一种真空循环臭氧的高效灭菌方法与流程

【技术领域】

本发明涉及一种臭氧灭菌方法，具体涉及一种真空循环臭氧的高效灭菌方法。

背景技术：

很多物质不一定适用高温灭菌或辐射照射灭菌，往往只能用常温灭菌。其中气体灭菌法，如臭氧或环氧乙烷灭菌法是选择项目之一。但一般气体灭菌，环氧乙烷有毒性，已知为人类致癌物，易造成中枢神经毒性及生殖伤害，往往不适用于食品灭菌，此时臭氧是优良选择。但是臭氧通常仅适用于液体中的灭菌，例如浸泡在水中的水果杀菌。对于无法泡在水中的固体或是怕水的粉末状物质，例如大蒜片或大蒜粉，即使在一般条件下对检品吹臭氧，也只能做表面灭菌，对于有微小孔隙或堆积的粉末或堆积的固形物，普通的臭氧吹气灭菌，往往局限于表浅灭菌，效果很差或无效。尤其是一般导入灭菌的臭氧气体平均臭氧浓偏低，仅有约0.2～5.0ppm其灭菌效率一般是98％左右，灭菌效率的对数下降值(logreductionvalue)仅有2左右，这种灭菌效率尚无法满足一般食品的微生物洁净标准(低于100cfu/g)(参考文献：郭奕，李春娥，李光达.中药原生药粉的灭菌方法及其设备选型.装备应用与研究.2016，29(491)：9-16)。

目前有改良的真空灭菌法，将产品放在真空箱的架子上，抽真空之后再导入臭氧，可以大大的降低产品生菌数(参考文献：郭奕，李春娥，李光达.中药原生药粉的灭菌方法及其设备选型.装备应用与研究.2016，29(491)：9-16、中国专利：一种臭氧杀菌干燥机；cn109505106a、中国专利：三氧低温灭菌器的多级抽真空装置及方法；cn103520748a)。可惜这个方法对于片状、颗粒、粉末等多层堆积的产品，例如大蒜粉(约0.5mm粒径)或大蒜片(约l×w×d＝15×10×1mm)成堆的物品，往往因为颗粒之间的堆积障蔽，或微小到微毫米的小的孔隙，臭氧很难到达内层或深入孔隙，以至于无法达到有效的干燥灭菌。例如郭奕(参考文献：郭奕，李春娥，李光达.中药原生药粉的灭菌方法及其设备选型.装备应用与研究.2016，29(491)：9-16)的研究，将中药粉沫悬浮于臭氧中灭菌，其灭菌效率最高仅有98％，其灭菌对数下降率还不到2。韩国专利(韩国专利：kr101408268b1)有用滚筒状的螺杆装置用于臭氧灭菌谷类，可以改善颗粒之间的堆积障蔽，但没说灭菌效果如何。在现实上，似乎尚未有人将真空臭氧灭菌和滚动搅拌装置并用，以解决检品堆积造成的灭菌障壁。

有关细菌对于臭氧灭菌的感受性，根据dufresne(参考文献：s.dufresne,ahewitt,srobitaille.ozonesterilization:anotheroptionforhealthcareinthe21stcentury.amjinfectcontrol.2004，32(3)：e26-e27)的研究可知，一般营养体细菌>真菌>杆菌>细菌孢子.其中以细菌孢子臭氧感受性最差，最难被臭氧灭菌，目前缺乏这一方面的臭氧灭菌探讨。且由setlow(参考文献：psetlow.germinationofsporesofbacillusspecies:whatweknowanddonotknow.jbacteriol.2014，196(7)：1297–1305.)对内孢子发芽的研究，似乎显示臭氧灭菌效率和菌体的含水率有关。另一方面sharma(参考文献：manjusharma，jamesb.hudson.ozonegasisaneffectiveandpraticalantibacterialagent.amjinfectcontrol.2008，36：559-563)的研究显示臭氧灭菌时若能喷水雾使其湿度达到90％或99％以上，使用25ppm的臭氧，则灭菌效果更加可以减少3logcfu以上的细菌。shapiro(美国专利：sterilizingandpackagingdevice；us3719017)和karlson(美国专利：ozonesterilizer；us5069880)的报告，都可见臭氧和水雾混合的灭菌法，bedard(美国专利：ozonesterilizationmethod；us7582257b2)更加上了多次臭氧灭菌的步骤，而且述明臭氧灭菌的灭菌温度约在20～25℃相对湿度要在90～95％最好，并将灭菌桶真空低压抽气(0.5mmhg)以降低水的沸点使臭氧灭菌桶的水蒸气湿度达到90～100％。benard也使用纯氧做为臭氧产生器的臭氧源可以将臭氧浓度提高到85ppm，将物品放在容器中(packingcontainer)或是袋子(pounch)进行臭氧灭菌。但是上述的臭氧灭菌法虽然有专利，但并未标述其灭菌数值，其真实灭菌效果如何，并不清楚？

有关灭菌检体的堆积造成臭氧无法深入检体核心进行深层灭菌问题，王茂林(中国专利：一种臭氧杀菌干燥机；cn109505106a)，高光勇(中国专利：三氧低温灭菌器的多级抽真空装置及方法；cn103520748a)和苏海伟(中国专利：真空臭氧灭菌柜；cn202740445u)有提到用真空抽气在导入臭氧的解决方案，但对于大量颗粒或片状堆积等物品，甚至阻碍臭氧流通和阻碍臭氧进入检品重迭面的问题，尚无答案。为了解决检品堆积问题，上文的韩国专利利用镙杆搅拌被灭菌谷物以解决检品堆栈的问题，但是并未将被灭菌物先抽真空在导入臭氧，以至于该方法仍不适用于多孔隙物品的灭菌，例如大蒜粉或大蒜片。伍振峰(中国专利：一种多功能倒锥形灭菌装备及灭菌工艺；cn104906607b)有并用真空桶和搅拌但却是用115℃蒸气灭菌，往往不适用于怕水或干粉物质灭菌，伍振峰的设备在常温臭氧灭菌时，无述明真空抽气步骤，其抽真空的效益是干燥检品，并非是消除检品孔隙的臭氧灭菌障壁，童天发(中国专利：一种中药饮片及颗粒电解臭氧灭菌机；cn106552274a)的灭菌机都有着类似问题。

由以上专利和文献回顾，我们可以发现几个现象，首先，被灭菌检体尚有很多未活化的孢子或菌体，不易用臭氧灭菌。其次，即使纯氧制造的高臭氧浓度灭效率增高但仍不足以减低logcfu至食品级理想状况。再次，堆积的小颗粒或片状物质，会阻碍臭氧跑到堆积物的深层核心去灭菌。并且，臭氧无法转弯进入小孔隙灭菌。在微观的小孔隙世界由于有很多凡德瓦力(vanderforce)吸附的表面空气或杂质，往往会阻碍臭氧的灭菌成效。一般臭氧灭菌方法，目前尚无报告探讨将样品的显微隙缝问题列入灭菌研发范围。如何解决臭氧灭菌法的上述诸多问题，变成一个很重要的课题。

我们发现，造成臭氧灭菌效率低下，除了臭氧无法深入缝隙灭菌，尚有其他原因。因为最终灭菌一般医药的无菌保证为0.999999，(logpns)非无菌概率＝1－0.999999＝10^-6，一般食品的微生物洁净标准是100cfu/g，则一般食品的灭菌的对数值下降值约需要到4～5左右，才能达到食品的洁净度要求，这些要求似乎都是过往研究或报告所不能达到的，例如郭奕和bedard的研究。

另外，臭氧灭菌如何解决内孢子的灭菌问题，一直未被研究。并且，现有技术导入臭氧的最高浓度约是85ppm，这个浓度的臭氧灭菌效率通常低于4logcfu(bedard：美国专利：ozonesterilizationmethod；us7582257b2)。然而要达到有效灭菌效率需要减少到6logcfu，要达到食品级的要求必须低于100cfu/g，往往需要4～6logcfu的灭菌效率，需要更高效的臭氧灭菌才做得到，而现有技术无法解决这些技术问题。

技术实现要素：

本发明要解决的上述技术问题的方案，在于提供一种真空循环臭氧的高效灭菌方法，抽真空消除检品孔隙内气体或杂质遮蔽的现象，旋转搅拌检体，使堆栈检体的每一面均会暴露到臭氧，并让循环制造超高浓度的臭氧可进入检品每一面的微小孔隙内进行灭菌，灭菌效率更高，灭菌效果更好，本法适用于片状、颗粒、粉末等多层堆积的检品灭菌。

本发明是这样实现的；

一种真空循环臭氧的高效灭菌方法，所述方法步骤如下：

步骤1、孢子萌芽:将检品放在高湿温环境预处理，使检品内部的部分沉睡细菌激活或孢子发芽；

步骤2、抽真空消除孔隙内空气和湿气：将干燥检品倒入灭菌滚桶内，密闭加热至35-56℃，灭菌滚桶缓慢滚动搅拌一段时间后，一边继续搅拌一边抽真空，直到灭菌滚桶内温度降至20～25℃；

步骤3、导入微湿臭氧:打开纯氧气进入臭氧制造机制造臭氧，并将臭氧气体加湿，使湿度达到50±5％rh；微湿的臭氧气体经过加压泵加压至1.1-5atm后，导入控温缓冲桶冷却到25±2℃并冷凝多余水气，使臭氧的湿度维持在90～99％rh；

步骤4、循环灭菌：将饱含水气的高压臭氧从灭菌滚桶一侧持续缓慢灌入，旋转灭菌，并从另一侧以低于进气的速率排出灭菌后的臭氧气体，维持灭菌滚桶压力在1.1-5atm，并让排出的臭氧气体经过冷凝干燥之后湿度低于30％rh，再进入臭氧制造机，循环制造更高浓度的臭氧气体；且从臭氧制造机出来的高浓度臭氧重复步骤3的动作后，再次进入灭菌滚桶，循环灭菌15-120分钟；

步骤5、循环灭菌结束，采取样品做总生菌数检测。

维持所述臭氧气体每3-10分钟循环一次。

进一步地，所述步骤1中高湿温环境的条件为35±5℃，90±5％rh。

进一步地，所述步骤2中通入臭氧后再密闭加热。

进一步地，所述步骤3中的微湿的臭氧气体经过加压泵加压至2.0±0.2atm；所述步骤4中的灭菌滚桶压力维持在2.0±0.2atm。

进一步地，所述步骤3和4之间还有步骤3.1，

所述步骤3.1、预灭菌；将饱含水气的高压臭氧缓慢灌满灭菌滚桶内，旋转灭菌3-5分钟之后在灭菌滚桶的另一侧以低于进气的速率排出灭菌后的臭氧气体，维持灭菌滚桶压力在1.1-5atm；并让排出的臭氧气体经过冷凝干燥之后湿度低于30％rh，再进入臭氧制造机，循环制造更高浓度的臭氧气体。

进一步地，所述灭菌滚桶的转速为0.1～10转/分钟。

进一步地，步骤6、当检测不合格时，再次导入臭氧重复步骤4做第2次循环灭菌。

本发明具有如下优点：

首先通过加湿复活沉睡细菌或孢子发芽预处理，使细菌或孢子表面含有水分，增加了臭氧灭菌效率；其次，将检品置于旋转的灭菌滚桶内加热至37～56℃，再抽真空，高温更易于完全排除吸附在检品微小孔隙内的空气或杂气，滚动搅拌的目的是让检品的每一面都能接触到外界，使吸附在检品表面的气体或杂质被抽除，以利后续臭氧能深入微细的孔隙，能更完全的接触到检体的生菌，达到全面灭菌的效果。其次，将臭氧进行加湿加压后，导入灭菌桶对检品进行灭菌，加压后的臭氧加强了对微细空隙的渗透率，达到孔隙灭菌的目的，而对臭氧加湿，更提高了灭菌效率。最后，循环臭氧气体并重复制造超高浓度的臭氧(臭氧浓度到300ppm以上)，最大程度的提高臭氧的灭菌效率，此法可以使得检品生菌数减低到低于100cfu/g的要求。

本发明的臭氧可进入检品各层面，并深入微小孔隙内进行灭菌，灭菌效率更高，滅菌效果更好，适用于片状、颗粒、粉末等多层堆积的检品灭菌。

【附图说明】

下面参照附图并结合实施例，对本发明作进一步的说明。

图1为本发明所基于的真空循环臭氧的高效灭菌系统示意图。

【具体实施方式】

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例

一、参阅图1，本发明是基于真空循环臭氧的高效灭菌系统实现的,所述高效灭菌系统包括依次连接的氧气桶1、臭氧制造机2、加湿器3、加压泵4、控温缓冲桶5、灭菌滚桶6、真空泵7以及除湿干燥器8，所述除湿干燥器8再与臭氧制造机2相连；所述加湿器3和所述加压泵4之间的管路上设置有湿度计10，所述控温缓冲桶5与所述灭菌滚桶6连接的管路上设置有第一压力调节阀11，所述灭菌滚桶6与真空泵7连接的管路上设置有第二压力调节阀12；

所述灭菌滚桶6转动设置，所述灭菌滚桶6的外壁设置有加热器61，所述灭菌滚桶6内设置有测温组件62，且所述灭菌滚桶6的出口处设置有第一压力计63。

所述灭菌滚桶6的内壁固定设置有搅拌桨64。

所述加湿器3为一v型加湿桶31，所述v型加湿桶31的底部与进水管32相连，所述v型加湿桶31内斜向设置有一臭氧进嘴33，所述臭氧进嘴33与臭氧制造机2通过管路相连。

所述臭氧进嘴33与臭氧制造机2相连的管路上设置有第二压力计13。

所述控温缓冲桶5内设置有冷凝器51，所述控温缓冲桶5的底部设置有排水管路52。

所述除湿干燥器8包括除湿机81和干燥管82，所述真空泵7依次通过除湿机81和干燥管82连接至臭氧制造机2。

二、高效灭菌方法步骤如下：

步骤1、孢子萌芽:将检品(干燥大蒜片)放在35±5℃，90±5％rh的高湿温环境预处理(2小时或以上)，使检品内部的部分沉睡细菌激活或孢子发芽。

步骤2、抽真空消除孔隙内空气和湿气:将欲灭菌的干燥大蒜片(5公斤)倒入臭氧灭菌滚桶6内，在灭菌滚桶6内导入臭氧或空气，利用所述灭菌滚桶6的外壁设置的加热器61密闭加热至37±2℃(最高56℃)，旋转(0.2rpm)并利用搅拌桨64搅拌15分钟后，将灭菌滚桶6内加热的臭氧在持续旋转搅拌下通过真空泵7抽真空(0.5mmhg)，直到桶内温度降至20～25℃。

步骤3、循环导入微湿臭氧:打开氧气桶1纯氧气进入臭氧制造机2，产生的臭氧通过加湿器3调整v形加湿桶31内的水位，调整气水接触面积，使湿度至50±5％rh。微湿的臭氧气体经过加压泵4加压至2.0±0.2atm并导入控温缓冲桶5冷却到25±2℃并冷凝多余水气(90～99％rh)。(本实施例的控温缓冲桶5容积是30l。)

步骤3.1、预灭菌：打开第一压力调节阀11将饱含水气的高压臭氧缓慢灌满灭菌滚桶6(0.2rpm/min)，旋转预灭菌5分钟之后在灭菌滚桶6的两侧调节第一压力调节阀11和第二压力调节阀12，使出气速率以低于进气的速率排出灭菌后的臭氧气体(6l/min)，维持灭菌滚桶6压力在2.0±0.2atm；并让排出的臭氧气体经过冷凝除湿器81和干燥管82之后，再进入臭氧制造机2，循环制造更高浓度的臭氧气体。

步骤4、循环灭菌：将饱含水气的高压臭氧从灭菌滚桶6一侧持续缓慢灌入并从另一侧排出，同时调节灭菌滚桶6两侧的第一压力调节阀11和第二压力调节阀12，使出气速率以低于进气的速率排出灭菌后的臭氧气体，维持灭菌滚桶压力在2.0±0.2atm，旋转灭菌；从灭菌滚桶6排出的灭菌臭氧经过内附-4℃冷凝器的10公升除湿器81和干燥管82之后湿度低于30％rh，再进入臭氧制造机2，循环制造更高浓度的臭氧气体，高浓度臭氧重复步骤3的动作后，再次进入灭菌滚桶6进行灭菌，如此往复，循环灭菌25分钟；

步骤5、循环灭菌结束(循环灭菌结束检测臭氧浓度大于300ppm)，采取样品做总生菌数检测。

步骤6、当检测不合格时，再次导入臭氧重复步骤4的循环灭菌，上一组循环残留臭氧可以做为另一组灭菌的臭氧气体使用或通过水曝之后经由催化管催化后排到室外大气。

维持所述臭氧气体每3-10分钟在整个灭菌系统内循环一次。所述灭菌滚桶的转速为0.1～10转/分钟，且从步骤2开始到灭菌结束，持续转动。

三、细菌的检测

1、生菌数检测培养基:平板计数培养基(platecountagar,pca)(标准方法培养基)使用121℃灭菌15分钟，最后ph值为7.0±0.2之:(15ml/plate)。

磷酸盐缓冲稀释液是新鲜配置无菌的k2hpo4水溶液ph7.2。依照中国台湾fda之食品微生物之检验方法－生菌数之检验法办理(参考文献：食品微生物之检验方法－生菌数之检验法办理，fdataiwan；https://www.fda.gov.tw/upload/133/content)。

2.生菌数检测检品处理：试验前、后采集样品，将检体切碎混合均匀后，取10g，加入稀释液90ml，混合均匀，作为10倍稀释检液。使用已灭菌之吸管，吸取上述之10倍稀释检液1ml加至稀释液9ml中，依序作成100～100,000等一系列稀释检液。最后，吸取各稀释检液及(或)原液1ml分别置入培养皿中，每一检液做二重复。另吸取稀释液1ml置入培养皿中，作为空白对照组(二重复)。

3、菌落培养试验:在上述各培养皿中倒入冷却至45±1℃之平板计数培养基(pca)12～15ml，摇动混合，自检液之调制至此步骤应于15分钟内完成。最后，将上述培养基平板静置，待培养基凝固后，倒置于35℃培养48±2小时。

4、生菌的计算：

经培养后，选取有25～250个菌落之两个平板来计数，其生菌数之表示方式为cfu/g。

a稀释倍数，各平板内之菌落数:aa，ab。

b稀释倍数，各平板内之菌落数:ba，bb。

5、结果与讨论:未灭菌之前的大蒜片，其生菌数为(8±2)x10⁵cfu/g，经高压(2.0±0.2atm)臭氧循环灭菌之后的生菌数为22±17cfu/g.logcfu下降值为5.9-1.3＝4.6，干燥大蒜片显然可以经由使用本发明方法以高压循环臭氧灭菌之后，达到低于100cfu/g的食品规格要求(p<0.05)。可见高压臭氧循环产生的高浓度臭氧(臭氧浓度大于300ppm)，有很好的灭菌效益。使用本法灭菌2次或以上，最低可达到生菌数5cfu/g，log下降值为5.9-0.7＝5.2，效率更好，但对于食品处理的经济意义不大。

本发明的循环臭氧灭菌法除了灭菌效率高之外，由于灭菌滚桶内的臭氧是循环使用，实际上比开放式臭氧灭菌法更环保，且臭氧浓度可以达到现有技术浓度之3.5倍，灭菌后的残留臭氧可用于制造臭氧水供其他经济用途，非常经济有效。本发明的臭氧浓度虽然很高(300ppm)，但由于干燥的被灭菌物的含水率很低，不会对检品造成氧化变质现象。

本发明将检品置于旋转的灭菌滚桶内加热至37～56℃，再抽真空，排除吸附在检品微小孔隙内的空气或杂气，之后降温至20～25℃再进行加压循环灭菌，没用更高温循环灭菌的原因(37～56℃)，主要因为已知臭氧的半衰期约是20～60分钟，高温会让臭氧更快消失，所以在臭氧灭菌时是使用相对最佳的灭菌温度20～25℃；同时为了加强臭氧对微细孔隙的渗透率，所以除了抽真空消除残留在孔隙内的空气或杂气之外，并对臭氧气体加压，使臭氧气体强制进入微细孔隙内；另外，将臭氧进行多次循环造超高浓度臭氧(300ppm)，大大增强臭氧的灭菌效率；并且通过灭菌滚桶均匀翻动堆积的小颗粒或片状物质的检品，利于抽真空时排除微小孔隙内的空气或杂气，并提高臭氧对检品每一层面和孔隙的灭菌效率；综合以上各种成效使得本申请方法，可以达到降低检品生菌数到低于100cfu/g的要求。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。