冷却肉生物保鲜剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于食品保鲜技术领域，具体涉及冷却肉生物保鲜剂及其制备方法和应用。

背景技术：

冷却肉(又叫冷鲜肉)是指动物被屠宰后，畜体迅速进行冷却处理，胴体温度在24h内降至0℃～4℃，但不会冻结，并在后续加工、流通和销售过程中始终保持在0℃～4℃的肉制品，保质期通常为3～5d。冷鲜肉有效克服了热鲜肉和冷冻肉的固有缺点，在不要求长期存放的前提下提供消费者丰富营养与满意口感的最佳选择。因此，如何采用各种天然的保鲜剂进一步延长冷却肉的保存期，并保持其良好色泽、汁液流出及外观，也是冷却肉发展中的关键问题。在肉类食品保鲜剂的筛选中，以生物物质替代化学合成物质己成为食品保鲜剂研究的趋势。气调保鲜、超高压保鲜与辐照保鲜等物理保鲜方式也在食品中应用，但也存在一些不足，如超高压保鲜对食品本身的质地会产生影响，辐照保鲜会使肉品产生难以接受的“辐照臭气”。

近些年来，国内外对具有生物安全性的天然产物研究相当重视，发现了纳他霉素、ε-多聚赖氨酸、nisin、迷迭香提取物、茶多酚、植物精油等多种来源于微生物以及动植物的天然产物对肉制品保鲜具有一定效果，并作为食品添加剂使用。但目前尚未有用于冷却肉品、生鲜肉的食品添加剂国家标准。

天然药用植物中所含有的生物碱类、黄酮类以及有机酸类化合物等生物活性物质，除了均具有药理特性且成分复杂，往往具有调味增香、营养保健、抗菌防腐等综合功能，在食品工业上具有不可比拟的优越性。

现有冷却肉保鲜技术中主要存在以下问题：化学合成助剂多、天然保鲜剂货架期短、添加后影响生鲜肉的色泽和外观、配方组成复杂、成本高、来源困难等。

中国发明专利(cn101433230a)公开的一种冷却肉复合防腐保鲜剂中含有化学鳌合剂乙二胺四乙酸盐等且保藏时间保质期延长10d左右，中国发明专利(cn102422868a)公开的冷却肉涂膜保鲜剂中也含有甘油、蔗糖脂肪酸酯、油酸化学剂成分，一种冷却肉保鲜膜垫的制备方法(专利申请号:cn200810172330.3)，需要成分多、但专利中没有提及产品货架期，实际应用效果不能确定。中国发明专利(公开号cn101708013a)公开的一种延长冷鲜鸡肉保鲜期的方法中除了nisin外，还含有脱氢醋酸钠和月桂酸单甘脂的化学防腐剂，且保藏时间短。中国发明专利(公开号cn102499276a)公开的一种冷鲜鸡肉复合保鲜方法虽然能使鸡肉在4～8℃下可保鲜28天左右，但是除了nisin外，配方成分更多且含有化学合成助剂。焦镭等人的研究发现采用含丁香、紫丹参、迷迭香、厚朴、苦参等制备中草药复配液，将其应用于冷却鸡胸脯肉保鲜上，中草药复配液可以使冷却肉的货架期延长到7天以上，该工艺虽然可以应用于冷却鸡胸脯肉保鲜，但是货架期仅有7天，导致难以大规模应用(焦镭,王文艳,崔俊林,etal.中草药复配液在冷却鸡肉中的保鲜效果研究[j].黑龙江畜牧兽医,2013(14):68-70.)。中国发明专利(公开号：cn106035609a)公开的一种生物源复合猪肉保鲜剂，涉及包括nisin、壳聚糖、石榴皮水提物、迷迭香醇提物在内的20多种成分组成，尤其还使用了超临界co2提取法，导致制备时要求设备高、材料多、成本高、制备困难等缺点，且此报道中添加多种中药提取物使用时，未对提取物进行脱色处理，可能影响冷鲜肉外观。

技术实现要素：

针对现有冷却肉保鲜技术中存在的化学合成助剂多、天然保鲜剂货架期短、添加后影响生鲜肉的色泽和外观、制备困难、成本高以及配方组成复杂的技术缺陷和不足，本发明提供一种冷却肉的生物保鲜剂及其制备方法和应用，此保鲜剂的原材料来源方便、种类少、提取制备工艺简单、成本低、添加后不影响生鲜肉外观，能使冷却肉保质期延长至18d以上，使用效果较好，适合工业化应用。

本发明提供以下技术方案：

本发明提供的冷却肉生物保鲜剂，由石榴皮醇提物、黄芩醇提物、脂溶性迷迭香粗提物干粉、nisin、壳聚糖、醋酸水溶液组成，每100ml冷却肉生物保鲜剂的组分为：25ml浓度为1～3g/ml的石榴皮醇提物、20ml浓度为1～2g/ml的黄芩醇提物、0.02～0.03g脂溶性迷迭香提取物干粉、0.02～0.025gnisin和0.5～1.5g壳聚糖，余量是醋酸水溶液。

此冷却肉生物保鲜剂充分利用了各天然保鲜剂的抑菌性、抗氧化性和成膜性，充分发挥了保鲜剂间协同增效作用，不仅可以增强其保鲜效果，而且可以降低单一保鲜剂的使用量，延长产品货架期，从而减少其对冷却肉品质的影响，提高其应用的安全性。

优选地，每100ml冷却肉生物保鲜剂的组分为：25ml浓度为1g/ml的石榴皮醇提物、20ml浓度为1g/ml的黄芩醇提物、0.03g脂溶性迷迭香提取物干粉、0.025gnisin和1g壳聚糖，余量是醋酸水溶液。

本发明提供的冷却肉生物保鲜剂的制备方法，具体为：

先将石榴皮醇提物和黄芩醇提物混合，然后依次加入脂溶性迷迭香提取物干粉、nisin，搅拌均匀，再加入用醋酸水溶液溶解的壳聚糖，最后用醋酸水溶液定容，即制备成冷却肉生物保鲜剂。

优选地，石榴皮醇提物或黄岑醇提物的制备，具体为：将石榴皮或黄岑在60℃条件下烘干，粉碎过60目筛，按1:25的料液比加入60％的食用级乙醇，在200w、50℃条件下超声1h，重复2～3次，然后真空抽滤，收集滤液，用活性炭和大孔树脂脱色，然后将脱色后的提取液旋转蒸发浓缩至所需浓度。此浓度计算方法为石榴皮或黄岑质量/浓缩液体积。

优选地，所述脱色具体为：将石榴皮醇提物或黄岑醇提物在ph＝3～5、温度35～55℃条件下，用1％～3％活性炭进行超声脱色30～60min，去除活性炭，然后用大孔吸附树脂hz-818进行吸附，用50～70％食用乙醇洗脱获得洗脱液。

优选地，所述的脂溶性迷迭香提取物干粉的制备，具体为：将迷迭香在60℃条件下烘干，粉碎过60目筛，按1:20的料液比加入80％的食用级乙醇，在70℃条件下回流提取1.0h，收集滤液，减压浓缩，用60～90℃石油醚等体积萃取3次，分出石油醚液和醇水液，再将石油醚液浓缩后用水洗涤3次获得水液，将水液和醇水液浓缩至浸膏状，用水洗涤，获得不溶物直接减压干燥得脂溶性迷迭香粗提物，然后将粗提物溶解后用2％～4％活性炭在40～60℃进行超声脱色，然后去除活性炭，将脱色浸提液进行真空浓缩，干燥获得干粉。该粗提物中主要含鼠尾草酸和鼠尾草酚，其中鼠尾草酸含量约10％～15％。

本发明还提供了冷却肉生物保鲜剂在保鲜冷却肉中的应用，具体为：首先将冷却肉生物保鲜剂在200w、40℃条件下超声除菌30min，将冷却肉在超净工作台或无菌室用无菌水漂洗、去污，然后将所述冷却肉生物保鲜剂均匀涂抹于冷却肉的表面，在紫外下照射30～45min，吸干冷却肉表面多余的水分，然后用无菌真空包装袋进行包装，于4℃冰箱贮藏。

石榴皮是石榴的干燥果皮，占石榴总重的20％～30％，石榴皮可以入药，味酸涩，性温，有涩肠止血的功能，可以治疗多种急慢性痢疾及痔疮出血等症。石榴皮醇提物中含有多种生理活性物质，主要包括鞣质(多酚)、黄酮类及其糖苷、生物碱和有机酸等。石榴皮具有很好的抗氧化、清除自由基、抑制脂质过氧化和广谱的抗菌功效。

迷迭香是一种非常名贵的天然香辛料植物，迷迭香提取物是目前最强的天然抗氧化剂，且可耐高温，它的主要成分是具有抗氧化功能的酚、酸、黄酮类物质。这些酚类物质具有较强的抗菌抗氧化功能，可以有效延长食品保质期，并对食源性致病菌起抑制作用。脂溶性迷迭香提取物为淡黄色至淡粉色粉末，主要成分是鼠尾草酸、鼠尾草酚、熊果酸等。

黄岑为唇形科植物黄芩的干燥根，为我国传统常用中药，具有清热燥湿、泻火解毒等功效。黄芩具有抗氧化、抗菌等生理活性，其主要药效活性成分为黄芩苷、黄芩素等。

壳聚糖是由甲壳素经脱乙酞基化反应得到的一种多糖类有机聚合物，具有生物降解、吸附、成膜和杀菌等特性。壳聚糖的抑菌范围较广、抗菌活性较强，安全性高，对人体没有拮抗作用。

乳酸链球菌素(nisin)是从乳酸链球菌发酵产物中制备的一种多肽抗菌素类物质，是一种世界公认的、安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。nisin在食品防腐中的重要价值在于它对梭菌和芽孢杆菌的有效作用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明的冷却肉生物保鲜剂各成分(石榴皮醇提物、黄芩醇提物、脂溶性迷迭香提取物干粉、nisin、壳聚糖)均来源于天然生物活性成分，种类少，使用安全，3种植物提取物提取工艺简单、成本低，保鲜剂制备时对提取物进行了脱色，添加后不影响肉的外观。

(2)本发明充分发挥了保鲜剂各成分间协同增效作用，具有较单一时保鲜效果好、货架期长的优点。弥补了天然保鲜剂单独使用时抑菌谱窄、脂质氧化能力弱、保鲜效果有限的缺点。多种栅栏因子综合使用，极大地提高了冷却肉的货架期。

(3)此保鲜剂配方结合紫外照射和无菌包装袋真空包装，减少了冷却肉被污染的机会。冷却肉4℃贮藏抑制了微生物的生长，减缓了冷却肉品质的劣变。该复合保鲜剂制备工艺简单，操作方便，效果良好，具有广阔的商业使用价值。

附图说明

图1为冷却肉保鲜方法工艺流程图。

图2不同处理组对冷却鸡肉冷藏期间tvb-n值。

图3不同处理组对冷却鸡肉冷藏期间tbars值的影响。

图4不同处理组对冷却鸡肉冷藏期间菌落总数的影响。

图5不同处理组对冷却兔肉冷藏期间tvb-n值。

图6不同处理组对冷却兔肉冷藏期间tbars值的影响。

图7不同处理组对冷却兔肉冷藏期间菌落总数的影响。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明本发明的技术方案，而非用来限制本发明的保护范围。

实施例中nisin(河南百特生物科技有限公司)、壳聚糖(浙江一诺生物科技有限公司)提供；石榴皮、连翘、金银花、茶叶、黄芩购自平顶山市国大药房中药店；迷迭香茎叶由河南佳尚农业科技有限公司提供。

醇提物的制备：将60℃烘干的5种植物原材料(茶叶、金银花、黄岑、连翘、石榴皮)，用高速粉碎机粉碎并过60目筛，按1:25的料液比加入60％的乙醇，在200w、50℃条件下超声1h，重复2～3次，然后真空抽滤，收集滤液，将过滤后的药液旋转蒸发浓缩至1g/ml，除菌备用。

脂溶性迷迭香提取物干粉的制备：将迷迭香茎叶在60℃条件下烘干，粉碎过60目筛，按1:20的料液比加入80％的食用级乙醇，在70℃条件下回流提取1.0h，收集滤液，减压浓缩，用60～90℃石油醚等体积萃取3次，分出石油醚液和醇水液，再将石油醚液浓缩后用水洗涤3次获得水液，将水液和醇水液浓缩至浸膏状，用水洗涤，获得不溶物直接减压干燥得脂溶性迷迭香粗提物，然后将粗提物用少量乙醇溶解后加水稀释，用2％～4％活性炭在40～60℃条件下进行超声脱色，然后去除活性炭，将脱色浸提液进行真空浓缩，低温冷冻干燥。该粗提取物中主要含鼠尾草酸和鼠尾草酚，其中鼠尾草酸含量约10％～15％。

实施例1不同植物材料提取物的体外抑菌活性分析

1.1茶叶、金银花、黄岑、连翘、石榴皮醇提物的抑菌活性分析

为了筛选抑菌效果好的植物提取物作为保鲜剂，先选用5种已有报道具有一定保鲜效果的植物提取物进行抑菌活性研究。

分别取100μl活化好的食源性致病菌(肠炎沙门氏菌肠炎亚种atcc14028，鼠伤寒沙门氏菌cmcc50115，李斯特氏菌，大肠杆菌atcc25922以及副溶血性弧菌atcc17802)稀释至菌液浓度为10⁷cfu/ml，涂布至琼脂平板。然后用打孔器打孔，在孔内加入不同浓度的5种植物材料(茶叶、金银花、黄岑、连翘、石榴皮)提取液(80μl)，先放入4℃冰箱约2h待提取液均匀扩散到琼脂平板中，再放入37℃培养箱中培养20～24h，每组设3个平行，测定抑菌圈的直径，取平均值，记录数据。通过琼脂平板扩散法测定不同植物材料醇提液的抑菌效果。

结果表明：在5种植物提取液中，在1g/ml质量浓度下，茶叶醇提物对李斯特氏菌和大肠杆菌存在较好的抑菌效果；金银花醇提物仅对李斯特氏菌存在较弱的抑菌作用；黄芩醇提物对5种致病菌效果均好。连翘与石榴皮醇提物对5种食源性致病菌均有较好的抑菌效果且使用浓度较低，尤其石榴皮醇提物在相同浓度下较连翘醇提物的综合抑菌效果更好(表1)。

表15种醇提物的抑菌情况

注：抑菌圈直径＝测量所得直径-打孔器直径，打孔器直径8mm.数据＝平均值±标准误。

1.2连翘醇提物、黄岑醇提物、石榴皮醇提物和其它生物源食品添加剂复配的抑菌活性分析

因不同提取物之间可能存在活性成分不同，混合使用时可能存在拮抗作用。为了寻找具有协同效果好的复配保鲜剂来弥补单一保鲜剂的局限性，对抑菌效果好的连翘、黄岑和石榴皮醇提物与其它生物源食品添加剂如抗脂质氧化能力强的脂溶性迷迭香提取物、以及具有抑菌和成膜性效果好的壳聚糖、对革兰氏阳性细菌抑菌效果好的nisin等进行复配，并测定了它们的抑菌活性。

复配分组如下：

组1：0.25g/ml连翘醇提物+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉，制备方法：向连翘醇提物中加入脂溶性迷迭香提取物干粉，搅拌，余量用无菌水补充。

组2：0.25g/ml连翘醇提物+0.02g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉，制备方法：同组1。

组3：0.25g/ml石榴皮醇提物+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉，制备方法：向石榴皮醇提物中加入脂溶性迷迭香提取物干粉，搅拌，余量用无菌水补充。

组4：0.25g/ml石榴皮醇提物+0.02g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉，制备方法同组3。

组5：0.25g/ml石榴皮醇提物+0.25g/ml连翘醇提物，制备方法：将石榴皮醇提物和连翘醇提物混合。

组6：0.25g/ml连翘醇提物+0.25g/ml石榴皮醇提物+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉，制备方法：将石榴皮醇提物和连翘醇提物混合，然后加入脂溶性迷迭香提取物干粉，搅拌，余量用无菌水补充。

组7：0.25g/ml连翘醇提物+0.25g/ml石榴皮醇提物+0.02g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉，制备方法：同组6。

组8：0.25g/ml石榴皮醇提物+0.025g/100mlnisin，制备方法：向石榴皮醇提物中加入nisin，搅拌，余量用无菌水补充。

组9：0.25g/ml石榴皮醇提物+1g/100ml壳聚糖，制备方法：向石榴皮醇提物中加入用1％醋酸溶解的壳聚糖，搅拌，余量用1％醋酸水溶液补充。

组10：0.025g/100mlnisin+1g/100ml壳聚糖+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉+0.25g/ml石榴皮粗提物，制备方法：向石榴皮醇提物中依次加入脂溶性迷迭香提取物干粉、nisin，搅拌均匀，再加入用1％醋酸溶解的壳聚糖，余量用1％醋酸水溶液补充。

组11：0.025g/100mlnisin+1g/100ml壳聚糖+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉+0.25g/ml石榴皮粗提物+0.2g/ml黄芩醇提物，制备方法：先将石榴皮醇提物和黄芩醇提物混合，然后依次加入脂溶性迷迭香提取物干粉、nisin，搅拌均匀，再加入用1％醋酸溶解的壳聚糖，余量用1％醋酸水溶液补充。

组9、组10和组11中，每1g壳聚糖用45～50ml1％醋酸溶解。

参照1.1的方法进行测定不同复配组的抑菌效果，结果见表2。

表2复配提取物的抑菌情况

结果表明，连翘醇提物与脂溶性迷迭香提取物干粉、石榴皮醇提物的复配对这5种食源性致病菌的综合抑菌效果较差，而石榴皮醇提物和脂溶性迷迭香提取物干粉复配后的综合抑菌效果较连翘醇提物和脂溶性迷迭香提取物干粉复配组以及石榴皮醇提物、连翘醇提物和脂溶性迷迭香提取物干粉复配组的抑菌好。这表明，不同提取物之间可能存在拮抗作用，复配之后影响其活性，不适合混合使用，尤其石榴皮醇提物和连翘醇提物之间。以石榴皮醇提物、连翘醇提物、脂溶性迷迭香提取物干粉和nisin制备成的复合物，也在冷却肉上进行了保鲜效果观察，结果表明此复配物保鲜效果较单一的石榴皮醇提物和单一的连翘醇提物效果差(结果未显示)。

将石榴皮醇提物分别与nisin、壳聚糖复配，观察抑菌效果，发现其对肠炎沙门氏菌亚种、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑制效果好于石榴皮醇提物和脂溶性迷迭香提取干粉物复配组。

进一步观察石榴皮醇提物与脂溶性迷迭香提取物干粉、nisin、壳聚糖、黄芩醇提物复配的综合抑菌效果，发现这5种活性物质之间均具有一定的协同作用，综合抑菌效果最佳。

实施例2保鲜剂在冷却肉中的保鲜应用

2.1保鲜剂配方

空白对照组：无菌水；

组1：0.025g/100mlnisin+1g/100ml壳聚糖+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉+0.25g/ml石榴皮醇提物+0.20g/ml黄芩醇提物；制备方法同实施例1。

组2：0.025g/100mlnisin+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉+1g/100ml壳聚糖；制备方法：取适量无菌水，向其中加入脂溶性迷迭香提取物干粉、nisin，搅拌均匀，再加入用1％醋酸溶解的壳聚糖，余量用1％醋酸水溶液补充。其中每1g壳聚糖用45～50ml1％醋酸溶解。

组3：0.25g/ml石榴皮醇提物+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉，制备方法同实施例1。

2.2保鲜剂的应用

2.2.1冷却鸡脯肉的保鲜效果

取新鲜鸡胸脯肉在6～8h内将鸡肉中心温度冷却至4℃，在无菌室内用无菌水漂洗，去污，淋干。将配置好的4组保鲜剂(空白对照组和组1～3)均匀涂抹于肉样表面，紫外照射30min，用无菌纱布或吸水棉吸干冷却肉表面多余的水分，然后用无菌真空包装袋进行包装，于4℃冰箱保存。每组设3个重复，分别在第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18d取样进行感官评定、tvb-n、tbars和微生物总数测定。(1)感官评定从气味、颜色、粘度和弹性方面参照gb2707-2016法进行，结果见表3。(2)tvb-n测定参照gb5009.228-2016法进行，国家规定鲜肉标准是100g肉中小于15mg的tvb-n含量。结果见图2。(3)tbars测定参考gb/t35252-2017方法进行，国家规定鲜肉标准是100g肉中小于0.5mg含量，结果见图3。(4)微生物指标测定参照gb4789.2-2016进行，鲜肉菌落总数的判定标准每g肉中小于10⁶cfu菌落数，结果见图4。

表3冷却鸡肉贮藏期间感官评定结果(d)

通过对4组数据的结果进行分析，与空白对照组相比，组1(0.025g/100mlnisin+1g/100ml壳聚糖+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉+0.25g/ml石榴皮醇提物+0.20g/ml黄芩醇提物)的保鲜效果明显高于其余各组，可将冷却鸡肉的保鲜期延长10～12d，尤其在抑制tvb-n、菌落总数方面效果比较好，在此期间能使冷却肉保持较好的色泽、弹性、不粘手，无明显异味。组2：0.025g/100mlnisin+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉+1g/100ml壳聚糖可将保鲜期延长6～7d；组3(0.25g/ml石榴皮醇提物+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉)能将可将保鲜期延长4～5d。

2.2.2冷却兔肉的保鲜效果

取新鲜兔背部肉、腹部肉和腿部肉，在6～8h内将兔肉中心温度冷却至4℃，在无菌室内用无菌水漂洗，去污，淋干。将配置好的4组保鲜剂均匀涂抹于肉样表面，紫外照射30min，用无菌纱布或吸水棉吸干多余的水分，然后用无菌真空包装袋进行包装，于4℃冰箱保存。每组设3个重复，分别在第4、6、8、10、12、14d取样进行tvb-n、tbars和微生物总数测定。结果见图5～7所示，组1(0.025g/100mlnisin+1g/100ml壳聚糖+0.03g/100ml脂溶性迷迭香提取物干粉+0.25g/ml石榴皮醇提物+0.20g/ml黄芩醇提物)的保鲜效果明显高于其余各组，可将冷却兔肉保鲜期延长8d以上。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。