本发明属于生物化学领域，涉及一种乳酸菌复合剂，具体为降低辛硫磷对中华绒螯蟹毒性的乳酸菌复合剂及其制备方法。
背景技术：
中华绒螯蟹(eriocheirsinensis)又称河蟹，是重要的养殖经济蟹类。近年来中华绒螯蟹养殖模式在不断的改善和发展，养殖产量也在逐年上升。2014年中华绒螯蟹肝胰腺养殖产量高达79.65万吨，总产值达500亿元左右，中华绒螯蟹养殖已成为提高就业水平和改善人民生活质量的一个有效的手段。
稻田综合种养技术是将种稻和中华绒螯蟹养殖结合起来，把两个生产场所重叠在一起，提高了土地和水资源的利用率，充分发挥水稻和中华绒螯蟹共生互利的作用，从而获得有机水稻和有机中华绒螯蟹双丰收，达到“一水两用、一地多收”的效果。有利于粮食安全、食品安全和生态安全。经过近几年发展，稻田综合种养技术模式逐步成熟，综合效益发挥显著，示范带动效果明显，产业融合初见成效。但也发现了一些问题，主要是水稻田在以往长期的种植过程中或多或少使用了防治昆虫的农药，这些以往使用的农药在土壤中的残留对于中华绒螯蟹等水产养殖动物的毒性较强，产生了新的安全隐患。
其中，辛硫磷就是一种典型的传统农药，在种植业中长期广泛地使用，而它对于中华绒螯蟹等水产养殖动物毒性较强，具有典型的代表性。辛硫磷，phoxim，中文别名：肟硫磷、倍腈松、倍腈松乳油、肟硫磷乳油、辛硫磷乳油、辛硫磷颗粒剂。辛硫磷，杀虫谱广，击倒力强，以触杀和胃毒作用为主，无内吸作用，对磷翅目幼虫很有效，是农业种植业中常用的广谱性有机磷杀虫剂。在养殖过程中，曾经有由于水体中局部辛硫磷浓度过高造成中华绒螯蟹死亡的案例。
中华绒螯蟹养殖的安全性是目前危害产业发展的关键性因素。如何降低环境中辛硫磷等农药残留对于中华绒螯蟹的毒性，提高中华绒螯蟹存活率，克提高中华绒螯蟹品质，保障食品安全成为关键性技术因素之一。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种乳酸菌复合剂，该乳酸菌复合剂能够有效降低辛硫磷对中华绒螯蟹的毒性，提高中华绒螯蟹存活率，提高中华绒螯蟹品质。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种乳酸菌复合剂，包括如下组分：保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酶和缓冲剂，其中，保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌的总活菌浓度为大于等于100亿/克。
优选地，所述乳酸菌复合剂中的保加利亚乳杆菌占所述乳酸菌复合剂总质量的20～40％。
作为一种优选方案，所述乳酸菌复合剂由如下质量百分比组成：保加利亚乳杆菌20～40％，嗜酸乳杆菌12～45％，枯草芽孢杆菌10～45％，酶2～3％，缓冲剂0.8～5.5％。
更佳地，所述乳酸菌复合剂由如下百分比组成：保加利亚乳杆菌20％，嗜酸乳杆菌40％，枯草芽孢杆菌33％，酶2％，缓冲剂5％。
更优选地，保加利亚乳杆菌的活菌浓度为80～100亿/克。
更优选地，嗜酸乳杆菌的活菌浓度为70～100亿/克。
更优选地，枯草芽孢杆菌的活菌浓度为50～100亿/克。
作为一种优选实施方案，所述保加利亚乳杆菌的活菌浓度为100亿/克，嗜酸乳杆菌的活菌浓度为100亿/克，枯草芽孢杆菌的活菌浓度为100亿/克。
优选地，所述缓冲剂中各组分占所述乳酸菌复合剂的质量百分比为：磷酸二氢钾溶液0.1～1％、磷酸氢二钾溶液0.1～1％、硫酸镁溶液0.1～1％、氯化钠溶液0.5～2.5％。
优选地，所述酶为乳酸脱氢酶。
本发明的另一目的是提供上述乳酸菌复合剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)制备保加利亚乳杆菌：将保加利亚乳杆菌菌株接种到培养基中，活化后进行发酵，获取保加利亚乳杆菌菌粉；
步骤2)制备嗜酸乳杆菌：将嗜酸乳杆菌菌株接种到培养基中，活化后进行发酵，获取嗜酸乳杆菌菌粉；
步骤3)制备枯草芽孢杆菌：将枯草芽孢杆菌原种接种到培养基中，发酵，获取枯草芽孢杆菌菌粉；
步骤4)配置缓冲剂；
步骤5)将所述保加利亚乳杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉与缓冲剂和酶混合均匀即得。
需要注意的是，上述培养基为液体培养基，可根据《分子克隆实验指南》(j.萨姆布鲁克d.w.拉塞尔著)指导制备而得。
优选地，上述发酵为二级发酵。
优选地，步骤1)中的活化时间为18h。
优选地，步骤1)中发酵是按照5％接种量进行发酵。
更优选地，步骤1)发酵培养基配方为可溶性淀粉37％、豆粉30％、鱼粉20％、糖蜜10％，氯化钠3％。
更优选地，步骤1)中的发酵是在28℃发酵36h。
优选地，步骤1)中发酵后，用柠檬酸将液体发酵物的ph值调至4～4.5。
优选地，步骤2)中的活化时间为24h。
优选地，步骤2)中发酵是按照5％接种量进行发酵。
更优选地，步骤2)发酵培养基配方为可溶性淀粉45％、黄原胶10％、糖蜜30％、豆粉12％、氯化钠3％。
更优选地，步骤2)中的发酵是在28℃下发酵48h。
优选地，步骤2)中发酵后，用柠檬酸将液体发酵物的ph值调至5～5.5。
优选地，步骤1)中获取所述保加利亚乳杆菌菌粉的操作为：冷冻干燥。
优选地，步骤2)中获取所述嗜酸乳杆菌菌粉的操作为：冷冻干燥。
优选地，步骤3)中发酵是按照5％接种量进行发酵。
更优选地，步骤3)发酵培养基配方为麸皮38％、秸秆20％、豆饼粉29％、尿酸1％、氯化钠2％、草酸10％。
更优选地，步骤3)在37℃下发酵56h。
优选地，步骤3)中获取所述枯草芽孢杆菌菌粉的操作为：将液体发酵物于-40℃冷冻干燥。
本发明的有益效果是：
在稻田综合种养技术模式中，水稻田残留辛硫磷对于中华绒螯蟹等水产养殖动物的毒性较强，产生了安全隐患。本发明通过使用复方乳酸菌制剂降低综合种养模式环境中辛硫磷等农药残留对于中华绒螯蟹的毒性，提高中华绒螯蟹存活率，克提高中华绒螯蟹品质，保障食品安全。
此外，本发明提供的乳酸菌复合剂配方组分较少，生产流程简单，生产工序少，成本低廉，环境友好，符合“提质增效、减量增收、绿色发展、富裕渔民”的渔业生产转方式调结构的工作方针，也是中华绒螯蟹绿色减排提质增效养殖的核心技术，是推动水产养殖绿色发展的重要方向，应用前景十分广阔，具有很大的推广意义。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明作进一步详细、完整地说明。
所需仪器及试剂：
(1)仪器：
超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，恒温摇床，发酵罐，冷冻干燥仪，生化培养箱，干燥箱，粉碎机。
(2)试剂：
液体培养基，根据《分子克隆实验指南》(j.萨姆布鲁克d.w.拉塞尔著)指导制备而得。
保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌，由江苏宏螯农业发展有限公司自行分离鉴定。
磷酸二氢钾，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。
磷酸氢二钾，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。
硫酸镁，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。
氯化钠，化学纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。
实施例1～4
分别按照表1中各组分的质量百分比及活菌浓度采用以下方法制备本发明提供的乳酸菌复合剂：
表1
实施例1～4所用乳酸菌复合剂的制备步骤如下：
(1)制备保加利亚乳杆菌菌粉：无菌条件下，将保加利亚乳杆菌菌株接种到液体培养基中，置于37℃恒温摇床中活化18h，随后将活化后的格氏乳杆菌菌株放入发酵罐中，在28℃下按照5％接种量进行二级发酵36h，以柠檬酸调节ph至4，冷冻干燥，即得保加利亚乳杆菌菌粉，发酵培养基配方为(质量分数)可溶性淀粉37％、豆粉30％、鱼粉20％、糖蜜10％，氯化钠3％。
(2)制备嗜酸乳杆菌菌粉：无菌条件下，将嗜酸乳杆菌菌株接种到液体培养基中，置于37℃恒温摇床中活化24h，随后将活化后的植物乳杆菌菌株放入发酵罐中，在28℃下按照5％接种量进行二级发酵48h，以柠檬酸调节ph至5，冷冻干燥，即得嗜酸乳杆菌菌粉，发酵培养基配方为可溶性淀粉45％、黄原胶10％、糖蜜30％、豆粉12％、氯化钠3％。
(3)制备枯草芽孢杆菌菌粉：无菌条件下，将凝结芽孢杆菌原种接种到lb液体培养基中，在37℃下按照5％接种量进行二级发酵56h，喷雾干燥，即得枯草芽孢杆菌菌粉，发酵培养基配方为麸皮38％、秸秆20％、豆饼粉29％、尿酸1％、氯化钠2％、草酸10％。
(4)制备缓冲剂：按照表1所列配比混合均匀磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁和氯化钠粉末，即得缓冲剂。
(5)将上述保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酶和缓冲剂按照表1的百分含量混合均匀后得到成本发明提供的乳酸菌复合剂，常温保存即可。
活性效果实验
(1)乳酸菌复合剂降低辛硫磷残留对中华绒螯蟹急性毒性试验
在室内养殖条件下，相比对照组(未使用乳酸菌复合剂)，使用实施例1制备的乳酸菌复合剂的实验组中华绒螯蟹对辛硫磷的48h和96hlc50值显著提高，毒性显著降低(如表2辛硫磷残留对中华绒螯蟹急性毒性表所示)。该结果说明使用乳酸菌复合剂具有降低辛硫磷对中华绒螯蟹毒性的潜在应用价值。
表2
(2)乳酸菌复合剂降低辛硫磷残留对中华绒螯蟹毒性的大田试验
在采取综合种养的田间养殖模式下，辛硫磷残留具有一定水平的本底(9.15～12.52μg/kg)。相比对照组，在60d、90d和120d使用实施例1制备的乳酸菌复合剂的实验组中华绒螯蟹存活率显著高于对照组(如表3综合种养模式下中华绒螯蟹田间存活率比较表所示)，该结果说明在养殖生产中使用本发明所述乳酸菌复合剂具有降低辛硫磷对中华绒螯蟹毒性的作用。
表3
注：对照组和实验组田间污泥中辛硫磷平均残留量为9.15～12.52μg/kg。
谷丙转氨酶主要存在动物细胞浆中，谷草转氨酶主要存在于肝细胞线粒体中，所以一旦肝细胞收到损伤，生物膜的完整性收到破坏，谷丙转氨酶和谷草转氨酶就会释放到血液中，血液中两种酶的含量就会升高，因此，两种酶升高的程度就能间接反映出动物中毒程度。测定对照组和实验组中，中华绒螯蟹肝胰腺中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)在不同时间点的浓度。结果显示，使用乳酸菌复合剂能显著降低谷丙转氨酶、谷草转氨酶的浓度(如表4综合种养模式下中华绒螯蟹田间存活率比较表所示)，从安全毒理的角度证明了复合乳酸菌降低辛硫磷对中华绒螯蟹毒性的科学性。
表4
注：对照组和实验组田间污泥中辛硫磷平均残留量为9.15～12.52μg/kg。
同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用，仅为本发明技术方案的列举，并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。采用等同技术手段、等同设备等对本发明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书及说明书所公开的范围。