一种用作保健食品传递载体的碳纳米材料的制备方法与流程

本发明涉及食品成分纳米技术领域，具体涉及一种用作保健食品传递载体的碳纳米材料的制备方法。

背景技术：

碳纳米材料有多种存在形式，其中单壁碳纳米管（swcnts）是由碳原子组成的具有无缝中空管状结构的一维量子材料，由一层棱形碳环结构卷曲而成的，同时还含有环形结构，通常为五元环和七元环。单壁碳纳米管的末端为半环碳网状结构，直径尺寸为0.6-2.4nm。由两层及两层以上不等的同心卷曲的碳环可构成多壁碳纳米管（mwcnts），直径一般为2.5-10nm。单壁碳纳米管的成键主要以sp²杂化为主，具有较大的比表面积，且表面含有大量的芳香结构，因此可以以共价或非共价形式结合与多种无机/有机分子，这些特殊的构造使其在食品领域的应用前景广泛。

由于单壁碳纳米管的水溶性较差，且具有一定的毒性，因此在食品与生物医学领域的应用中受到限制。而功能化修饰后单壁碳纳米管的吸附性能、生理溶解性、生物相容性等都得到了提高。单壁碳纳米管的修饰主要包括共价和非共价修饰两类，非共价修饰主要通过分子间π-π键堆积和范德华力等来提高单壁碳纳米管的分散性能，进而阻止其聚集；共价修饰主要通过共用电子对单壁碳纳米管进行表面改性，生成含氧基团，有利于对生物活性分子或药物的负载。

辅酶q10（coq10）是一种脂溶性类固醇，能够阻止atp合成代谢所需物质的减少、激活细胞的呼吸功能。当体内coq10缺乏时，健康状况会下降，尤其是在心脑血管疾病、与免疫功能有关的疾病以及癌症患者中更容易发生。因此，coq10可作为一种潜在的功能性保健食品，特定人群补充和摄入外源性coq10，对于维持心脑血管健康、预防衰老具有重要意义。

coq10在肠道中的吸收速率非常缓慢，这是由于coq10的分子量大，在水中不易溶解，因此直接口服后生物利用度很低。同时coq10暴露于空气中容易被空气氧化，且见光易分解，导致其在常规制剂如胶囊、片剂、注射剂中的稳定性较差，难以长期储存，从而影响了产品的质量和使用的效果。

目前，如何有效地提高coq10的稳定性和生物利用度成为了研究热点，已开发的coq10的新制剂包括固体分散体、环糊精包合物、乳剂、微囊、脂质体等。但这些制剂在一定程度上仍存在稳定性差、吸收效果不佳等缺点。而cnts作为食品营养成分的新型载体，在提高生物利用率和靶向性，以及在胃肠道的消化过程中对包埋物的保护、缓释等方面都具有明显优势。采用swcnts负载coq10，能有效地增强coq10的稳定性，防止其被氧化降解，同时能促进吸收。同时以高分子材料聚乙二醇（peg）作为修饰剂，能进一步提高载体的性能。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种设计合理的用作保健食品传递载体的碳纳米材料的制备方法，重现性好、成本低、产品质量好；避免了混酸由于氧化性过强导致的样品断裂；纯化并活化后的swcnts表面富含cooh，对coq10的负载率高，并可进行进一步的功能性修饰；使用peg对cnts进行修饰，使其具有缓释效果。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：它的步骤如下：

1、使用单一酸处理法对原始单壁碳纳米管（swcnts）进行截短并纯化，得到纯化后的swcnts；

2、将纯化后的swcnts上的羧基活化，即，加入长循环修饰剂聚乙二烯（peg），进行peg修饰，得pege修饰后的swcnts；然后再将得到的peg修饰后的swcnts采用荧光剂异硫氰酸荧光素（fitc）进行fitc修饰，最后透析、干燥，即得（fitc修饰后的swcnts）。

进一步地，将fitc修饰后的swcnts以混合搅拌法将coq10分别负载到上述原始swcnts、纯化后的swcnts、pege修饰后的swcnts以及fitc修饰后的swcnts中；建立测定coq10的hplc法，测定体外释放实验中coq10的含量，并计算负载了coq10的碳纳米材料的载药率和包封率。

进一步地，所述的步骤1中，纯化后的swcnts的粒径在120-600nm之间。

进一步地，所述的步骤1中，swcnts通过以下步骤纯化：向原始swcnts加入单一酸液并于高温下冷凝回流，冷却后过滤，反复洗涤并真空干燥后，即可。

进一步地，所述的保健食品为多醣或单糖、维生素、谷光甘肽、二十八醇等。

进一步地，所述的保健食品选自自由基清除剂、维生素b、低聚糖中任一种。

进一步地，所述的步骤1中单一酸处理法的酸液与原始swcnt的体积质量比例为1:1（ml:mg）。

进一步地，所述的步骤2中，在进行peg修饰过程中，纯化后的swcnts（即swcnts-cooh）与peg的质量比为1:1-1:2，在进行fitc过程中，peg修饰后的swcnts（即swcnts-peg）与fitc的质量比为50:1-10:1。

进一步地，所述的碳纳米材料与保健食品的质量比为1:2-2:1。

采用上述方法后，本发明的有益效果是：

1、使用酸处理对原始swcnts进行纯化，该方法重现性好、成本低、产品质量好；

2、使用单一酸（浓hno3）处理，避免了混酸（如浓硫酸加浓硝酸，或浓硫酸加h2o2）由于氧化性过强导致的样品断裂；

3、纯化并活化后的swcnts表面富含cooh，对coq10的负载率高，并可进行进一步的功能性修饰；

4、使用peg对酸化后的swcnts进行修饰，使其具有缓释效果。

附图说明：

图1是原始swcnts（blanksample）、swcnts-cooh、swcnts-peg、

swcnts-peg-fitc的透射电镜图。

图2是原始swcnts（blanksample）、swcnts-cooh、swcnts-peg的扫描电镜图。

图3是原始swcnts（blanksample）、swcnts-cooh、swcnts-peg、swcnts-peg-fitc的红外吸收光谱图。

图4是原始swcnts（blanksample）、swcnts-cooh、swcnts-peg、

swcnts-peg-fitc的xrd曲线图。

图5是原始swcnts（blanksample）、swcnts-cooh、swcnts-peg、

swcnts-peg-fitc的拉曼光谱图。

图6是原始swcnts（blanksample）、swcnts-peg、swcnts-peg-fitc

的dsc曲线图。

图7是负载了coq10的swcnts-cooh、负载了coq10的swcnts-peg的体外释放曲线图。

图8是原始swcnts（blanksample）、swcnts-cooh、swcnts-peg、

swcnts-peg-fitc的粒径与zeta电位测定结果表。

图9是负载了coq10的swcnts-cooh、负载了coq10的swcnts-peg的载药量、包封率测定结果表。

具体实施方式：

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本具体实施方式采用如下技术方案：

1、纯化（单一酸处理）：精确称取100mg原始swcnts于烧瓶中，量取100ml浓hno3，沿圆底烧瓶的瓶口加入其中，同时将附着于壁上的swcnts冲掉；在超声波清洗器中超声3h，使swcnts均匀分散；加入磁子，将其放置于

油浴锅中搅拌，将温度调至80℃，并装上冷凝管冷凝回流24h；反应结束后，

用去离子水稀释并取出磁子，同时将圆底烧瓶冷却静置；抽滤，将所得的黑色固体分散于去离子水中，10000rpm离心10min，除去上层液体，重复此步骤，直至将碳纳米管洗涤至中性；将样品放置于50℃干燥箱中干燥至恒重，得到纯化的swcnts，记为swcnts-cooh，备用；

2、peg修饰：精密称取200mgswcnts-cooh、250mg的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）和200mg的碳二亚胺（edc·hcl），加入100ml去离子水，并冲

洗掉附着于瓶壁的材料，将溶液浓度控制在ph5-7；超声30min，加入250mg

的nh2-peg2000-nh2，混匀；加入磁子，在45℃的油浴锅中剧烈搅拌24h；反应结束后取出磁子，抽滤，将所得的黑色固体分散于少量去离子水中，透析48h；将透析后的样品干燥至恒重，得到peg修饰的swcnts，记为swcnts-peg；

3、fitc修饰：精密称取100mgswcnts-peg，加入适量ph9.6的nahco3-na2co3缓冲溶液，并冲洗掉附着于瓶壁的材料；超声30min，加入磁子，在常温的油浴锅中避光剧烈搅拌；将3mgfitc，溶解于3g二甲基亚砜（dmso）中；将该溶液滴加到cnts-peg的分散液中，常温下搅拌24h；反应结束后取出磁子，抽滤；收集样品，加入少量去离子水，透析48h；将透析后的样品干燥至恒重，得到fitc修饰的swcnts，记为swcnts-peg-fitc。

4、hplc法测定coq10：

4.1、色谱条件：

色谱柱：c18柱（4.6mm×200mm，5μm），流动相：甲醇-正己烷（4:1），柱温：25℃，流速：1.0ml/min，检测波长：275nm，进样量：10μl；

4.2、建立测定coq10的方法，为体外释放实验中coq10含量的测定、包封率和载药量的计算做准备。

4.3、负载coq10：将100mgcoq10溶解于无水乙醇，再将100mg的

swcnts-peg-fitc分散于该溶液中；然后滴加适量ph7.4的磷酸盐缓冲液（pbs），超声30min；加入磁子，在37℃的油浴锅中剧烈搅拌24h，使coq10吸附于swcnts-peg-fitc；离心收集沉淀，以pbs溶液冲洗多次，干燥至恒重，

得到cnts-peg-fitc/coq10；同法将coq10负载到原始swcnts、swcnts-cooh

与swcnts-peg上，得三种样品，即swcnts/coq10、swcnts-cooh/coq10、swcnts-peg/coq10；

5、测定各个载体的粒径、pdi和zeta电位，并进行透射电镜和扫描电镜观察，即将原始swcnts（blanksample）、swcnts-cooh、swcnts-peg、swcnts-peg-fitc以去离子水为分散介质，用马尔文纳米粒径仪测定粒径、pdi和zeta电位。测定观察结果如下：

参看图8，原始swcnts的粒径较大，经纯化处理后，粒径变小，纯化处理的swcnts（即swcnts-cooh）的zeta电位达到-41.3mv，有较好的稳定性；swcnts-peg、swcnts-peg-fitc的zeta电位分别约为-25.1mv、-27.5mv，未经处理的swcnts（即原始swcnts）只有-2.14mv，稳定性极差，容易快速凝聚，同时原始swcnts的分散性较差，而被纯化和修饰后的swcnts（即swcnts-cooh、swcnts-peg、swcnts-peg-fitc）分散性较好。

参看图1，其中a为原始swcnts，b为swcnts-cooh，c为swcnts-peg，d为swcnts-peg-fitc；原始swcnts较长，分散性较差，易聚集；而swcnts-cooh较短，表面较为光滑，分散性比原始swcnts好，表明表面残留的无定形碳和金属催化剂已基本去除；对于swcnts-peg与swcnts-peg-fitc，能明显看到有链状物包覆在表面。

参看图2，其中a为原始swcnts，b为swcnts-cooh，c为swcnts-peg，原始swcnts为细长的丝状物，相互缠绕，形成网状结构，酸处理后的swcnts-cooh比处理前短，同时由于浓hno3的强氧化性，使swcnts的表面形貌发生了改变；swcnts-peg表面有附着物。

6、对各个载体进行红外光谱分析、x射线衍射（xrd）、拉曼光谱、差示扫描量热（dsc）等表征，表征结果如下：

参看图3，扫描波数范围为500-4000cm-1，x轴表示透光率(%)，y轴表示波数，单位为cm-1。原始swcnts（图中blanksample的谱图）并没有较为明显的特征峰，而纯化的swcnts（图中swcnts-cooh的谱图）、peg修饰的swcnts（图中swcnts-peg的谱图）、fitc修饰的swcnts（图中swcnts-peg-fitc的谱图）都在3430cm^-1、1630cm^-1处有吸收峰，其中3430cm^-1表示的是o-h键的伸缩振动峰，而1630cm^-1表示的是羧基中的c=o键的伸缩振动峰。经酸处理后，在2930cm^-1、2140cm^-1、1170cm^-1处出现了特征峰，它们分别对应c-h、c≡c和c-c键的伸缩振动和变形振动吸收峰，这说明酸处理后swcnts表面sp3杂化的碳增多，缺陷增多。图中peg修饰的swcnts和fitc修饰的swcnts也在o-h、c=o对应处有吸收峰，但是比swcnts-cooh的峰强度要弱很多，说明修饰后的swcnts表面也有羧基、羟基、羰基等含氧基团，但是修饰过程是共价修饰，因此会使含氧基团减少。

参看图4，26°和44°是原始swcnts的特征峰，swcnts-cooh和swcnts-peg、swcnts-peg-fitc在这两处都有相同的衍射峰，说明swcnts的结构并没有在反应中被严重的破坏，结构较为完好。纯化的swcnts、peg修饰的swcnts和fitc修饰的swcnts的特征峰要比原始swcnts更为明显。

参看图5，原始swcnts在1330cm^-1和1587cm^-1处有两个特征峰。1330cm^-1特征峰表示的是swcnts的缺陷和无序结构所引起的拉曼d带；而1587cm^-1处，是swcnts形成后出现的劈裂g带，是有序度的反应。d带和g带强度的比值为id/ig，可以用来比较碳纳米管上的缺陷程度，id/ig的数值越高，swcnts上的缺陷越多。原始swcnts的id/ig比值为0.214，表明其结构相对完整，样品较纯，但比值较低，缺陷过少。经酸处理后的swcnts的id/ig

比值增加到了0.361，这说明swcnts的缺陷程度随着酸的氧化而变多，同时

表明纯化后的swcnts表面功能化程度要比原始swcnts高很多。经peg修饰后的swcnts的id/ig比值为0.161，表明在修饰过程中swcnts上的碳原子也发生了一定的反应，修饰后的swcnts的d峰强度明显减弱，是由于其为松散结构，削弱了d峰的强度。经fitc修饰后的swcnts的id/ig比值为0.227，这表明在fitc修饰之后，比swcnts-peg的缺陷程度有所提高。

参看图6，原始swcnts并没有明显的失重峰；而peg修饰的swcnts在106.1℃和296.3℃有两个失重峰，fitc修饰的swcnts在137.5℃和345.1℃处有两个失重峰。第一个峰为swcnts吸附的水或溶剂的失重峰，第二个峰与swcnts表面修饰的peg骨架断裂和表面未反应完的羧基分解有关。

综合以上各项表征结果可知，与原始swcnts相比，酸处理后与功能化修饰后swcnts的理化性质均发生明显改变，证明对swcnts的纯化与表面修饰

达到了预期效果。

7、测定载药量和包封率：

将swcnts-cooh/coq10、swcnts-peg/coq10离心后量取上清液的体积，进样测定，以峰面积代入标准曲线求出上清液中coq10含量，带入公式计算：

载药量=药物量（包载）/载体量

包封率=药物量（包载）/总药量；

测定结果见图9，结果表明swcnts-cooh与swcnts-peg均能有效负载coq10，peg修饰后的swcnts（即swcnts-peg）载药性能有明显提高。

8、测定体外释放度：

取释放介质100ml，置于锥形瓶中，分别取20mg负载coq10的swcnts-cooh和swcnts-peg各自分散于10ml的释放介质中，加入到透析袋内，两端封口，置于释放介质中，将锥形瓶放于振荡器中，37℃时启动振荡，振荡速率为160r/min。分别于1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72、96、120h取样，每次取样2ml，进样测定，并及时补充等量介质；

释放介质的选择：由于coq10不溶于水，因此不能直接以pbs溶液或去离子水作为释放介质，所以选择用无水乙醇溶解coq10，并选用无水乙醇-pbs

（体积比为4:1）混合溶液作为释放介质。hplc法测定不同时间点释放液中药物的含量。经120h后多次测量，得到的coq10浓度趋于稳定，可以认为此时的coq10浓度为swcnts完全释放后的浓度。根据公式计算释放百分率：qn=cnvo+∑civi(i=0~n-1)；释放百分率（%）=q/w100%；以时间为横坐标，药物释放度为纵坐标作图。

参看图7，结果表明swcnts-cooh在24h内释放速率快，在24h释放度已经达到了81.01%，从36h后释放速率明显变缓，逐渐趋于稳定；而swcnts-peg在48h内释放速率一直比较缓慢，从72h后释放速率才逐渐趋于稳定。因此，peg的功能化修饰能够实现swcnts对coq10的缓慢释放，取得了预期效果。

采用上述方法后，本具体实施方式的有益效果是：

1、使用酸处理对原始swcnts进行纯化，该方法重现性好、成本低、产品质量好；

2、使用单一酸（浓hno3）处理，避免了混酸（如浓硫酸加浓硝酸，或浓硫酸加h2o2）由于氧化性过强导致的样品断裂；

3、纯化并活化后的swcnts表面富含cooh，对coq10的负载率高，并可进行进一步的功能性修饰；

4、使用peg对酸化后的swcnts进行修饰，使其具有缓释效果。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。