降解生物胺的酵母菌Millerozymafarinose及其在发酵食品中的应用的制作方法

本发明涉及一株降解生物胺的酵母菌millerozymafarinose及其应用，属于食品发酵技术领域。

背景技术：

发酵食品是人们利用有益微生物加工制造的一类食品，通过微生物的作用，产生独特的风味和活性成分，科研人员经过对发酵食品的长期研究认为，现代人每天摄入一种或多种发酵食品可以维持健康，促进长寿。然而，目前很多发酵食品如奶酪、酱油、纳豆、鱼露等的生产还是采用传统的自然发酵技术，在此开放的发酵环境中，很容易发生外来微生物的污染，一旦被具有脱羧能力的微生物污染，这些食品含有的大量游离氨基酸就会脱羧生成生物胺。摄入过量生物胺会对人体产生毒害作用，主要会引起头痛，恶心，呼吸急促，心悸，血压过低，肠部痉挛等症状。人体内含有少量具有解毒作用的胺氧化酶，但是很多因素会使胺氧化酶减少，如疾病、遗传缺陷、服用dao抑制剂药物以及饮酒，并且生物胺之间毒性具有协同效应。所以考虑到安全健康，应尽可能降低发酵食品中生物胺的含量。

目前，控制生物胺含量的方法主要是通过添加剂、控制卫生状况、辐照等来控制发酵食品生产过程中生物胺的产生。近年来选择具有降解生物胺能力的微生物作为发酵剂消除食品中已经生产了的生物胺是具有潜力的新方法。目前已报道的主要是从奶酪、腐乳以及发酵肉香肠中筛选具有降生物胺作用的菌株，但是目前筛选到具有降解生物胺作用的株菌种类少，效果不佳。因此，筛选具有高效降解生物胺菌株对于开展生物胺降解菌株的实际应用研究以及生产健康安全的发酵食品具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明提供了一株具备较强生物胺降解能力的酵母菌，具体为粉状米勒氏酵母millerozymafarinose。准确的说，本发明是提供了粉状米勒氏酵母millerozymafarinose在降解生物胺上的新用途。

所述酵母菌从山东省青岛市灯塔调味公司的60天酱油酱醅中筛选分离得到，是一株对生物胺有较强降解能力菌株，经系统分类鉴定，为millerozymafarinose。

所述酵母菌的培养方法，步骤为：将酵母菌按体积比2％的接种量接种至液体培养基，在28℃、160r/min条件下培养48h。

所述液体培养基为含盐yepd培养基，其配方为：蛋白胨20g/l；酵母浸粉10g/l；葡萄糖20g/l；氯化钠50g/l。

本发明提供的酵母菌millerozymafarinose，本身不产生物胺，且可以降解已经产生了的生物胺。

本发明同时提供了一种利用所述酵母菌株进行发酵食品中生物胺的控制方法：对酵母菌进行培养后，离心(5000r/min，10min，4℃)收集菌体，将菌体用无菌生理盐水(氯化钠0.85％，w/v)制备成1.0×10⁸cfu/ml的菌悬液，将该菌悬液按照体积比为2％的接种量加入含生物胺的食品中，对其中的生物胺进行降解。

本发明的有益效果：

本发明首次发现并证实粉状米勒氏酵母millerozymafarinose可以降解生物胺，并且其本身不产生物胺。即使在较高氯化钠情况下，millerozymafarinose仍然对生物胺具有较高的降解率，表明能适用于较高渗透压的环境下的发酵和生物胺降解。

本发明公开的菌株能在20％氯化钠浓度下能降解组胺、酪胺、尸胺、腐胺，最高能达到55.39％。本发明提供的菌株在发酵鱼露中也表现出良好的降胺能力，可明显降低酱油生产过程中生物胺的含量，60天发酵降解效率最高可达57.13％，因此具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是生物胺液相色谱图；a中a-f依次为色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺，组胺，酪胺，亚精胺和精胺；b和c分别为培养前和培养后测定生物胺液相色谱图。

具体实施方式

生物胺采用丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱法进行检测。

降解率(％)＝100％*(生物胺初始浓度—生物胺终浓度)/生物胺初始浓度。

实施例1：降胺酵母菌millerozymafarinose的筛选鉴定

取发酵60天的发酵酱醅10g加入190ml无菌水中，混匀后梯度稀释，涂布于myepd(yepd培养基+10％氯化钠+100mg/l混合生物胺)平板，28℃培养24h。挑选单菌落反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化单菌落，供下一步降解生物胺及鉴定用。

将菌株接种于液体yepd培养基中，28℃，160rpm培养48h，使用ezup柱式酵母基因组dna抽提试剂盒(上海生工)提取dna。使用引物对ns1/ns6扩增26srdna，按照以下条件反应：94℃预变性4min后进入循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s,循环30次；72℃修复延伸10min，4℃终止反应。将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，目标条带使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行回收，回收产物送往上海生工公司进行dna测序，将测序结果在ncbi上进行blast对比，鉴定为millerozymafarinose。

对保藏的millerozymafarinose进行活化培养后，离心(5000r/min，10min，4℃)收集菌体，将菌体用无菌生理盐水(氯化钠0.85％，w/v)制备成1.0×10⁸cfu/ml的菌悬液。以2％接种(按体积比)到50ml含氨基酸1％的含盐5％的yepd液体培养基中，28℃、160r/min培养。检测培养24h，48h和72h后培养基中生物胺的含量。结果未检测到八种生物胺，表明此菌株自身不产生生物胺。具体见图1。

实施例2：millerozymafarinose在培养基条件下对生物胺的降解

配制myepd液体培养基：蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l，葡萄糖20g/l，氯化钠50g/l，混合生物胺(组胺、色胺、苯乙胺、腐胺、酪胺、精胺、亚精胺以及尸胺)100mg/l，自然ph。

将菌株接种在液体yepd培养基中进行活化，28℃，160rpm培养24h。以2％接种(按体积比)到50ml的myepd培养基中。28℃，160rpm培养48h后，测定培养基中各生物胺含量，与空白组相比，生物胺的减少量分别为：色胺47.23％±1.37％、苯乙胺39.38％±0.84％、尸胺68.73％±1.68％、腐胺76.12％±2.89％、酪胺60.84％±1.93％、组胺80.33％±2.16％、精胺51.23％±2.17％、亚精胺43.89％±1.84％。

以2％的接种量(按体积比)，将活化后的millerozymafarinose接种到不同氯化钠浓度的myepd培养基中，按照上述条件培养。测定培养基中生物胺浓度，计算生物胺降解率如表1，在较高氯化钠情况下，millerozymafarinose仍然对生物胺具有较高的降解率，表明能适用于较高渗透压的环境下的发酵和生物胺降解。

表1不同氯化钠含量下各生物胺降解率

用氢氧化钠和盐酸调节myepd培养基ph为3，4，5，6，7，8，9，10，11。以2％的接种量(按体积比)，将活化后的millerozymafarinose接种到ph值不同的培养基中，按照上述条件培养。测定培养基中生物胺浓度，计算总生物胺降解率如表2，结果表明在ph＝5-7时对生物胺具有较高的降解率，说明适用于一般发酵食品。

实施例3：millerozymafarinose对发酵鱼露中生物胺的降解

将millerozymafarinose进行活化培养后，离心(5000r/min，10min，4℃)收集菌体，用无菌生理盐水(氯化钠0.85％，w/v)制备成1.0×10⁸cfu/ml的菌悬液。以2％的接种量(按体积比)接种到发酵一个月的鱼露醅中。以未接种的作为对照组，连续自然发酵三个月后，测定生物胺浓度，发酵鱼露理化指标，微生物指标以及风味。与对照组相比，接种了millerozymafarinose的发酵鱼露总生物胺下降57.13％±2.89％，挥发性盐基氮下降45.33％±3.12％，氨基酸态氮以及游离氨基酸均无明显变化，肠杆菌数量下降40.18％±4.88％，风味无明显变化。

实施例4：millerozymafarinose对成品鱼露中生物胺的降解

将millerozymafarinose进行活化培养后，离心(5000r/min，10min，4℃)收集菌体，用无菌生理盐水(氯化钠0.85％，w/v)制备成1.0×10⁸cfu/ml的菌悬液。以2％的接种量(按体积比)接种到成品鱼露中(购买于青岛市齐东路菜市场，氯化钠含量为12.3％，ph为5.23)。以未接种的作为对照组，160rpm，30min，培养48h，测定培养前后鱼露生物胺含量，计算生物胺降解率分别为：尸胺48.13％±4.02％、腐胺32.14％±3.29％、酪胺55.61％±5.93％、组胺62.13％±4.12％。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。