本发明涉及一种复合植物蛋白肽及其制备方法，属于食品加工领域。
背景技术：
植物蛋白资源来源丰富，具有产量高、价格低的优势，通过酶法水解植物蛋白制备植物蛋白肽粉，符合现代食品生物工业的发展要求，具有广阔的应用前景；研究发现植物蛋白酶解物及其生物活性肽类物质，不仅能作为氨基酸供体，在体内具有优良的消化吸收性能，也是一类生物调节剂，在体内参与机体免疫调节、降血压、促进矿物质吸收、抗血栓等。
阿尔茨海默症（老年痴呆症，alzheimer’sdisease，ad）是一种发生在脑部的神经
退行性疾病；目前，全世界遭受ad困扰的患者有接近2000万，且该数字在2050年会达到3000～4000万；根据学者们的研究，目前与ad进程相关的两个重要影响因素有抗氧化和神经保护作用，目前科研工作者已从多种蛋白质及其衍生物中发现获得具有改善记忆功效的成分。
生物活性肽是指对各种生物的生命活性起到帮助或调节生理作用的一类肽化合物；肽是氨基酸的线性聚合物，也常称为肽链；蛋白质就是由一条或多条具有确定的氨基酸序列的多肽链构成的大分子；生物活性肽从构成上可以分为寡肽和多肽，最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽，其中只含有一个肽键；含有3个、4个、5个等氨基酸残基的肽分别称为三肽、四肽、五肽等；一般把含有几个至十几个氨基酸残基的肽链统称为寡肽、更长的肽链称为多肽；也有学者把超过12个而不多于20个残基的称为寡肽，含有20个以上残基的称为多肽，含有50多个以上残基的多肽称为蛋白质。
得益于生物活性肽多种多样的化学结构，其生物活性亦呈现出不同的差异，由此引发了国内外科研学者的研究热潮；目前已发现的具有记忆改善活性的有乳清蛋白肽、猪脑蛋白水解物等；徐琳琳等采用跳台试验、穿梭箱及morris水迷宫试验研究了乳清蛋白肽对小鼠被动、主动回避及空间的记忆能力的影响，发现一定剂量的乳清蛋白肽可在一定程度上改善小鼠的学习和记忆能力；以猪脑为原料提取制备的脑活素因富含活性肽及各类氨基酸，已成为脑部意外损伤、老年痴呆、记忆力减退和神经衰弱的常用药物，在临床上获得非常好的疗效，如何研发出一款日常可以饮用的饮品，但又可以达到改善记忆力的效果，是现在研究者的研究重点。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的问题，提供了一种复合植物蛋白肽。
本发明的另一个目的在于提供一种复合植物蛋白肽的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种复合植物蛋白肽，其特征在于，所述复合植物蛋白肽由复合植物蛋白经预处理、酶解后制得，所述复合植物蛋白包括三种或三种以上植物蛋白，按重量份计包括：核桃蛋白15~20份，和/或大豆蛋白7~12份，和/或玉米蛋白14~20份，和/或花生蛋白3~8份，和/或牡丹蛋白1~4份。
活性肽具有神经免疫活性，可以改善学习和记忆能力，流行病学和临床研究表明炎症和氧化应激与阿尔兹海默症（ad）有关，生物活性肽具有神经免疫营养活性，能降低炎症的程度，并在病理条件下加速神经元死亡；多肽，多酚等强抗氧化剂对改善ad有积极作用。
核桃蛋白酶解产物具有抗氧化和降血压活性，对东莨菪碱诱导的老年痴呆具有良好的改善作用，具有明显的改善记忆功效；大豆多肽能够通过神经营养作用保护pc12细胞不受过氧化氢诱导的脂质过氧化和细胞凋亡，具有潜在改善记忆功能；玉米蛋白酶解产物和牡丹蛋白酶解产物具有抗氧化、抗菌、抗炎症等生理活性，也具有潜在改善记忆功效；花生蛋白酶解产物也具有抗氧化等生理活性，花生多肽具有神经营养和神经保护的潜在作用。牡丹蛋白酶解产物中的必须氨基酸苏氨酸，赖氨酸的含量较高，苏氨酸具有恢复人体疲劳，促进生长发育的效果，赖氨酸能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。食源性多肽可以通过多种机制达到改善认知损伤的目的；三种或三种以上植物蛋白肽可以通过协同增效的作用，增大改善记忆效果。
氨基酸对学习和记忆具有积极的作用，如赖氨酸是大脑神经细胞再生的第一限制性氨基酸，赖氨酸缺乏则会影响大脑发育，精氨酸作为生物合成的前提物质，能够在nadph-依赖反应中转化为一氧化氮（no），而该过程与调控认知行为中的学习与记忆有关，氨基酸组成是表征蛋白多肽的功能和生物活性的重要指标之一，复合植物蛋白酶解产物中都含有丰富的氨基酸，大豆蛋白酶解产物中赖氨酸含量较高，核桃蛋白酶解产物中精氨酸含量较高，另外各种植物蛋白中谷氨酸和天冬氨酸含量均较高。
优选地，所述复合植物蛋白包括三种或三种以上植物蛋白，按重量份计包括：核桃蛋白16~18份，和/或大豆蛋白9~11份，和/或玉米蛋白16~18份，和/或花生蛋白4~6份，和/或牡丹蛋白2~3份。
优选地，所述复合植物蛋白包括三种或三种以上植物蛋白，按重量份计包括：核桃蛋白17.3份，和/或大豆蛋白9.8份，和/或玉米蛋白17.2份，和/或花生蛋白4.9份，和/或牡丹蛋白2.6份。
一种权利要求1所述复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白40~50份，按料液比g/ml为1:8~12加入去离子水，搅拌分散后，进行预处理；
s2：步骤s1所得液体加热到55~65℃，用naoh调节ph至7.5~8.5，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1~2份，酶活力18~23u/g，磁力搅拌水解3~4h，90~100℃高温灭活5~15min；
s3：冷却到55~65℃，加入alcalase碱性蛋白酶1~2份，酶活力2~4au/g，磁力搅拌水解2~3h，高温灭活；
s4：冷却到45~55℃，用hcl调节ph至5.0-7.0，加入flavourzyme复合酶1~2份，酶活力400~600lapu/g，磁力搅拌水解2~3h，高温灭活；
s5：用hcl调节ph至4.0~5.0，于7000~9000r/min条件下离心10~20min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
预处理可以破坏蛋白质构象，使蛋白质结构变得疏松，使蛋白酶位点暴露，可以提高酶解效率；由于不同酶在底物上的作用位点不同，采用多酶分步水解，可以增加水解产物中多肽含量并减少游离氨基酸含量，因在相同蛋白酶作用下产生肽，酶切位点相似或相同，分子量均500da--2000da之间，酶解后产生的小肽，可以加速复合植物蛋白肽的溶解和吸收，使共同具有的增加记忆力的功效协同增强，同时还具有提高免疫力，抗氧化和“降三高”的作用，另外来自不同蛋白的肽的相应特点，也可以各自发挥相应的功效。三种或三种以上的原料蛋白混合，蜂蜜曲霉蛋白酶首次应用在肽链的制备中。
优选地，所述步骤s1中所述预处理可以为短时加热、微波处理、超声波处理或超高压中的任一种。
优选地，所述步骤s2所用naoh为1mol/l。
优选地，所述步骤s4或/和步骤s5所用hcl为1mol/l。
优选地，所述步骤s2至步骤s4中所述高温灭活的条件为95℃温度下灭活10min。
与现有技术相比本发明具有以下技术效果：
本发明的复合植物蛋白肽制备方法，以三种或三种以上的植物蛋白混合成复合植物蛋白为原料，采用多酶分步水解，可以增加水解产物中多肽含量并减少游离氨基酸含量，因在相同蛋白酶作用下产生肽，酶切位点相似或相同，分子量均500da--2000da之间，酶解后产生的小肽，可以加速复合植物蛋白肽的溶解和吸收，使共同具有的增加记忆力功效协同增强，同时还具有提高免疫力，抗氧化和“降三高”的作用，另外来自不同蛋白的肽的相应特点，也可以各自发挥相应的功效。
本发明的复合植物蛋白肽制备方法，在酶解之前先对复合植物蛋白进行预处理，从而达到破坏蛋白质构象，使蛋白质结构变得疏松，使蛋白酶位点暴露，进而可以提高酶解效率的目的；
本发明的复合植物蛋白肽制备方法，将蜂蜜曲霉蛋白酶首次应用在肽链的制备中。研究表明，利用蜂蜜曲霉蛋白酶制备蛋白肽时，所制得的蛋白肽水解度较高，抗氧化性较好，在不同湿度条件下都有较好的吸湿性能。
本发明的复合植物蛋白肽，以三种或三种以上的植物蛋白经预处理、多酶分步水解制得，三种或三种以上植物蛋白肽可以通过协同增效的作用，增大改善记忆效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和对比例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
除特殊说明，本实施例、对比例以及实验例中所用的设备均为常规实验设备，所用的试剂均为市售可得。
实施例1
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：核桃蛋白17.3份，大豆蛋白9.8份，玉米蛋白17.2份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行短时加热预处理；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力18u/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；
s3：冷却到60℃，加入alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s4：冷却到50℃，用hcl调节ph至6.0，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s5：用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
实施例2
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：核桃蛋白15份，大豆蛋白7份，玉米蛋白14份，花生蛋白4.9份，牡丹蛋白2.6份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行微波处理预处理；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力20u/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；
s3：冷却到60℃，加入alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s4：冷却到50℃，用hcl调节ph至6.0，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s5：用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
实施例3
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：核桃蛋白20份，玉米蛋白20份，花生蛋白8份，牡丹蛋白4份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行超声波预处理；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力23u/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；
s3：冷却到60℃，加入alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s4：冷却到50℃，用hcl调节ph至6.0，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s5：用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
实施例4
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：核桃蛋白20份、玉米蛋白20份，花生蛋白3份，牡丹蛋白1份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行超高压预处理；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力20u/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；
s3：冷却到60℃，加入alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s4：冷却到50℃，用hcl调节ph至6.0，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s5：用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
对比例1
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：核桃蛋白17.3份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行超声波处理；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力20u/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；
s3：冷却到60℃，加入alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s4：冷却到50℃，用hcl调节ph至6.0，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s5：用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得植物蛋白肽。
本对比例与实施例2相比，只含有一种植物蛋白。
对比例2
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：核桃蛋白17.3份，大豆蛋白9.8份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行超声波处理；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力20u/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；
s3：冷却到60℃，加入alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s4：冷却到50℃，用hcl调节ph至6.0，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s5：用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
本对比例与实施例2相比，只包含两种植物蛋白。
对比例3
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：花生蛋白4.9份，牡丹蛋白2.6份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行超声波处理；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力20u/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；
s3：冷却到60℃，加入alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s4：冷却到50℃，用hcl调节ph至6.0，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s5：用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
本对比例去实施例2相比，只包含两种植物蛋白。
对比例4
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：核桃蛋白11.32份，大豆蛋白5.04份，玉米蛋白11.58份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行超声波处理；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力20u/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；
s3：冷却到60℃，加入alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s4：冷却到50℃，用hcl调节ph至6.0，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s5：用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
本对比例与实施例2相比，核桃蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白含量低于本发明含量。
对比例5
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：核桃蛋白17.3份，大豆蛋白9.8份，玉米蛋白17.2份，花生蛋白4.9份，牡丹蛋白2.6份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行超声波处理；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力20u/g，alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；s5.用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
本对比例与实施例2相比，步骤s2中同时加入蜂蜜曲霉蛋白酶、alcalase碱性蛋白酶、flavourzyme复合酶，多酶同时酶解。
对比例6
一种复合植物蛋白肽，按重量份计包括：核桃蛋白17.3份，大豆蛋白9.8份，玉米蛋白17.2份，花生蛋白4.9份，牡丹蛋白2.6份。
一种复合植物蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
s1：取复合植物蛋白45份，料液比g/ml为1:10加入去离子水，搅拌分散后；
s2：步骤s1所得液体加热到60℃，用naoh调节ph至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力20u/g，磁力搅拌水解3h，95℃高温灭活10min；
s3：冷却到60℃，加入alcalase碱性蛋白酶1份，酶活力2.4au/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；
s4：冷却到50℃，用hcl调节ph至6.0，加入flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500lapu/g，磁力搅拌水解2.5h，高温灭活；s5.用hcl调节ph至4.5,8000r/min离心15min，冷冻干燥得复合植物蛋白肽。
本对比例与实施例2相比，步骤s1没有进行预处理。
实验例1
体外乙酰胆碱酯酶抑制活性
乙酰胆碱酯酶（ache）,是人体神经信号传导中一种关键性酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，过高酶活性影响神经递质对突触后膜兴奋作用，进一步影响记忆信息传递，从而导致记忆下降。
选取实施例1~3和对比例1~6样品，样品浓度为20mg/ml，在96孔酶标板中分别加入30ulatci(碘化硫代乙酰胆碱，7.5mmol/l)、125uldtnb(5，5,-二硫双硝基苯甲酸，3mmol/l)、40ul缓冲溶液（50mmol/ltris-hcl，ph8，含0.1%牛血清蛋白bsa）和50ul样品，37℃保温2min后，加入30ul乙酰胆碱酯酶，412nm下扫描30次，间隔1min。计算公式为：
乙酰胆碱酯酶抑制率（%）=[1-（a样品-a样品空白）/（a对照-a对照空白）]*100
式中，a样品指加入样品并反应后其在412nm处吸光值；a样品空白指同浓度样品在此吸光值下的吸收；a对照指加入用pbs代替样品并反应后的吸光值；a对照空白指不加酶与样品时的吸光值。
体外检测方法分别测定实施例1~3和对比例1~6的复合植物蛋白肽的ache抑制活性，结构如表1所示：
表1实施例1~3和对比例1~6复合植物蛋白肽的ache抑制率
实验例2
sds-page电泳测定蛋白质相对分子质量
（一）仪器、原料和试剂
仪器：垂直版型电泳槽；直流稳压电源；50ul枪头，玻璃板、水浴锅、染色槽、烧杯、吸量管、滴管。
原料：0.5mg/ml样品溶液
试剂：tris-hcl缓冲液ph8.9，tris-hcl缓冲液ph6.7,30%分离胶储液，10%浓缩胶储液，10%sds溶液，染色液，脱色液。
（二）实验步骤
1、安装电泳槽
2、配胶
3、制备凝胶板
4、样品处理及加样
将0.5mg/ml样品溶液和标准蛋白液用沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用，将15ul样品小心加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，开始电泳。
5、电泳
将电泳仪打开，将电流调到10ma。待样品分离时，电流调至25ma，当蓝色染料迁移至底部，电流调为零，关闭电源，拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端做标记，染色。
6、染色及脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，用直尺量取各条带与凝胶顶端的距离。
7、计算
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上可找出其分子量。
相对迁移率rm=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）
实验结果表明，所得蛋白质相对分子量分布为500da-2000da之间。
本公开中诸如“包括”、“包含”、“具有”等等的词语是开放性词汇，指“包括但不限于”，且可与其互换使用。这里所使用的词汇“或”和“和”指词汇“和/或”，且可与其互换使用，除非上下文明确指示不是如此。这里所使用的词汇“诸如”指词组“诸如但不限于”，且可与其互换使用。
另外，如在此使用的，在以“至少一个”开始的项的列举中使用的“或”指示分离的列举，例如“a、b或c的至少一个”的列举意味着a或b或c，或ab或ac或bc，或abc（即a和b和c）。此外，措辞“示例的”不意味着描述的例子是优选的或者比其他例子更好。
提供所公开的方面的以上描述以使本领域的任何技术人员能够做出或者使用本公开。对这些方面的各种修改对于本领域技术人员而言是非常显而易见的，并且在此定义的一般原理可以应用于其他方面而不脱离本公开的范围。因此，本发明公开示意图被限制到在此示出的方面，而是按照与在此公开的原理和新颖的特征一致的最宽范围。
为了示例和描述的目的已经给出了以上描述。此外，此描述不意图将本发明公开的实施例限制到在此公开的形式。尽管以上已经讨论了多个示例方面和实施例，但是本领域技术人员将认识到其某些变型、修改、改变、添加和子组合。