延长果蝇寿命的培养基及其制备方法和使用方法与流程

本发明涉及生物培养基技术领域，具体领域为一种果蝇培养基。

背景技术：

果蝇作为一种重要的模式生物，具备繁殖力强、世代周期短、变异类型多且饲养简单等特点。目前它已被广泛用于生命科学的各个研究领域。尤其是果蝇大约75％与人类疾病同源的基因和代谢途径与人类十分相似，而作为研究衰老和衰老相关疾病的模式生物。

近年来，以果蝇为模式生物的科研队伍不断壮大，果蝇性状受环境和遗传的果蝇的培养基成分相互作用，用于饲养果蝇的培养基成分与含量对果蝇的大小、发育、繁殖与生存有着重要的影响。因此，果蝇培养基成分的优化随着果蝇在遗传学研究中的广泛应用成为了各实验室研究热点。

果蝇很容易饲养，但培养过程中培养基易发霉。果蝇生活在培养管中，能量的来源只有培养基，因此研究培养各成分对果蝇寿命的影响对于饮食限制具有实际意义。目前在遗传学研究和实验中，果蝇培养基中使用最多的是玉米粉等为主要原料制成的培养基，另外也有资料报道以麸皮为主要原料或以香蕉为原料来配制果蝇的培养饲养果蝇基。

许多方面的研究证明了抗衰老的根本目的在于尽可能的延长寿命，并在此基础上提高生命活力，故国内外均将细胞和整体寿命试验作为药物延缓衰老研究的主要检测手段。减缓自由基的生成、提高抗氧化能力、促进细胞增殖、提高免疫能力、对抗凋亡而发挥延缓衰老的功效、生命活力的提高及内分泌免疫相关基因上调等等也是抗衰老的重要目的。

桑黄是一种名贵的药用菌，桑黄活性成分的组成与含量是其保健治疗作用的根本。其报道较多的主要活性成分有桑黄多糖、黄酮类化合物、萜类化合物、吡喃酮类化合物、甾体类化合物等，药用成分表现在调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抑菌消炎、增强免疫力、保护肝脏，抗炎、止痛与免疫调节作用上预防和治疗关节炎等作用。近年来国内对的抗肿瘤和提高免疫等方面的学术研究及报道大量涌现，除此之外，桑黄的保肝、抗肝硬化作用有很多报道，桑黄具有对试验大鼠减轻肝细胞损伤，降低肝纤维化，改善肝脏微循环的作用，还可以降低空腹与餐后血糖浓度的作用。

目前，国内外不少医药企业，生物公司已在生产销售桑黄的各种产品，包括子实体、菌丝微粉末、提取物浸膏、桑黄茶、桑黄口服液等产品需求量大，备受消费者青睐。

songk.s.等(b-lymphocytesimulatingpolysaccharidefrommushroomphellinuslinteus.chempharmbull，1995：2105-2108.)用热水浸提桑黄菌丝体，得到蛋白多糖(plp)。plp包含质量分数为13.2％的多肽和82.5％的糖类。大约6.8％的总糖是葡萄糖醛酸，中性糖组成为：甘露糖44.2％、半乳糖(24.1％)、葡萄糖(21.1％)、阿拉伯糖(7.5％)和木糖(3.7％)。检测到10种氨基酸，主要是天冬氨酸和谷氨酸。parki.h.等(食用菌，2007，29(6)：3-4，桑黄菌的研究进展)从桑黄的培养液中分离出8种分泌酶(bace1)抑制物鉴定为6-(3，4-2-羟基)-4-羟-2-吡喃酮。

安徽大学郑媛等人(中国食用菌，2006，25(3):38-41，桑黄胞内多糖抗衰老作用的研究)采用桑黄胞内多糖作为果蝇培养基添加剂起到了延长果蝇寿命的作用，但是纯净的桑黄胞内多糖难于分离纯化；而且该实验中桑黄胞内多糖的添加量需要为培养基重量的4.0％，添加量过大，成本居高不下，实际应用前景有限。南京野生植物综合利用研究院和南京中医药大学联合发表的文章(食品工业科技，2015,36(12)：104-108，桑黄子实体多糖、黄酮和多酚含量与抗氧化活性相关性)中表明，桑黄子实体中多酚类物质和黄酮类化合物是桑黄子实体抗氧化性的主要功效成分，而且表明抗氧化物质主要存在于醇提取物中。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种延长果蝇寿命的培养基及其制备方法，采用低浓度桑黄的水提液添加到果蝇的培养基中，能延长果蝇的寿命，这一研究结果对人类延长寿命有重要的借鉴意义。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种延长果蝇寿命的培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)桑黄子实体的获得；(2)桑黄水体液的制备；(3)桑黄水体液冷冻干燥制备桑黄冻干粉；(4)配置桑黄冻干粉母液；(5)对桑黄冻干粉母液进行稀释；(6)配置培养基；

其中，步骤(1)中桑黄子实体为野生，采自吉林省，并经专业人员鉴定为桑树桑黄。

其中，步骤(2)具体为，将干燥的桑黄子实体小颗粒与水按照1:10的重量比例，在100℃沸水中煮2h，12000转/min下室温离心30min，滤得残渣进行二次提取，合并收集上清液到50ml灭过菌的离心管中。

其中，步骤(3)具体为，将装有上清液的离心管放在冷冻干燥器使其冷冻干燥成干粉备用；所述冷冻干燥器的冷冻温度为-55℃，干燥时间为15d。

其中，步骤(4)具体为，取干粉与水配置成1mg/ml的母液备用。

其中，步骤(5)具体为，将步骤(4)的母液进行稀释，具体依次为：

步骤a：即取母液18μl、加双蒸水982μl装在已灭菌的2ml离心管中为a液，震荡混匀后备用；

步骤b：准备15ml已灭菌离心管，装满13ml双蒸水后为b液，然后将a液用移液枪吸到b液中，将a液离心管离心5000rpm2min后，确保a液的1ml全部吸到b液中，然后用力颠倒混匀30次后离心5min后，即获得14mlc液，待备用。

其中，步骤(6)具体为，准备干净灭过菌的养虫小瓶，装满4g果蝇培养基，将步骤(5)配好的14mlc液倒入果蝇培养基中；加入25mg的酵母粉，塞好棉塞。

所述果蝇培养基为卡罗莱纳生物供应公司产品名为formula的培养基(此培养剂为市售饲养果蝇饲料，加水变蓝色，生产厂家位于伯灵顿，北卡罗来纳州；产品购买网址为www.carolina.com)

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种本发明延长果蝇寿命的培养基的使用方法，包括以下步骤：

(1)收集同一批次、同一时间内新出现的处女果蝇；

对加有formula培养基饲料的三角瓶中的备用果蝇，进行co2麻醉处理；将麻醉的果蝇全部倒掉，然后开始计时，计时后的2-4小时新出现的果蝇为处女果蝇；

将新出现的处女果蝇用co2麻醉处理，倒在试验的海绵操作台上，然后分别挑选雌雄各10只，移入盛有延长果蝇寿命的培养基的培养瓶后，将培养瓶横卧，以免果蝇粘在培养基上，盖好瓶塞，自由取食；

(2)待果蝇苏醒后即可将培养瓶放入恒温培养箱培养；将培养果蝇小瓶放在温度为25±1℃，相对湿度55-60％左右，光照：黑暗＝12h:12h的人工培养箱里；

(3)每隔5d更换一次相应的新鲜的延长果蝇寿命的培养基，活的果蝇成虫转管到新的培养基中，即果蝇用co2麻醉处理后立刻转入到装有新的培养基的培养瓶中。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明加入含有桑黄水提液的培养基，通过观察果蝇的寿命，能显著延长果蝇的寿命。与对照相比，同样的饲养条件下，包括温度和湿度，可以比对照的培养基上，通过半致死量计算，添加桑黄水提液可以显著的提高半致死的天数达7d，显著的延长了果蝇的寿命。

附图说明

图1为本发明的培养基制备流程照片；

图2为实施例2中对照组和添加桑黄水提液组的生存率曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

请参阅图1，一种延长果蝇寿命的培养基的制备方法，包括如下步骤：

(1)桑黄子实体的获得：野生桑黄子实体采自吉林，并由食用菌分类专家鉴定为桑黄。

(2)桑黄水体液的制备：将干燥的桑黄子实体小颗粒与水按照1:10的比例，在100℃沸水中煮2h，12000转下室温离心30min，滤得残渣进行二次提取，合并收集上清液到离50ml灭过菌的管心中；

(3)将装有上清液的离心管放在冷冻干燥器使其冷冻干燥成干粉备用；所述冷冻干燥器的冷冻温度为-55℃，干燥时间为15d；

(4)先配置成1mg/ml的母液进行备用；

(5)然后将步骤(4)的母液进行稀释，具体依次为：

步骤a：即取母液18μl加双蒸水982μl装在已灭菌的2ml离心管中为a液，震荡混匀后备用；

步骤b：准备15ml已灭菌离心管中，装满13ml双蒸水后为b液，然后将a液用移液枪吸到b液中，将a液离心管离心5000rpm2min后，确保a液的1ml全部吸到b液中，然后用力颠倒混匀30次后离心5min后，即获得14mlc液；

(6)准备干净灭过菌的养虫小瓶，装满4g培养基，将步骤(5)配好的14mlc液倒入培养基中；所述培养基为formula对照为14ml双蒸水；对照组和处理组分别3次生物学重复和3次技术重复，分别加入25mg的酵母粉，塞好棉塞。

上述培养基的配置，添加桑黄水提物的浓度为1μg/ml(即14mlc液和4gformula组成的体系中含有桑黄冻干粉的重量体积浓度为1μg/ml)，以不加桑黄水提物0μg/ml(即14mlc液采用14ml双蒸水替代和4gformula组成的体系中含有桑黄冻干粉的重量体积浓度为0μg/ml)的培养基为对照。

延长果蝇寿命的培养基的使用方法，包括以下步骤：

(1)收集同一批次、同一时间内新出现的处女果蝇，即：将三角瓶同样加有bluedietformula的培养基饲料的备用果蝇，进行co2麻醉处理后，将三角瓶中麻醉的果蝇全部倒掉，然后开始计时，计时后的2-4小时新出现的果蝇为处女果蝇；

将新出现的处女果蝇用co2麻醉处理，倒在试验的海绵操作台上，然后分别挑选雌雄各10只，移入后，将瓶横卧，以免果蝇粘在培养基上，分别放在装有延长果蝇寿命的培养基和对照培养基中里，盖好瓶塞，自由取食；所述同一时间为2-4h内；

(2)待果蝇苏醒后即可将培养瓶放入恒温培养箱培养；将培养果蝇小瓶放在温度为25±1℃，相对湿度55-60％左右，光照：黑暗＝12h:12h的人工培养箱里；

(3)每隔5d更换一次相应的新鲜的培养基，活的果蝇成虫转管到新的培养基中，即果蝇用co2麻醉处理后立刻转入到装有新的培养基的培养瓶中。每隔24h记录果蝇死亡的只数，直到果蝇全部死亡。并记录果蝇f1的蛹数及f1的成虫头数。

实施例2

采用实施例1的方法，在黑腹果蝇培养中的应用，具体如下：

(1)果蝇：为黑腹果蝇；

(2)处理方式：先将果蝇饥饿处理2-4h，将新羽化的果蝇用二氧化碳进行麻醉后，挑去雌雄果蝇各10只，移入后，将瓶横卧，以免果蝇粘在培养基上，待果蝇苏醒后即可将培养瓶放入恒温培养箱培养，每个处理3次重复：

(3)培养方式：将对照组和添加桑黄水提液组放入同一个培养中，设置温度为25±1℃，相对湿度60％左右，光照：黑暗＝12h:12h；添加桑黄水提液组所用浓度为1μg/ml。

(4)观察对照组和处理组：观察并记录果蝇的寿命并记录果蝇f1的蛹数及f1的成虫头数。

(5)实验结果：如图2所示。

结论：添加桑黄水提液延长了果蝇的寿命。通过计算半致死率，添加桑黄水提液的培养基能够比对照的延长7天，达到了显著水平(p≤0.05)。

这一结果不但为人类延长寿命提供了借鉴，同时也丰富了桑黄的药用价值。

本发明在研发过程中采用实施例1中步骤(1)-(5)中的方法制备桑黄水提物稀释液，然后采用稀释液与4gformula培养基构成具有延长果蝇寿命的培养基，考察桑黄水提物浓度梯度实验，结果发现添加桑黄水提物的浓度为1μg/ml时(是指稀释液与4gformula培养基组成的体系中，桑黄冻干粉的浓度为1μg/ml)，延长果蝇寿命的效果最佳；结果如表1所示：

表1添加不同浓度桑黄水提物对果蝇半致死率的影响

本发明研究表明，采用本发明制备的桑黄提取液可以大大延长果蝇寿命，尤其是在约为1μg/ml时(是指稀释液与4gformula培养基组成的体系中，桑黄冻干粉的浓度为1μg/ml)，果蝇半致死率的天数(d)延长了7天；与安徽大学郑媛等人(中国食用菌，2006，25(3):38-41，桑黄胞内多糖抗衰老作用的研究)研究相比，本发明所用的桑黄提取液用量低，而且无需对桑黄提取液进行分离纯化采取桑黄胞内多糖的形式使用；南京野生植物综合利用研究院和南京中医药大学联合发表的文章(食品工业科技，2015,36(12)：104-108，桑黄子实体多糖、黄酮和多酚含量与抗氧化活性相关性)中表明实际抗氧化物质主要存在于醇提取物中，本发明以果蝇的寿命为研究对象，证明单纯抗氧化指标与寿命延长无严格正相关，或者说抗氧化指标只是影响果蝇延长寿命的一种影响因素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的技术原理和技术精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。