本发明属于食品工程技术领域，具体地说，涉及一种具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽及其制备方法和应用。
背景技术：
澳洲坚果(macadamiaternifoliaf.muell.)别名澳洲核桃、夏威夷果等，属山龙眼科澳洲坚果属。澳洲坚果的食用部分为果仁，其营养价值丰富，含有9％的蛋白质和78％的油脂，其中蛋白质中含有人体必需的8种氨基酸，由其蛋白质制备的蛋白肽具有多种生物活性。蛋白肽是氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物，并且许多蛋白肽还具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能。由于其具有特殊的生理功能(例如具有抗疲劳性能)、利于消化吸收和安全性高而易被人们接受，日本、美国和欧洲已率先推出各种具有保健功能的肽类食品。目前，澳洲坚果蛋白肽的制备方法一般采用酶解方式、超声波辅助消解或醇提等方法获得，但存在该蛋白肽活性不高，所含氨基酸种类少，提取率较低等问题，此外，采用超滤等方式回收蛋白肽成本较高。
技术实现要素：
1、要解决的问题
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种澳洲坚果蛋白肽及其制备方法和应用，它具有显著的抗疲劳功效。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽的制备方法，首先将去壳后的澳洲坚果进行低温粉碎，然后将粉碎后的澳洲坚果加tris-hcl缓冲液和中性蛋白酶进行超声辅助溶解，其中tris-hcl缓冲液的浓度为0.5m，其中tris-hcl缓冲液的ph为6.8-7.0，离心后取上清液用大孔吸附树脂进行蛋白肽的吸附，多次洗脱大孔吸附树脂将蛋白肽进行收集，冷冻干燥即得澳洲坚果蛋白肽粉剂。
优选地，所述澳洲坚果粉碎后的粒径为200μm-300μm。
优选地，所述超声辅助溶解的溶解温度为30℃-35℃，其超声功率为200w，其超声时间为30min-40min。
优选地，所述大孔吸附树脂的骨架选自丙烯腈。
优选地，所述大孔吸附树脂的上柱流速为1bv/h-3bv/h；所述大孔吸附树脂的洗脱液为生理盐水。
一种具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽，所述澳洲坚果青皮提取物采用上述制备方法制得。
一种如上述所述的具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽在制备固体饮料中的应用。
优选地，所述固体饮料，以重量份计，包括以下原料：
优选地，所述固体饮料的制备方法为：步骤一：将牛磺酸、聚甘油-6二硬脂酸酯和水预混合得到预配液一；
步骤二：将羧甲基纤维素钠、氯化钠、氯化钾、山楂粉、果胶、大豆粉及水预混合得到预配液二；
步骤三：将澳洲坚果蛋白肽加入水中进行混合，搅拌均匀后得到预配液三；
步骤四：将预配液二送至反应釜内，搅拌的同时加入预配液一，然后降温至30℃，加入预配液三进行均质处理后低温浓缩，即可。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明首次将大孔吸附树脂技术应用于澳洲坚果蛋白肽的提取，对其提取工艺进行了优化，使得其水解度及abts自由基能力远高于现有技术的水平；再将澳洲坚果蛋白肽、聚甘油-6二硬脂酸酯、羧甲基纤维素钠及其他辅料成份混合后，制备得到具备抗疲劳功效的固体饮料，极大延缓体力疲劳。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
本实施例具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽，其制备方法如下，首先将去壳后的澳洲坚果进行低温粉碎，然后将粉碎后的澳洲坚果加tris-hcl缓冲液和中性蛋白酶进行超声辅助溶解，其中tris-hcl缓冲液的浓度为0.5m，其中tris-hcl缓冲液的ph为6.8，离心后取上清液用大孔吸附树脂进行蛋白肽的吸附，多次洗脱大孔吸附树脂将蛋白肽进行收集，冷冻干燥即得澳洲坚果蛋白肽粉剂；
其中，所述澳洲坚果粉碎后的粒径为300μm；
其中，所述超声辅助溶解的溶解温度为30℃，其超声功率为200w，其超声时间为40min；
其中，所述大孔吸附树脂的骨架选自丙烯腈；
其中，所述大孔吸附树脂的上柱流速为1bv/h；所述大孔吸附树脂的洗脱液为生理盐水。
实施例2
本实施例具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽，其制备方法如下，首先将去壳后的澳洲坚果进行低温粉碎，然后将粉碎后的澳洲坚果加tris-hcl缓冲液和中性蛋白酶进行超声辅助溶解，其中tris-hcl缓冲液的浓度为0.5m，其中tris-hcl缓冲液的ph为7.0，离心后取上清液用大孔吸附树脂进行蛋白肽的吸附，多次洗脱大孔吸附树脂将蛋白肽进行收集，冷冻干燥即得澳洲坚果蛋白肽粉剂；
其中，所述澳洲坚果粉碎后的粒径为200μm；
其中，所述超声辅助溶解的溶解温度为35℃，其超声功率为200w，其超声时间为30min；
其中，所述大孔吸附树脂的骨架选自丙烯腈；
其中，所述大孔吸附树脂的上柱流速为3bv/h；所述大孔吸附树脂的洗脱液为生理盐水。
实施例3
本实施例具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽，其制备方法如下，首先将去壳后的澳洲坚果进行低温粉碎，然后将粉碎后的澳洲坚果加tris-hcl缓冲液和中性蛋白酶进行超声辅助溶解，其中tris-hcl缓冲液的浓度为0.5m，其中tris-hcl缓冲液的ph为6.9，离心后取上清液用大孔吸附树脂进行蛋白肽的吸附，多次洗脱大孔吸附树脂将蛋白肽进行收集，冷冻干燥即得澳洲坚果蛋白肽粉剂；
其中，所述澳洲坚果粉碎后的粒径为250μm；
其中，所述超声辅助溶解的溶解温度为33℃，其超声功率为200w，其超声时间为35min；
其中，所述大孔吸附树脂的骨架选自丙烯腈；
其中，所述大孔吸附树脂的上柱流速为2bv/h；所述大孔吸附树脂的洗脱液为生理盐水。
实施例4
本实施例具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽，其制备方法如下，首先将去壳后的澳洲坚果进行低温粉碎，然后将粉碎后的澳洲坚果加tris-hcl缓冲液和中性蛋白酶进行超声辅助溶解，其中tris-hcl缓冲液的浓度为1m，其中tris-hcl缓冲液的ph为8，离心后取上清液用大孔吸附树脂进行蛋白肽的吸附，多次洗脱大孔吸附树脂将蛋白肽进行收集，冷冻干燥即得澳洲坚果蛋白肽粉剂；
其中，所述澳洲坚果粉碎后的粒径为250μm；
其中，所述超声辅助溶解的溶解温度为33℃，其超声功率为200w，其超声时间为35min；
其中，所述大孔吸附树脂的骨架选自丙烯腈；
其中，所述大孔吸附树脂的上柱流速为2bv/h；所述大孔吸附树脂的洗脱液为生理盐水。
实施例5
本实施例具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽，其制备方法如下，首先将去壳后的澳洲坚果进行低温粉碎，然后将粉碎后的澳洲坚果加tris-hcl缓冲液和中性蛋白酶进行超声辅助溶解，其中tris-hcl缓冲液的浓度为0.5m，其中tris-hcl缓冲液的ph为6.9，离心后取上清液用大孔吸附树脂进行蛋白肽的吸附，多次洗脱大孔吸附树脂将蛋白肽进行收集，冷冻干燥即得澳洲坚果蛋白肽粉剂；
其中，所述澳洲坚果粉碎后的粒径为250μm；
其中，所述超声辅助溶解的溶解温度为33℃，其超声功率为200w，其超声时间为35min；
其中，所述大孔吸附树脂的骨架选自苯乙烯；
其中，所述大孔吸附树脂的上柱流速为2bv/h；所述大孔吸附树脂的洗脱液为生理盐水。
对比例1
中国发明专利，申请号：cn201810608256.9，公开公告号：108796015a，公开了一种从澳洲坚果同步提取蛋白肽和植物油脂的方法，照其说明书的具体实施方案(实施例1)：
所述从澳洲坚果同步提取蛋白肽和植物油脂的方法，包括以下步骤：
s101：将新鲜的澳洲坚果进行脱皮、脱壳处理，得到澳洲坚果果仁，并采用组织捣碎机将其研磨成澳洲坚果泥；
s102：取200g步骤s101制备的澳洲坚果泥，按澳洲坚果泥∶水为1∶20的质量比加入4000g水充分混合，后用0.2mol/l的氢氧化钠溶液调节混合液ph至10.0，再加入7.0g复合蛋白酶(澳洲坚果泥质量的3.5％)，其中复合蛋白酶包括5.25g碱性蛋白酶和1.75g风味蛋白酶(3∶1)，酶活力都为400u/mg，后采用动态高压微射流均质机在30mpa压力下处理酶解60min，酶解结束后将混合液置于4℃条件下进行低温处理30min，再采用碟式离心机，在12000r/min的转速下进行油相、水相和固相残渣的分离，得到澳洲坚果油、蛋白肽酶解液和沉淀物；
s103：将s102中得到的蛋白肽酶解液在80℃下灭酶处理15min，用0.2mol/l的盐酸溶液调节混合液ph至7.0，再进行超滤处理，超滤膜分子量5kda，控制超滤流速2ml/min，超滤后进行减压浓缩、冷冻干燥得到分子量大于5kda的澳洲坚果蛋白肽和分子量小于5kda的澳洲坚果蛋白肽。
对比例2
中国发明专利，申请号：cn201810608248.4，公开公告号：cn108670901a，公开了一种以澳洲坚果蛋白肽和青皮提取液为活性成分的柔肤水及其制备方法，照其说明书的具体实施方案：
澳洲坚果蛋白肽通过以下步骤制备：
步骤s101：称取5.000g澳洲坚果蛋白粉溶于100ml超纯水中，用1.0mol/l氢氧化钠调节溶液ph为10.0，加入澳洲坚果蛋白粉质量5.0％的蛋白酶，混匀；所述蛋白酶包括质量比为3∶1的碱性蛋白酶和复合蛋白酶；
步骤s102：采用动态高压微射流技术辅助酶解步骤s101溶液，处理压力50mpa，处理时间60min，酶解结束后，在80℃水浴下灭酶处理15min，冷却后用1.0mol/l盐酸调节酶解液ph为7.0；
步骤s103：采用碟式离心机对步骤s102进行离心处理，得到的澄清液采用3kda的超滤膜进行超滤处理，超滤流速控制2.0ml/min，采用氮气加压，分子量小于3kda的超滤溶液采用减压蒸馏浓缩至原溶液的0.2倍，得到的浓缩液即为澳洲坚果蛋白肽。
分别选取实施例1-3及对比例1-4制备的澳洲坚果蛋白肽进行试验，参照发明人所在单位南亚热带作物研究所曾发表过的论文(帅希祥，杜丽清，张明，etal.超声辅助酶解制备澳洲坚果蛋白肽及其抗氧化活性的研究[j].热带作物学报，2017，38(11).与范方宇，阚欢，刘建琴，etal.澳洲坚果蛋白酶解工艺及抗氧化性研究[j].食品科技，2011(12)：230-234.及杜丽清，帅希祥，涂行浩，etal.澳洲坚果蛋白肽制备工艺及抗氧化活性研究[j].热带农业工程，2016(5).)中涉及的蛋白肽提取率及抗氧化活性的测定，相关测定结果如表1所示：
表1
由表1可知，实施例1-实施例3的应用制得的具抗疲劳功效的澳洲坚果蛋白肽，其水解度及abts自由基能力远超过实施例4、实施例5、对比例1及对比例2；虽然大孔吸附树脂技术在蛋白肽提取领域中的应用常见，但澳洲坚果蛋白肽中现有技术的提取率及蛋白肽的水解度均较低，且水解后的蛋白肽抗氧化能力(清除abts自由基能力)一般，现有方法仅停留在实验室规模(为了更好分离蛋白肽，多采用超滤等高成本手段)，并不适合工业上大量生产，再加之实验室提取效果较差，本领域技术人员很难去选择大孔吸附树脂技术进行工业提取，且蛋白肽对外界ph与缓冲体系非常敏感，仅采用有限次的摸索很难得到适合澳洲坚果蛋白肽的提取缓冲体系及吸附树脂，至今也没有人探索出适合澳洲坚果蛋白肽的大孔吸附树脂与超声波酶解联用的方法。
实施例6
本实施例中固体饮料，以重量份计，包括以下原料：
上述固体饮料的应用如下：
所述固体饮料的制备方法为：步骤一：将牛磺酸、聚甘油-6二硬脂酸酯和水预混合得到预配液一；
步骤二：将羧甲基纤维素钠、氯化钠、氯化钾、山楂粉、果胶、大豆粉及水预混合得到预配液二；
步骤三：将澳洲坚果蛋白肽加入水中进行混合，搅拌均匀后得到预配液三；
步骤四：将预配液二送至反应釜内，搅拌的同时加入预配液一，然后降温至30℃，加入预配液三进行均质处理后低温浓缩，即可。
实施例7
本实施例中固体饮料，以重量份计，包括以下原料：
上述固体饮料的应用如下：
所述固体饮料的制备方法为：步骤一：将牛磺酸、聚甘油-6二硬脂酸酯和水预混合得到预配液一；
步骤二：将羧甲基纤维素钠、氯化钠、氯化钾、山楂粉、果胶、大豆粉及水预混合得到预配液二；
步骤三：将澳洲坚果蛋白肽加入水中进行混合，搅拌均匀后得到预配液三；
步骤四：将预配液二送至反应釜内，搅拌的同时加入预配液一，然后降温至30℃，加入预配液三进行均质处理后低温浓缩，即可。
实施例8
本实施例中固体饮料，以重量份计，包括以下原料：
上述固体饮料的应用如下：
所述固体饮料的制备方法为：步骤一：将牛磺酸、聚甘油-6二硬脂酸酯和水预混合得到预配液一；
步骤二：将羧甲基纤维素钠、氯化钠、氯化钾、山楂粉、果胶、大豆粉及水预混合得到预配液二；
步骤三：将澳洲坚果蛋白肽加入水中进行混合，搅拌均匀后得到预配液三；
步骤四：将预配液二送至反应釜内，搅拌的同时加入预配液一，然后降温至30℃，加入预配液三进行均质处理后低温浓缩，即可。
对比例3
本实施例中固体饮料，以重量份计，包括以下原料：
上述固体饮料的应用如下：
所述固体饮料的制备方法为：步骤一：将牛磺酸、聚甘油-6二硬脂酸酯和水预混合得到预配液一；
步骤二：将氯化钠、氯化钾、山楂粉、果胶、大豆粉及水预混合得到预配液二；
步骤三：将澳洲坚果蛋白肽加入水中进行混合，搅拌均匀后得到预配液三；
步骤四：将预配液二送至反应釜内，搅拌的同时加入预配液一，然后降温至30℃，加入预配液三进行均质处理后低温浓缩，即可。
对比例4
本实施例中固体饮料，以重量份计，包括以下原料：
上述固体饮料的应用如下：
所述固体饮料的制备方法为：步骤一：将牛磺酸和水预混合得到预配液一；
步骤二：将羧甲基纤维素钠、氯化钠、氯化钾、山楂粉、果胶、大豆粉及水预混合得到预配液二；
步骤三：将澳洲坚果蛋白肽加入水中进行混合，搅拌均匀后得到预配液三；
步骤四：将预配液二送至反应釜内，搅拌的同时加入预配液一，然后降温至30℃，加入预配液三进行均质处理后低温浓缩，即可。
对比例5
本实施例中固体饮料，以重量份计，包括以下原料：
上述固体饮料的应用如下：
所述固体饮料的制备方法为：步骤一：将牛磺酸和水预混合得到预配液一；
步骤二：将氯化钠、氯化钾、山楂粉及水预混合得到预配液二；
步骤三：将澳洲坚果蛋白肽加入水中进行混合，搅拌均匀后得到预配液三；
步骤四：将预配液二送至反应釜内，搅拌的同时加入预配液一，然后降温至30℃，加入预配液三进行均质处理后低温浓缩，即可。
分别选取实施例6-8及对比例3-5制备的化妆品进行试验，参照在先专利文献(中国发明专利，申请号：cn201810646683.6，公开公告号：cn108841905a，公开了一种具抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽及其制备方法)进行相关指标(抗疲劳能力)测定，其中需要将每10g固体饮料用100ml纯水进行溶解，制得溶解后的固体饮料：
延缓疲劳功能的测定试验按照如下方法进行测定：
(1)实验动物饲养与分组
280只清洁级昆明种小鼠，于洁净动物实验室适应性饲养一周，每8-10只一笼，分笼饲养，保持垫料干燥卫生，每三天换洗一次。每天按时打扫，做好消毒灭菌等工作，保证洁净动物实验室干净整洁。室温25±2℃，相对湿度50±5％，光照明暗间隔为12h，以鼠标准饲料常规饲养，自由进食和饮水，每周记录一次小鼠体重。经过一周的适应期后，280只小鼠随机分为7组，即空白组、对比例3组、对比例4组、对比例5组、实施例6组、实施例7组和实施例8组。空白组小鼠灌胃等量的生理盐水，其它6组的剂量设为50ml/kg/d，每天上午9:00-10:30期间灌胃，灌胃30天后，检测受试样品(即溶解后的固体饮料)的抗疲劳功效。
(2)负重游泳实验
末次给样30min后，从各组中随机取10只小鼠，将其尾根部缠绕5％体重的铅皮后，放置于游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温25±1℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。
(3)肝糖原、过氧化氢酶(cat)、超氧化物歧化酶(sod)及谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)测定
末次给样30min后，从各组中随机取10只小鼠拔眼球采全血，将收集到的血液于3000r/min离心10min，取血清备用，按照cat、sod和gsh-px测试盒进行测定。采血完成后，立即解剖小鼠，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏100mg，按照肝糖原检测试剂盒说明进行测定。
上述相关测试如表2所示，
表2
从以上结果(表2)可以看出，本发明的固体饮料不仅可以延长小鼠的游泳时间，促进肝糖原的合成，而且提升cat、sod、gsh-px酶的活性，延缓体力疲劳；此外，对比例3和对比例4分别为去除聚甘油-6二硬脂酸酯与羧甲基纤维素钠的固体饮料，可以看出这两种物质对于稳定固体饮料中澳洲坚果蛋白肽具有关键性作用。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。