一种降解蛋白质的方法和制备抗氧化肽的方法与流程

本发明涉及蛋白
技术领域：
，具体涉及一种降解蛋白质的方法和制备抗氧化肽的方法。
背景技术：
：生物活性肽是指特定的、在父辈蛋白质序列中不活动的多肽序列，经消化、酶解或发酵等处理后具有特定功能特的多肽从蛋白质中释放出来，获得具有生理作用的肽类化合物。生物活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有抗氧化、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等功能，因此，从生物体中获得的多肽受到越来越多的关注。鸡蛋作为优质蛋白质来源为人体提供最基本的营养物质，被认为是世界上最完美的食物之一。中国是世界上鸡蛋消费量最高的国家，蛋清中含有多种功能蛋白组分，包括蛋清蛋白、卵白蛋白、卵黏蛋白、卵转铁蛋白等。除了基本的营养价值外，鸡蛋中的蛋白质及其降解产物具有多种生理活性，包括抗氧化、降血压、免疫调节、抑菌以及抗癌等，也已经引起了广泛的关注。目前利用蛋白质获得生物活性肽的常用方法为酶水解法，但酶水解法制备生物活性肽的工艺过程较为复杂、成本高、效率低。为节约生产成本、提高酶解效率，一般需要通过酸/碱处理、热处理、超声波等预处理手段改变蛋白结构，使蛋白肽链舒展、空间结构松散，这进一步增加了工艺的复杂性。介质阻挡放电等离子体技术作为一种新型的降解技术，在化学合成、微电子、超导技术等领域中已呈现出巨大的发展潜力和应用前景，但未见被应用于食品蛋白质精深加工的相关报道。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种降解蛋白质的方法和制备抗氧化肽的方法，利用介质阻挡放电等离子体技术实现蛋白质高效降解，并用于制备抗氧化肽，全过程无任何添加，具有工艺简单、绿色环保、效率高的特点。为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种降解蛋白质的方法，所述方法包括下列步骤：将所述蛋白质配制成溶液或悬浮液后，在工作气体中进行介质阻挡放电等离子体处理，得到蛋白质降解液。优选地，所述蛋白质为鸡蛋清蛋白。优选地，所述蛋白质配制成溶液或悬浮液的溶剂为去离子水或ph＝7的磷酸缓冲液，所述溶液或悬浮液中蛋白质浓度为1-100mg/ml。优选地，所述介质阻挡放电等离子体处理的条件包括：所述溶液或悬浮液位于由石英制成的容器中，使用石英片作为绝缘介质，电压为10-50kv、频率为0.5-50khz、处理时间为0.5-8min。优选地，所述容器为石英皿，所述石英片的厚度为0.5-2mm。优选地，所述工作气体为空气、氮气、氩气或氦气中的一种或多种。本发明第二方面提供一种制备抗氧化肽的方法，该方法包括利用上述的方法制得蛋白质降解液，将所述蛋白质降解液经离心得到上清液，将所述上清液进行旋转蒸发、干燥。优选地，所述离心的条件包括：温度为8-12℃、转速为8000-12000r/min，所述旋转蒸发的过程包括将所述上清液在温度为35-40℃的条件下进行真空旋转蒸发，在蒸发量达到所述上清液初始体积的40-60％时停止；所述干燥包括将经所述旋转蒸发的上清液在温度为-35—-25℃的条件下预冷后进行冷冻干燥。通过上述技术方案，本发明的有益效果为：1、本发明中利用介质阻挡放电等离子体技术对蛋白质进行降解，处理过程中等离子体化产生的高能粒子的撞击、内部水分的电离、辐射、能量传递和应力变化等多种效应导致蛋白质的肽键断裂，实现蛋白质降解成多肽，相比于传统酶水解的方法，具有时间短、成本低、效率高的特点。2、本发明中将介质阻挡放电等离子体处理降解蛋白质的方法应用于制备抗氧化肽，蛋白质降解后的分离、干燥工艺过程简单，操作方便，制得的抗氧化肽具有优良的dpph自由基清除能力和fe3+还原能力。3、本发明中利用介质阻挡放电等离子体技术对蛋白质进行降解，能耗低、对蛋白质直接处理，适合高附加值蛋白产品的开发，全过程无任何添加，具有绿色、环保、低能耗的特点。附图说明图1是本发明中介质阻挡放电等离子体处理采用的设备结构图。附图标记说明1高压电源2上电极3下电极4绝缘介质5样品容器具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。第一方面，本发明提供了一种降解蛋白质的方法，所述方法包括下列步骤：将所述蛋白质配制成溶液或悬浮液后，在工作气体中进行介质阻挡放电等离子体处理，得到蛋白质降解液。优选地，所述蛋白质为鸡蛋清蛋白。本发明中，溶剂可以为去离子水或者任意一种ph为7的缓冲液，优选地，所述蛋白质配制成溶液或悬浮液的溶剂为去离子水或ph＝7的磷酸缓冲液。优选地，所述溶液或悬浮液中蛋白质浓度为1-100mg/ml，更优选地，所述溶液或悬浮液中蛋白质浓度为10-40mg/ml，具体可以为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml或者上述两个值之间的任意值。优选地，所述介质阻挡放电等离子体处理的条件包括：所述溶液或悬浮液位于由石英制成的容器中，使用石英片作为绝缘介质，电压为10-50kv、频率为0.5-50khz、处理时间为0.5-8min。更优选地，所述介质阻挡放电等离子体处理的电压为30-50kv、频率为10-20khz，电压具体可以为30kv、35kv、40kv、45kv、50kv或者上述两个值之间的任意值，频率具体可以为10khz、12khz、14khz、16khz、18khz、20khz或者上述两个值之间的任意值。优选地，所述容器为石英皿，所述石英片的厚度为0.5-2mm。优选地，所述工作气体为空气、氮气、氩气或氦气中的一种或多种。本发明中，介质阻挡放电等离子体处理采用的设备结构如图1所示，包括高压电源1、反应釜和样品容器5，其中高压电源1能够实现电压1-100kv、频率0.1-20khz；反应釜由上电极2(φ50mm)、下电极3(φ50mm、接地)和绝缘介质4(φ102mm的石英片)构成，上电极2和下电极3之间的间距可在0-10mm的范围内进行调节；样品容器5为石英皿(φ50mm×5mm)。介质阻挡放电等离子体处理的过程为：将一定量的样品置于样品容器5中，上电极2和下电极3之间的间距调整为8mm，绝缘介质4固定于上电极2上，样品容器5置于绝缘介质4和下电极3之间，在工作气体中高压电源1通电后进行蛋白质降解。本发明第二方面提供一种制备抗氧化肽的方法，该方法包括利用上述的方法制得蛋白质降解液，将所述蛋白质降解液经离心得到上清液，将所述上清液进行旋转蒸发、干燥。优选地，所述离心的条件包括：温度为8-12℃、转速为8000-12000r/min，所述旋转蒸发的过程包括将所述上清液在温度为35-40℃的条件下进行真空旋转蒸发，在蒸发量达到所述上清液初始体积的40-60％时停止；所述干燥包括将经所述旋转蒸发的上清液在温度为-35—-25℃的条件下预冷后进行冷冻干燥。离心的温度具体可以为8℃、9℃、10℃、11℃、12℃或者上述两个值之间的任意值；离心的转速具体可以为8000r/min、9000r/min、10000r/min、11000r/min、12000r/min或者上述两个值之间的任意值；真空旋转蒸发的温度具体可以为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或者上述两个值之间的任意值；预冷的温度具体可以为-35℃、-33℃、-31℃、-29℃、-27℃、-25℃或者上述两个值之间的任意值。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，鸡蛋清蛋白购于上海研生生化试剂有限公司、型号为9006-59-1，其余原料为市售品。样品dpph自由基清除率的测定：分别取不同样品组的样品溶液0.5ml于10ml具塞试管(以0.5ml甲醇为对照组)，样品组和对照组分别加入浓度为100μmol/l的dpph工作液3ml，剧烈摇动后室温暗处放置30min；以甲醇为空白液调零，记录517nm处对照组和样品组的吸光值ai、aj，经下列公示计算得到样品dpph自由基清除率。样品fe3+还原能力测定：取0.3ml样品溶液与2.7ml预热至37℃的frap工作液混合，在37℃条件下避光水浴10min，于593nm处测吸光值；以feso4的标准溶液代替样品绘制标准曲线；样品最终的fe3+还原能力以feso4的当量浓度表示，单位为mmol/l。实施例1(1)将鸡蛋清蛋白分散于去离子水中，配制成鸡蛋清蛋白浓度为20mg/ml的鸡蛋清蛋白溶液；(2)取20ml步骤(1)制得的鸡蛋清蛋白溶液于石英皿中，将石英皿置于两电极间，调整上电极和下电极间的间距为8mm，以厚度为0.5mm的石英片为绝缘介质固定于上电极，以空气作为工作气体，在电压为30kv、频率为10khz条件下处理4min，得到蛋白质降解液；(3)将步骤(2)制得的蛋白质降解液置于离心管中，在温度为8℃、转速为8000r/min的条件下离心5min，获得上清液；(4)将步骤(3)制得的上清液在温度为35℃条件下进行真空旋转蒸发，在蒸发量达到上清液初始体积的40％时停止，然后在-30℃下预冻3h，冷冻干燥获得抗氧化肽。实施例2(1)将鸡蛋清蛋白分散于ph＝7的磷酸缓冲液中，配制成鸡蛋清蛋白浓度为10mg/ml的鸡蛋清蛋白溶液；(2)取15ml步骤(1)制得的鸡蛋清蛋白溶液于石英皿中，将石英皿置于两电极间，调整上电极和下电极间的间距为8mm，以厚度为1mm的石英片为绝缘介质固定于上电极，以氮气作为工作气体，在电压为40kv，频率为20khz条件下处理2min，得到蛋白质降解液；(3)将步骤(2)制得的蛋白质降解液置于离心管中，在温度为10℃、转速为10000r/min的条件下离心5min，获得上清液；(4)将步骤(3)制得的上清液在温度为37℃条件下进行真空旋转蒸发，在蒸发量达到上清液初始体积的50％时停止，然后在-35℃下预冻3h，冷冻干燥获得抗氧化肽。实施例3(1)将鸡蛋清蛋白分散于去离子水中，配制成鸡蛋清蛋白浓度为40mg/ml的鸡蛋清蛋白溶液；(2)取10ml步骤(1)制得的鸡蛋清蛋白溶液于石英皿中，将石英皿置于两电极间，调整上电极和下电极间的间距为8mm，以厚度为2mm的石英片为绝缘介质固定于上电极，以氩气作为工作气体，在电压为50kv，频率为13khz条件下处理8min，得到蛋白质降解液；(3)将步骤(2)制得的蛋白质降解液置于离心管中，在温度为12℃、转速为12000r/min的条件下离心5min，获得上清液；(4)将步骤(3)制得的上清液在温度为40℃条件下进行真空旋转蒸发，在蒸发量达到上清液初始体积的60％时停止，然后在-25℃下预冻3h，冷冻干燥获得抗氧化肽。实施例4(1)将鸡蛋清蛋白分散于ph＝7的磷酸缓冲液中，配制成鸡蛋清蛋白浓度为1mg/ml的鸡蛋清蛋白溶液；(2)取30ml步骤(1)制得的鸡蛋清蛋白溶液于石英皿中，将石英皿置于两电极间，调整上电极和下电极间的间距为8mm，以厚度为1.5mm的石英片为绝缘介质固定于上电极，以氦气作为工作气体，在电压为10kv，频率为0.5khz条件下处理6min，得到蛋白质降解液；(3)将步骤(2)制得的蛋白质降解液置于离心管中，在温度为15℃、转速为10000r/min的条件下离心5min，获得上清液；(4)将步骤(3)制得的上清液在温度为37℃条件下进行真空旋转蒸发，在蒸发量达到上清液初始体积的50％时停止，然后在-35℃下预冻3h，冷冻干燥获得抗氧化肽。实施例5(1)将鸡蛋清蛋白分散于去离子水中，配制成鸡蛋清蛋白浓度为100mg/ml的鸡蛋清蛋白溶液；(2)取5ml步骤(1)制得的鸡蛋清蛋白溶液于石英皿中，将石英皿置于两电极间，调整上电极和下电极间的间距为8mm，以厚度为3mm的石英片为绝缘介质固定于上电极，以空气作为工作气体，在电压为50kv、频率为50khz条件下处理0.5min，得到蛋白质降解液；(3)将步骤(2)制得的蛋白质降解液置于离心管中，在温度为10℃、转速为8000r/min的条件下离心5min，获得上清液；(4)将步骤(3)制得的上清液在温度为35℃条件下进行真空旋转蒸发，在蒸发量达到上清液初始体积的40％时停止，然后在-30℃下预冻3h，冷冻干燥获得抗氧化肽。对比例1(1)取4g鸡蛋清蛋白加水配置成质量浓度为1％的鸡蛋清蛋白悬浊液，85℃保持10min使鸡蛋清蛋白变性，冷却至室温后调节ph至11.0，按照每克鸡蛋清蛋白6000u的酶量添加碱性蛋白酶，50℃，水解时间1h；(2)迅速将步骤(1)中的酶解液ph值调节至2.5，按照每克鸡蛋清蛋白10000u的酶量添加胃蛋白酶，35℃水解6h后95℃保持15min灭酶，冷却至室温后调ph值至5.5，4000r/min离心15min收集上清液；(3)将步骤(2)所得酶解液用截留分子量为3kda的超滤膜在0.1mpa压力下进行超滤，收集滤过液，真空浓缩后冷冻干燥得蛋清蛋白抗氧化肽粗品；超滤操作前超滤膜要先后用无水乙醇、ph值为2的酸液、ph值为11碱液和去离子水各循环清洗20min；(4)取步骤(3)中的鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品，配制成10mg/ml的多肽溶液50ml，保持ph为5.5，加入20g经过清洗及平衡的da201-c大孔吸附树脂，25℃条件下静态吸附2h，先用体积分数为10％的乙醇洗涤后，再用体积分数为75％乙醇洗脱，洗脱时间0.5h，收集、浓缩并冷冻干燥75％的乙醇洗脱组分，即可获得抗氧化肽。分别将实施例1-实施例5和对比例1得到的抗氧化肽，用去离子水配制成浓度为0.5mg/ml的抗氧化肽溶液，检测dpph自由基清除率和fe3+还原能力，将抗氧化肽溶液的dpph自由基清除率与浓度相同的鸡蛋清蛋白溶液的dpph自由基清除率进行比较，得到抗氧化肽的dpph自由基清除能力增长率，测定的结果见表1。表1编号dpph自由基清除能力增长率(％)fe3+还原能力(mmol/l)实施例166.70.93实施例267.50.92实施例361.50.76实施例460.30.89实施例553.10.73对比例150.20.65通过表1的结果可以看出，采用本发明降解蛋白质方法的实施例1-实施例5制得的抗氧化肽，与对比例1相比，dpph自由基清除能力的增长率明显更高，并且具有明显更好的fe3+还原能力。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。当前第1页12