然低共熔溶剂是一种高效、廉价、无毒、可降解成的新型绿色溶剂。本发明利用天然低共熔溶剂作为改性试剂，在较高蛋白浓度条件下便可实现小麦蛋白的高效脱酰胺降敏，其降敏程度可达到80%，从而可有效降低乳糜泻患者因食用小麦蛋白而引起的致敏，并为实现工业化大量生产低敏小麦蛋白提供了潜在的可能。

（2）本发明中先将天然低共熔溶剂配成组分总浓度为2.0mol/l-5.0mol/l的液体，再在使用前进行稀释，是由于高浓度下组分间的键连，可使体系中存在大量超分子结构。而若在配制过程中直接制成组分总浓度为0.4mol/l-1.0mol/l的稀溶液，由于体系中含水量过高，无法形成超分子结构，则无法实现对小麦蛋白良好的促溶改性。

（3）本发明可在较高蛋白浓度条件下实现小麦蛋白的高效脱酰胺降敏，克服了目前小麦蛋白只有在极稀浓度下才可实现小麦蛋白去毒降敏的问题。

附图说明

图1为不同脱酰胺程度的改性小麦蛋白的酶联免疫吸附能力对比情况。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

将柠檬酸、葡萄糖固体粉末按摩尔比1:2加入到装有水的圆底烧瓶中，50℃磁力搅拌30-60min，直至形成澄清透明的液体，其中柠檬酸和葡萄糖的总浓度为4.2mol/l；然后将合成的柠檬酸-葡萄糖天然低共熔溶剂加水稀释4倍，再加入小麦蛋白配制成浓度为25mg/ml的蛋白悬浮液，35℃水化3h后，120℃加热反应10min。反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，4℃透析24h，冻干，得到高效脱酰胺降敏的小麦蛋白。

实施例2

将柠檬酸、葡萄糖固体粉末按摩尔比1:2加入到装有水的圆底烧瓶中，50℃磁力搅拌30-60min，直至形成澄清透明的液体，其中柠檬酸和葡萄糖的总浓度为4.2mol/l；然后将合成的柠檬酸-葡萄糖天然低共熔溶剂加水稀释4倍，再加入小麦蛋白配制成浓度为30mg/ml的蛋白悬浮液，35℃水化3h后，120℃加热反应12min。反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，4℃透析24h，冻干，得到高效脱酰胺降敏的小麦蛋白。

实施例3

将柠檬酸、葡萄糖固体粉末按摩尔比1:2加入到装有水的圆底烧瓶中，50℃磁力搅拌30-60min，直至形成澄清透明的液体，其中柠檬酸和葡萄糖的总浓度为4.2mol/l；然后将合成的柠檬酸-葡萄糖天然低共熔溶剂加水稀释4.6倍，再加入小麦蛋白配制成浓度为26mg/ml的蛋白悬浮液，35℃水化3h后，120℃加热反应14min。反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，4℃透析24h，冻干，得到高效脱酰胺降敏的小麦蛋白。

实施例4

将柠檬酸、葡萄糖固体粉末按摩尔比1:2加入到装有水的圆底烧瓶中，50℃磁力搅拌30-60min，直至形成澄清透明的液体，其中柠檬酸和葡萄糖的总浓度为4.2mol/l；然后将合成的柠檬酸-葡萄糖天然低共熔溶剂加水稀释4.6倍，再加入小麦蛋白配制成浓度为40mg/ml的蛋白悬浮液，35℃水化3h后，120℃加热反应30min。反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，4℃透析24h，冻干，得到高效脱酰胺降敏的小麦蛋白。

对比例1

将小麦蛋白溶于0.28mol/l柠檬酸溶液中配成浓度为25mg/ml的蛋白悬浮液，35℃水化3h后，120℃加热反应10min。反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，4℃透析24h，冻干，得到脱酰胺的小麦蛋白。

对比例2

将小麦蛋白溶于0.28mol/l柠檬酸溶液中配成浓度为30mg/ml的蛋白悬浮液，35℃水化3h后，120℃加热反应12min。反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，4℃透析24h，冻干，得到脱酰胺的小麦蛋白。

对比例3

将小麦蛋白溶于0.25mol/l柠檬酸溶液中配成浓度为26mg/ml的蛋白悬浮液，35℃水化3h后，120℃加热反应10min。反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，4℃透析24h，冻干，得到脱酰胺的小麦蛋白。

对比例4

将小麦蛋白溶于0.25mol/l柠檬酸溶液中配成浓度为40mg/ml的蛋白悬浮液，35℃水化3h后，120℃加热反应30min。反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，4℃透析24h，冻干，得到脱酰胺的小麦蛋白。

1.脱酰胺程度的测定：

（1）样品完全脱酰胺产生的氨的测定：将0.5g未脱酰胺的小麦蛋白样品密封于装有10ml3mol/l盐酸的安倍管中，放入杀菌锅中120℃湿热处理90min后，用康微皿法测定其氨的释放量。

（2）脱酰胺样品上清液产生的氨的测定：于微量弥散皿中央加入3ml硼酸、综合指示剂3滴，外围加入1ml小麦蛋白样品脱酰胺反应后的上清液及3ml饱和氢氧化钠溶液，随后立即盖上涂抹了水溶性阿拉伯胶的皿盖弥散皿；平放桌面12h后，用0.02mol/l的标准盐酸溶液滴定，直至综合指示剂由蓝变红。

（3）脱酰胺程度(dd)（%）＝脱酰胺样品上清液产生的氨/样品完全脱酰胺产生的氨×100。所得结果见表1。

表1柠檬酸-葡萄糖天然低共熔溶剂和有机酸改性小麦蛋白的脱酰胺程度对比

由表1可见，与单纯使用有机酸的对比例1、2、3、4相比，在同等条件下，使用柠檬酸-葡萄糖天然低共熔溶剂的实施例1、2、3、4的改性小麦蛋白脱酰胺程度显著提高（脱酰胺＞90%），尤其是实施例3的脱酰胺程度达到94.11%。

2.酶联免疫吸附实验：

（1）抗原包被：用包被缓冲液稀释不同脱酰胺程度的改性小麦蛋白，得到浓度为10μg/ml的包被样，以未改性的小麦蛋白标准品（gliadin）和麦醇溶蛋白（wg）作为阳性对照，包被缓冲液作为阴性对照，各取100μl/孔加入于酶标板中，4℃过夜或37℃孵育2h。

（2）洗涤：次日倾去酶标板内的包被液，用pbst洗涤液洗板1次（一般洗板机程序洗涤1次即可，手动洗板需3次），甩干。

（3）封闭：加入5%的脱脂牛奶封闭液封阻，200μl/孔，37℃封闭1h；弃尽封闭液，洗涤三次，拍干。

（4）一抗孵育：根据前期一抗摸索的最佳稀释度将一抗用1%bsa+pbst按1:1000稀释，加入一抗（100μl/孔），37℃孵育1h，洗板机洗1次后拍干。

（5）二抗孵育：使用1%bsa+pbst将二抗按1:5000稀释，加入等体积的二抗（100μl/孔），37℃孵育1h，洗板机洗1次后拍干。

（6）tmb显色：弃酶标二抗，用pbst洗净酶标板中的洗涤液，洗板后，tmb底物a、b两种试剂等体积混合均匀，以100μl/孔添加至酶标板中，37℃恒温箱中避光反应15min。

（7）终止显色：每孔加入1mhcl终止液，100μl/孔，终止显色反应，轻轻震荡酶标板，以确保终止完全，室温放置1-2min，并用酶联免疫检测仪在450nm下测定各孔的吸光值。

图1显示了不同脱酰胺程度的改性小麦蛋白的抗原性对比情况，其中od值表明抗原和抗体是相互识别的。由图1可见，未改性的小麦蛋白标准品和麦醇溶蛋白与抗体有很强的识别作用，特别是与麦醇溶蛋白的相互作用最强。随着脱酰胺程度的增加（dd36.90%-91.23%），小麦蛋白致敏性呈下降趋势。当脱酰胺程度达到91.23%时，与阳性对照对比，α-醇溶蛋白抗原表位的抗原免疫应答降低了近72%左右，致敏性显著降低。由此可见，超高效脱酰胺（＞90%）改性可较好地达到降敏的效果。

综上所述，天然低共熔溶剂改性是小麦蛋白降敏的有效方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。