一种复合型高活性饲用益生菌添加剂及其生产方法与流程

本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种复合型高活性饲用益生菌添加剂及其生产方法。

背景技术：

中国是畜禽养殖大国，也是猪肉消费大国，因此动物源食品的安全显得尤为重要，而抗生素和化学药物残留问题是影响动物源食品安全的重要因素之一。由于养殖技术发展滞后和集约化养殖程度不高，导致我国的一个养殖现状是，在饲料中添加抗生素和化学药物，以达到防病促生长的效果。但是养殖畜禽长期、过量或违规使用抗生素和化学药物后，导致肉制品有抗生素或药物残留，同时存在抗生素使用效果下降、病原菌耐药性增加和水环境抗生素超标等严重问题。

饲用抗生素对人类健康和生存环境造成的不良后果已引起各级政府及广大消费者的极大关注，市场上关于“无抗养殖产品”的呼声越来越高。然而饲料中不添加抗生素时，动物拉稀、下痢严重，发病率死亡率高，养殖动物生产性能严重下降。为了克服抗生素的上述种种弊端，研发出能替代抗生素的无耐药性、无毒无残留的新型饲料添加剂成为发展的必然趋势。

微生物饲料添加剂正是从调整和恢复动物消化系统微生态平衡入手，通过加强其微生物区系的屏障功能或增进非特异性免疫，提高动物的抗病力，减少消化道疾病的发生，或是通过活菌在动物消化道内产生蛋白酶、氨基酸、多肽等物质，进而达到促进动物生长、提高饲料转化率、改善生产性能及增加养殖经济效益的目的。

目前国内微生物饲料添加剂已有多个品种上市，但大多数厂家的产品多为外部采购单个菌种原料，经简单的混料包装而成；为了节约成本，多选用较为常见的菌种如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸菌等，而且原料的活菌数可能不达标；另外对菌种的发酵过程和各菌群之间的相互作用及其机理了解甚少，导致产品活菌总数不能保持一定水平，产品质量不稳定；菌群单一，菌种较少；各菌种配比不科学，影响了其在使用过程中的效果。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种生产工艺可控，活菌数高，益生菌种类丰富，产品质量稳定的复合型高活性饲用益生菌添加剂及其生产方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种复合型高活性饲用益生菌添加剂，含有以下重量份的成分：纳豆芽孢杆菌粉10～30份，地衣芽孢杆菌粉10～30份，凝结芽孢杆菌粉10～20份，粪肠球菌粉10～20份，植物乳杆菌粉10～20份，酵母菌粉10～20份及辅料1～10份。

优选地，每克复合型高活性饲用益生菌添加剂含有的活菌数为：纳豆芽孢杆菌1.0*10⁹～2.0*10¹¹cfu/g、地衣芽孢杆菌1.0*10⁹～2.0*10¹¹cfu/g、凝结芽孢杆菌1.0*10⁹～2.0*10¹¹cfu/g、粪肠球菌1.0*10⁹～1.0*10¹¹cfu/g、植物乳杆菌1.0*10⁹～1.0*10¹¹cfu/g、酵母菌1.0*10⁹～1.0*10¹¹cfu/g。

优选地，所述辅料为糊精、葡萄糖或豆粕粉中的至少一种。

本发明还提供一种复合型高活性饲用益生菌添加剂的制备方法：菌种——试管斜面菌种培养——摇瓶种子培养——种子罐深层液体发酵培养——发酵罐深层液体发酵培养——菌剂半成品——检测合格——菌剂混合成品。

优选地，具体包括以下步骤：

步骤1，斜面活化：将纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌在无菌条件下分别接种到固体斜面培养基上；纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在25～38℃培养1～3天，植物乳杆菌在20～45℃条件下培养1～4天；

步骤2，一级种子培养：将所述步骤1中培养的斜面菌种在无菌条件下分别接种至灭菌后的摇瓶培养基中，纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在25～38℃，摇床转速120～200rpm条件下培养1～3天，植物乳杆菌在20～45℃条件下静置培养1～3天；菌种液体培养od600值在3.0～5.0时停止培养，得到一级种子；

步骤3，二级种子培养：在100l发酵罐中配制液体种子培养基，灭菌后降温至20～35℃，按液体种子培养基的体积比为0.1％～2％分别接种所述步骤2得到的一级种子，纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在25～38℃下发酵，搅拌速度设为0～200rpm，通气量为1：0.5～1.5，培养1～3天；植物乳杆菌在20～45℃条件下培养1～3天，搅拌速度设为10～50rpm，得到二级种子；

步骤4，发酵培养：在3000l发酵罐中配制液体发酵培养基，灭菌后降温至20～35℃，按液体种子培养基的体积比为2％～5％分别接种所述步骤3得到的二级种子，进行高密度发酵培养；其中纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在25～38℃下发酵，搅拌速度设为0～200rpm，通气量为1：0.5～1.5，培养1～3天；植物乳杆菌在20～45℃条件下培养1～3天，搅拌速度设为10～50rpm，得到各个菌种的发酵液；

步骤5，制备各个菌种的喷干粉：将所述步骤4中得到的各个菌种发酵液分别进行离心分离得到菌体，按重量比例加入1％～10％的辅料进行喷雾干燥得到喷干粉；

步骤6，检测有效活菌数；

步骤7，混合：将所述步骤6中检测合格的各个菌种的喷干粉及酵母菌粉按比例混合得到复合型高活性饲用益生菌添加剂。

优选地，所述步骤2中摇瓶培养基的装液量为1l三角瓶装200ml液体培养基。

优选地，所述步骤2、步骤3与步骤4中的灭菌条件为121℃灭菌20min。

优选地，所述步骤5中离心条件为：通过蝶式离心机进行离心分离，发酵液进料速度为1.0m³/h，排渣周期为600s。

优选地，所述步骤5中喷雾干燥条件为：喷雾时进风温度设为180℃，出风温度控制在63～65℃。

优选地，所述步骤7中混合条件为：在三维混合机中混合10～20min。

本发明中用到的纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌、酵母菌都是可通过商业购买获得的菌种。

本发明中各菌群的相互作用及机理：

①芽孢杆菌在动物肠道中生长代谢，产生多种有效的酶类、b族维生素和多种氨基酸，有助于饲料营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，促进动物生长；通过生物夺氧作用消耗肠道中大量的游离氧，维持肠道厌氧环境，抑制有害菌生长，促进乳酸菌、酵母菌等兼性厌氧菌快速增殖，维持肠道菌群平衡，从而起到整肠和防治胃肠疾病发生的作用。

②乳酸杆菌可自然定植于消化道，产生酶类、有机酸、乳酸菌素等多种物质。产生的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等消化酶，有助于动物对饲料的消化吸收；活菌体内和代谢产物中含有较高的氧化物歧化酶(sod)，能增强动物免疫功能；代谢产生的乳酸、乙酸等有机酸，可降低肠道ph值，抑制病原菌和腐败菌的生长，从而减少肠道疾病的发生。

③粪肠球菌可把部分蛋白质分解成酰胺和氨基酸，把大部分的碳水化合物转化为l型乳酸，可完全被动物吸收利用；而且能使饲料里的纤维变软，所以饲料的转化吸收率就比较高。粪肠球菌可分泌两类细菌素，一类仅只是对相关的菌有抑制作用，抗菌谱较窄，可阻碍病原微生物接触肠粘膜细胞；另一类具有广谱抗菌活性，它们对致病菌如沙门氏菌、致辞贺氏病和假单孢菌都有很好的抑制作用。所以，在饲料中添加粪链球菌可以减少养殖动物肠炎等疾病的发生。

④酵母菌可以通过改善胃肠道环境和菌群结构，调控胃肠发酵，减少乳酸盐的产生，提高ph值稳定性，从而促进以乳酸菌为主体的有益菌群繁殖及活力的提高，增加有益菌的有效浓度，促进胃肠对营养物质的分解、合成、消化、吸收和利用，从而增加采食量，改善动物对饲料的利用率，提高生产性能；另外酵母可作为活的细菌前体，进入胃肠道后繁殖并活力增强，能有效抑制病原微生物的繁殖，参与病原微生物菌群的生存竞争，排斥病原菌在胃肠道黏膜表面的附着，协助机体消除毒素，从而提高机体的免疫力。

与现有技术相比，本发明的技术效果主要体现在：本发明制备的复合型高活性饲用益生菌添加剂利用菌种间相互协同作用能有效提高饲料利用率和养殖动物机体免疫能力，减少腹泻机率，减少医疗用药次数，降低动物饲养成本。

附图说明

图1是本发明实施例四提供的对照组和试验组的日均采食量和日均增重量对照图；

图2是本发明实施例四提供的对照组和试验组的料肉比和腹泻率对照图。

图1和图2中，1、对照组，2、试验1组，3、试验2组。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：

本发明实施例一提供一种复合型高活性饲用益生菌添加剂及其制备方法。制备过程如下：

步骤1，斜面活化：将纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌在无菌条件下分别接种到固体斜面培养基上；纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在37℃培养1天，植物乳杆菌在35℃条件下培养1天；

步骤2，一级种子培养：各取步骤1中培养的斜面菌种200ml在无菌条件下分别接种至灭菌后的1l三角瓶培养基中，纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在37℃，摇床转速160rpm条件下培养1天，植物乳杆菌在35℃条件下静置培养1天；菌种液体培养od600值在3.0～5.0时停止培养，得到一级种子；

步骤3，二级种子培养：在100l发酵罐中配制液体种子培养基，121℃灭菌20min，灭菌后降温至20～35℃，按液体种子培养基的体积比为0.5％分别接种步骤2得到的一级种子，纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在37℃下发酵，搅拌速度设为100rpm，通气量为1：1(vvm)，培养1～3天至0d600值在4.0～6.0；植物乳杆菌在35℃条件下培养1天，搅拌设为间隔搅拌，间隔时间为2h，搅拌时间为30min，搅拌速度设为30rpm，粪肠球菌在36℃下静置培养1天，得到二级种子；

步骤4，发酵培养：在3000l发酵罐中配制液体发酵培养基，121℃灭菌20min，灭菌后降温至20～35℃，按液体种子培养基的体积比为3％分别接种步骤3得到的二级种子，进行高密度发酵培养；其中纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在37℃下发酵，搅拌速度设为50rpm，通气量为1：1(vvm)，培养2天；植物乳杆菌在35℃条件下培养2天，搅拌设为间隔搅拌，间隔时间为2h，搅拌时间为30min，搅拌速度设为30rpm，粪肠球菌在36℃静置培养2天，得到各个菌种的发酵液；

步骤5，制备各个菌种的喷干粉：将步骤4中得到的各个菌种发酵液通过蝶式离心机分别进行离心分离得到菌体，发酵液进料速度为1.0m³/h，排渣周期为600s，按重量比例加入5％的糊精进行喷雾干燥得到喷干粉，喷雾时进风温度设为180℃，出风温度控制在63～65℃；

步骤6：检测有效活菌数

步骤7，混合：将步骤6中检测合格的各个菌种的喷干粉及酵母菌粉按比例投至三维混合机中混合15min得到复合型高活性饲用益生菌添加剂。

得到的复合型高活性饲用益生菌添加剂含有以下重量份成分：纳豆芽孢杆菌粉10份，地衣芽孢杆菌粉20份，凝结芽孢杆菌粉20份，粪肠球菌粉15份，植物乳杆菌粉15份，酵母菌粉20份及葡萄糖8份。每克复合型高活性饲用益生菌添加剂含有的活菌数为：纳豆芽孢杆菌2.0*10¹⁰cfu/g、地衣芽孢杆菌2.0*10¹⁰cfu/g、凝结芽孢杆菌2.0*10¹⁰cfu/g、粪肠球菌1.0*10¹⁰cfu/g、植物乳杆菌1.0*10¹⁰cfu/g、酵母菌1.0*10¹⁰cfu/g。

实施例二：

本发明实施例二提供一种复合型高活性饲用益生菌添加剂及其制备方法。制备过程如下：

步骤1，斜面活化：将纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌在无菌条件下分别接种到固体斜面培养基上；纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在25℃培养2天，植物乳杆菌在45℃条件下培养1天；

步骤2，一级种子培养：各取步骤1中培养的斜面菌种200ml在无菌条件下分别接种至灭菌后的1l三角瓶培养基中，纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，植物乳杆菌在45℃条件下静置培养1天；菌种液体培养od600值在3.0～5.0时停止培养，得到一级种子；

步骤3，二级种子培养：在100l发酵罐中配制液体种子培养基，121℃灭菌20min，灭菌后降温至20～35℃，按液体种子培养基的体积比为1.0％分别接种步骤2得到的一级种子，纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在25℃下发酵，搅拌速度设为150rpm，通气量为1：0.5(vvm)，培养1～3天至0d600值在4.0～6.0；植物乳杆菌在45℃条件下培养1天，搅拌设为间隔搅拌，间隔时间为2h，搅拌时间为30min，搅拌速度设为10rpm，粪肠球菌在25℃下静置培养2天，得到二级种子；

步骤4，发酵培养：在3000l发酵罐中配制液体发酵培养基，121℃灭菌20min，灭菌后降温至20～35℃，按液体种子培养基的体积比为2％分别接种步骤3得到的二级种子，进行高密度发酵培养；其中纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在25℃下发酵，搅拌速度设为200rpm，通气量为1：0.5(vvm)，培养2天；植物乳杆菌在45℃条件下培养1天，搅拌设为间隔搅拌，间隔时间为2h，搅拌时间为30min，搅拌速度设为50rpm，粪肠球菌在25℃静置培养2天，得到各个菌种的发酵液；

步骤5，制备各个菌种的喷干粉：将步骤4中得到的各个菌种发酵液通过蝶式离心机分别进行离心分离得到菌体，发酵液进料速度为1.0m³/h，排渣周期为600s，按重量比例加入10％的豆粕粉进行喷雾干燥得到喷干粉，喷雾时进风温度设为180℃，出风温度控制在63～65℃；

步骤6：检测有效活菌数

步骤7，混合：将步骤6中检测合格的各个菌种的喷干粉及酵母菌粉按比例投至三维混合机中混合20min得到复合型高活性饲用益生菌添加剂。

得到的复合型高活性饲用益生菌添加剂含有以下重量份成分：纳豆芽孢杆菌粉20份，地衣芽孢杆菌粉10份，凝结芽孢杆菌粉12份，粪肠球菌粉18份，植物乳杆菌粉14份，酵母菌粉15份及葡萄糖5份。每克复合型高活性饲用益生菌添加剂含有的活菌数为：纳豆芽孢杆菌3.0*10¹⁰cfu/g、地衣芽孢杆菌2.5*10¹⁰cfu/g、凝结芽孢杆菌3.0*10¹⁰cfu/g、粪肠球菌2.0*10¹⁰cfu/g、植物乳杆菌1.5*10¹⁰cfu/g、酵母菌1.0*10¹⁰cfu/g。

实施例三：

本发明实施例三提供一种复合型高活性饲用益生菌添加剂及其制备方法。制备过程如下：

步骤1，斜面活化：将纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌在无菌条件下分别接种到固体斜面培养基上；纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在30℃培养3天，植物乳杆菌在20℃条件下培养4天；

步骤2，一级种子培养：各取步骤1中培养的斜面菌种200ml在无菌条件下分别接种至灭菌后的1l三角瓶培养基中，纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在30℃，摇床转速150rpm条件下培养2天，植物乳杆菌在20℃条件下静置培养3天；菌种液体培养od600值在3.0～5.0时停止培养，得到一级种子；

步骤3，二级种子培养：在100l发酵罐中配制液体种子培养基，121℃灭菌20min，灭菌后降温至20～35℃，按液体种子培养基的体积比为1.5％分别接种步骤2得到的一级种子，纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在30℃下发酵，搅拌速度设为150rpm，通气量为1：1.5(vvm)，培养1～3天至0d600值在4.0～6.0；植物乳杆菌在20℃条件下培养3天，搅拌设为间隔搅拌，间隔时间为2h，搅拌时间为30min，搅拌速度设为50rpm，粪肠球菌在30℃下静置培养2天，得到二级种子；

步骤4，发酵培养：在3000l发酵罐中配制液体发酵培养基，121℃灭菌20min，灭菌后降温至20～35℃，按液体种子培养基的体积比为5％分别接种步骤3得到的二级种子，进行高密度发酵培养；其中纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌在30℃下发酵，搅拌速度设为150rpm，通气量为1：1.5(vvm)，培养2天；植物乳杆菌在20℃条件下培养3天，搅拌设为间隔搅拌，间隔时间为2h，搅拌时间为30min，搅拌速度设为30rpm，粪肠球菌在30℃静置培养2天，得到各个菌种的发酵液；

步骤5，制备各个菌种的喷干粉：将步骤4中得到的各个菌种发酵液通过蝶式离心机分别进行离心分离得到菌体，发酵液进料速度为1.0m³/h，排渣周期为600s，按重量比例加入1％的葡萄糖进行喷雾干燥得到喷干粉，喷雾时进风温度设为180℃，出风温度控制在63～65℃；

步骤6：检测有效活菌数

步骤7，混合：将步骤6中检测合格的各个菌种的喷干粉及酵母菌粉按比例投至三维混合机中混合10min得到复合型高活性饲用益生菌添加剂。

得到的复合型高活性饲用益生菌添加剂含有以下重量份成分：纳豆芽孢杆菌粉30份，地衣芽孢杆菌粉30份，凝结芽孢杆菌粉12份，粪肠球菌粉12份，植物乳杆菌粉20份，酵母菌粉10份及糊精2份。每克复合型高活性饲用益生菌添加剂含有的活菌数为：纳豆芽孢杆菌4.0*10¹⁰cfu/g、地衣芽孢杆菌4.0*10¹⁰cfu/g、凝结芽孢杆菌2.5*10¹⁰cfu/g、粪肠球菌1.5*10¹⁰cfu/g、植物乳杆菌1.0*10¹⁰cfu/g、酵母菌1.5*10¹⁰cfu/g。

实施例四：

本发明实施例四提供一种验证本发明实施例一制备的复合型高活性饲用益生菌添加剂在提高动物机体免疫能力，减少腹泻率，降低饲喂成本上的方法。

以实施例一中的复合型高活性饲用益生菌添加剂作为试验原料，进行饲喂试验。

1.1试验动物分组

试验选用80～90日龄，体重在30kg左右断奶仔猪60头。所有试验猪按照体重接近原则及猪栏方向分为对照组和试验组，对照组20头；试验组40头，分为2栏(试验1组与试验2组)，每栏20头。

1.2饲喂日粮组成

对照组日粮：由养猪场提供的自用日常饲料；

试验1组日粮：在对照组日粮基础上按质量比例0.2％添加复合微生物饲料添加剂，使用猪场自有混料机搅拌混合均匀。

试验2组日粮：在对照组日粮基础上按质量比例0.4％添加复合微生物饲料添加剂，使用猪场自有混料机搅拌混合均匀。

1.3饲养管理

试验猪均由专人饲喂，自由采食，饮水、免疫、消毒等饲养管理均按常规操作进行。若实验期间有猪发生病患，将病患猪隔离治疗，若3日内治疗无好转，从试验组剔除。试验组和对照组在同等条件下饲喂30天。

1.4记录指标及方法

1.4.1增重与生长发育：试验开始及结束时早晨空腹称重，计算全群均重、日均增重；

1.4.2采食量及阶段饲料报酬：每天记录每组喂料量，发生淘汰和死亡时，称量淘汰和死亡仔猪的体重及耗料量以计算期间采食量；统计全群总采食量，计算平均日均采食量、料肉比；

1.4.3日常观察、记录和处理：每天观察记录仔猪的腹泻、采食、粪便、发病等情况，统计腹泻率，发现病猪及时治疗，对日常观察情况进行记录。

1.5试验结果

表1复合型高活性饲用益生菌添加剂的饲喂试验结果

对照组和试验组的日均采食量和日均增重量对照图如图1所示，对照组和试验组的料肉比和腹泻率对照图如图2所示。图1中，斜纹填充柱表示日均采食量(g/头)，方格填充柱表示日均增重量；图2中，斜纹填充柱表示料肉比，折线表示腹泻率。由表1可以看出，添加0.2％和0.4％的复合微生物饲料添加剂，其料肉比相比于对照组，分别降低了10.95％和15.9％，腹泻率分别降至15.78％和10.52％，可以显著降低仔猪的料肉比和腹泻率，日均增重和日均采食量均有所增加。说明本发明中的复合型高活性饲用益生菌添加剂具有增强仔猪机体免疫力，降低仔猪腹泻率和料肉比的功效，可以降低仔猪的饲喂成本。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。