母乳化的复合益生菌微胶囊粉及其制备方法和应用与流程

本发明属于食品领域，涉及一种复合益生菌微胶囊粉，具体地说是一种母乳化的复合益生菌微胶囊粉及其制备方法、应用。

背景技术：

婴幼儿由于其自身代谢系统尚未发育完全，对营养摄入具有特殊的要求，母乳是婴幼儿成长过程中最天然的、最适合的食物。世界卫生组织(who)指出，婴儿在生命前6个月应以纯母乳喂养，从而达到最佳生长发育水准和健康水准。母乳中含有丰富的营养成分，包括乳糖、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质、低聚糖、免疫球蛋白等。并且，在出生后第1个小时内进行母乳喂养，可以有效保护新生儿免受疾病感染。

不仅如此，母乳还能够从母体转运细菌，是婴幼儿胃肠道菌群的主要来源之一。研究发现，初乳中含有丰富的微生物，通过母乳喂养进行母-婴垂直传播，能够促进婴幼儿肠道菌群的建立和免疫功能的发育成熟。

婴幼儿的肠道菌群自生命初期开始建立，并与神经系统的发育相互作用，持续至成年。婴幼儿的肠道菌群发育分为3个阶段，≤14个月为发育期，以双歧杆菌占主导地位；15-30个月为过渡期，菌群多样性增加；≥31个月为稳定期，厚壁菌门占优势。

然而，除了母乳喂养，婴幼儿的肠道菌群建立和稳定还受到多种因素的影响，如分娩方式、遗传因素、饮食习惯等。研究表明，顺产儿肠道菌群最初的定植在很大程度上是由婴儿从母亲的阴道、皮肤等接触到的丰富的微生物决定的，而剖宫产儿的肠道菌群则主要依赖于外界环境以及母亲皮肤上的微生物，与顺产儿的肠道菌群差异较大。

而，现有的技术方案中并没有一种可辅助添加于婴幼儿配方奶粉的益生菌产品，以改善因分娩方式差异引起的婴幼儿肠道菌群定植波动，增强婴幼儿的肠道菌群定植的稳定性。

技术实现要素：

本发明的目的，是要提供一种母乳化的复合益生菌微胶囊粉，以解决因分娩方式差异引起的婴幼儿肠道菌群定植波动的问题；

本发明的另一个目的，是要提供上述母乳化的复合益生菌微胶囊粉的制备方法；

本发明的还有一个目的，是要提供上述母乳化的复合益生菌微胶囊粉的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明母乳化的复合益生菌微胶囊粉，制成它的原料中包括动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025、副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117、嗜热链球菌jmcc0003。

本发明所用到的动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025（bifidobacteriumanimalissubsplactisjmcc0025），已于2019年8月20日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）进行保藏，保藏编号：cgmccno.18403；

副干酪乳杆菌n1115（lactobacillusparacasein1115），已于2011年3月17日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）进行保藏，保藏编号：cgmccno.4691，其在专利号为201110357058.8的中国发明专利中首次公开；

植物乳杆菌n3117（lactobacillusplantarumn3117），已于2014年12月5日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）进行保藏，保藏编号：cgmccno.10133，其在专利号为201510936243.0的中国发明专利中首次公开；

嗜热链球菌jmcc0003（streptococcusthermophilusjmcc0003），已于2012年10月15日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）进行保藏，保藏编号：cgmccno.6674，其在专利号为201510938581.8的中国发明专利中首次公开。

一种母乳化的复合益生菌微胶囊粉，它含有四种益生菌，即动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025、副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117及嗜热链球菌jmcc0003；

以重量份数计，制成其有效成分的原料包括1-5份大豆低聚糖、5-10份低聚半乳糖、0.1-2份3’唾液酸乳糖、5-15份麦芽糊精、5-10份乳清蛋白粉、1-3份海藻酸钠、1-5份明胶、0.1-3份甘油。

作为本发明的一种限定，所述母乳化的复合益生菌微胶囊粉中含有1-10份动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌泥、0.5-5份副干酪乳杆菌n1115菌泥、0.5-5份植物乳杆菌n3117菌泥、0.5-5份嗜热链球菌jmcc0003菌泥，该四种菌泥中分别含相应益生菌≥1×10¹¹cfu/g。

作为本发明的另一种限定，它含动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025≥1×10¹⁰cfu/g、副干酪乳杆菌n1115≥1×10¹⁰cfu/g、植物乳杆菌n3117≥1×10¹⁰cfu/g和嗜热链球菌jmcc0003≥1×10¹⁰cfu/g。

本发明还提供了上述的母乳化的复合益生菌微胶囊粉一种制备方法，包括依次进行的以下步骤：

1）制备菌粉

该步骤需要制备动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌粉、副干酪乳杆菌n1115菌粉、植物乳杆菌n3117菌粉及嗜热链球菌jmcc0003菌粉，它们分别通过以下操作制备：

11）取麦芽糊精、乳清蛋白粉、海藻酸钠、明胶、甘油，混匀，制得混合物a；

12）混合物a加入纯净水中，水合溶解，均质，灭菌，制得无菌保护剂b；

13）取相应益生菌的菌泥分别与无菌保护剂b混匀后，冷冻干燥，粉碎，过筛，制得相应益生菌的菌粉；

2）制备母乳化的复合益生菌微胶囊粉：

取四种益生菌的菌粉，即动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌粉、副干酪乳杆菌n1115菌粉、植物乳杆菌n3117菌粉和嗜热链球菌jmcc0003菌粉，与大豆低聚糖、低聚半乳糖和3’唾液酸乳糖混匀，即得所述母乳化的复合益生菌微胶囊粉。

作为本发明的一种限定，每一种菌泥是由相应的益生菌发酵至菌数≥1×10¹¹cfu/ml后，经收集菌液、离心制得。

作为本发明的进一步限定，每一种菌泥制得后，进行洗涤、离心。

作为本发明的更进一步限定，所述洗涤过程是以无菌生理盐水洗涤1-2次；

所述发酵的温度30-42℃，所述发酵的时间36-48h；

所述离心的转速4000-6000rpm，所述离心的时间8-15min。

作为本发明的另一种限定，步骤1）中，所述水合溶解的温度35-40℃；

所述均质的温度为60-65℃；

所述灭菌的为温度110-121℃，所述灭菌的时间20-25min；

步骤2）中，所述混匀是搅拌混匀10-15min。

作为本发明的第三种限定，步骤1）中，每一种菌泥与无菌保护剂b的重量比为1：1-20；

每一种菌粉的粒径≤40目；

步骤2）中，所述混匀过程中，保持每一种益生菌的活菌数为≥1×10¹⁰cfu/g。

本发明也提供了上述的母乳化的复合益生菌微胶囊粉的一种应用，所述母乳化的复合益生菌微胶囊粉可用来单独食用，也可用于与婴儿配方奶粉混合食用。

动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025，该菌从母乳喂养的婴儿或幼儿粪便中分离筛选出来的，具有很好的调节肠道作用，能够调节肠道菌群平衡，改善粪便特性。

上述动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌株的16srrna序列如下：

acggctcccccacaagggtcgggccaccggcttcgggtgctacccactttcatgacttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgcattcaccgcggcgttgctgatccgcgattactagcgactccgccttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaccggttttcagcgatccgccccacgtcaccgtgtcgcaccgcgttgtaccggccattgtagcatgcgtgaagccctggacgtaaggggcatgatgatctgacgtcatccccaccttcctccgagttgaccccggcggtcccacatgagttcccggcatcacccgctggcaacatgcggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtgaaccggccccgaagggaaaccgtgtctccacggcgatccggcacatgtcaagcccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaatttctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcgggatgcttaacgcgttggctccgacacgggacccgtggaaagggccccacatccagcatccaccgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtgacggcccagagacctgccttcgccattggtgttcttcccgatatctacacattccaccgttacaccgggaattccagtctcccctaccgcactccagcccgcccgtacccggcgcagatccaccgttaggcgatggactttcacaccggacgcgacgaaccgcctacgagccctttacgcccaataaatccggataacgctcgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcgaacaatccactcaacacggccgaaaccgtgccttgcccttgaacaaaagcggtttacaacccgaaggcctccatcccgcacgcggcgtcgctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtatctcagtcccaatgtggccggtcaccctctcaggccggctacccgtcaacgccttggtgggccatcaccccgccaacaagctgataggacgcgaccccatcccatgccgcaaaagcatttcccaccccaccatgcgatggagcggagcatccggtattaccacccgtttccaggagctattccggtgcacagggcaggttggtcacgcattactcacccgttcgccactctcacccgacagcaagctgccagggatcccgttcgactgcatgtgtaag。

其tuf基因序列如下：

ggatctcgatgagagcagcgtggtatcaccatcaacattgcccacatcgagtaccagacggccaagcgtcactacgcccacgtcgactgcccgggccacgccgacttcgtgaagaacatgatcaccggcgctgcccagatggatggcgccatcctcgttgtggccgccaccgacggcccgatggcccagacccgcgagcacgtgctgctcgcccgtcaggtcggcgtcccgaagatcctcgtcgctctgaacaagtgcgatatggtcgatgacgaagagctcatcgagctcgtcgaagaagaggtccgcgacctcctcgacgagaacggcttcgaccgcgactgcccggtcgtgcacacctccgcttacggcgctctgcatgacgacgctcccggatcacgacaagtgggttgccaccatcaaggagctcatggacgacgtcgacgagtacatcccgaccccggtccacgacctcgacaagccgttcctgatgccgatcgaggacgtcttcaccatctccggccgtggcaccgtcgtcaccggtcgtgtcgagcgcggcaagctgccgatcaacacgaacgtcgagatcgtcggcatccgcccgacccagaccaccaccgtcacctccatcgagaccttccacaagcagatggatgagtgcgaggccggcgacaacaccggtctgctgctccgcggcatcaaccgcaccgacgtcgagcgtggccaggtcgtggctgctccgggttcggtcaccccgcacaccaagttcgaaggcgaagtctacgtccttaccaaggatgagggcggccgtcactcgccgttcttctcgaactaccgtccgcagttctacttccgcaccaccgacgtcaccggcgtcatcacgctgccggaaggcgtcgagatggttcagcctggcgatcacgcgaccttcacggttgagctgatccagccgatcgctatggaagagggcttcaccttcccagtgcttgaaggc。

本发明与现有技术相比，所取得的进步在于：

本发明依据母乳中微生物多样性变化制备的母乳化的复合益生菌微胶囊粉，含有多种益生菌，其中以动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025为主，同时添加副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117、嗜热链球菌jmcc0003，通过优化配比，促进有益菌定植，有助于改善因分娩方式差异引起的婴幼儿肠道菌群定植波动，增强婴幼儿的肠道菌群定植的稳定性；

大豆低聚糖是大豆中可溶性糖的总称，约占成熟大豆含量的10%，由蔗糖、棉籽糖和水苏糖组成。大豆低聚糖不能被人体和一些有害菌属消化利用，但能够被双歧杆菌利用。添加大豆低聚糖有助于双歧杆菌在人体肠道中增殖；

3’唾液酸乳糖是母乳中的一种唾液酸化低聚糖，在母乳中的含量约为0.1-0.3g/l，且在整个哺乳期保持相对稳定。3’唾液酸乳糖能够支持肠道中的双歧杆菌等益生菌增长，具有抵抗炎症的特性，并能够减少肠道中条件致病菌的附着，进而通过肠-脑轴促进婴儿的神经系统发育。

本发明的母乳化的复合益生菌微胶囊粉适用于婴幼儿食用，能够改善因分娩方式差异引起的婴幼儿肠道菌群定植波动。

附图说明：

图1是本发明实施例8中复合益生菌混合物的菌悬液对肠道屏障功能的影响变化图；

图2是本发明实施例9中低聚糖混合物对肠道双歧杆菌增殖的影响变化图；

图3是本发明实施例10中新生小鼠体质量变化图；

图4是本发明实施例10中新生小鼠肠道双歧杆菌变化图。

具体实施方式

下面具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

实施例1-6母乳化的复合益生菌微胶囊粉及其制备方法

实施例1-6分别为母乳化的复合益生菌微胶囊粉，制成其有效成分的原料相同，不同之处在于不同实施例中原料的用量不同，具体详见表1：

表1原料配比一览表

下述为实施例1中的母乳化的复合益生菌微胶囊粉的制备方法，其按照实施例1中原料用量，包括依次进行的以下步骤：

1）制备益生菌粉：

该步骤需要制备动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌粉、副干酪乳杆菌n1115菌粉、植物乳杆菌n3117菌粉及嗜热链球菌jmcc0003菌粉，它们分别通过以下操作制备：

11）称取5kg麦芽糊精、10kg乳清蛋白粉、3kg海藻酸钠、2kg明胶、1kg甘油，室温下搅拌10min至充分混匀后，制得混合物a；

12）混合物a加入29l纯净水中，35℃水合溶解，升温至60℃，并保持60℃均质，110℃灭菌20min，制得50kg无菌保护剂b；

13）称取1kg动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌泥、20kg无菌保护剂b，室温下搅拌20min混合均匀，冷冻干燥，粉碎后过40目筛，制得1kg动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌粉，菌粉粒径≤40目；

称取0.5kg副干酪乳杆菌n1115菌泥、10kg无菌保护剂b，室温下搅拌20min混合均匀，冷冻干燥，粉碎后过40目筛，制得0.5kg副干酪乳杆菌n1115菌粉，菌粉粒径≤40目；

称取0.5kg植物乳杆菌n3117菌泥、10kg无菌保护剂b，室温下搅拌20min混合均匀，冷冻干燥，粉碎后过40目筛，制得0.5kg植物乳杆菌n3117菌粉，菌粉粒径≤40目；

称取0.5kg嗜热链球菌jmcc0003菌泥、10kg无菌保护剂b，室温下搅拌20min混合均匀，冷冻干燥，粉碎后过40目筛，制得0.5kg嗜热链球菌jmcc0003菌粉，菌粉粒径≤40目。

其中菌泥的制备过程如下：

取动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025置于发酵罐中，35℃发酵培养40h，培养至菌数≥1×10¹¹cfu/ml，收集菌液，在室温、5000rpm条件下离心10min，得到菌体，取等菌液量的无菌生理盐水洗涤2次后，再在室温、5000rpm条件下离心10min，制得动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌泥，活菌数1×10¹¹cfu/g；

取副干酪乳杆菌n1115置于发酵罐中，35℃发酵培养40h，培养至菌数≥1×10¹¹cfu/ml，收集菌液，在室温、5000rpm条件下离心10min，得到菌体，取等菌液量的无菌生理盐水洗涤2次后，再在室温、5000rpm条件下离心10min，制得副干酪乳杆菌n1115菌泥，活菌数1×10¹¹cfu/g；

取植物乳杆菌n3117置于发酵罐中，35℃发酵培养40h，培养至菌数≥1×10¹¹cfu/ml，收集菌液，在室温、5000rpm条件下离心10min，得到菌体，取等菌液量的无菌生理盐水洗涤2次后，再在室温、5000rpm条件下离心10min，制得植物乳杆菌n3117菌泥，活菌数1×10¹¹cfu/g；

取嗜热链球菌jmcc0003置于发酵罐中，35℃发酵培养40h，培养至菌数≥1×10¹¹cfu/ml，收集菌液，在室温、5000rpm条件下离心10min，得到菌体，取等菌液量的无菌生理盐水洗涤2次后，再在室温、5000rpm条件下离心10min，制得嗜热链球菌jmcc0003菌泥，活菌数1×10¹¹cfu/g。

2）制备母乳化的复合益生菌微胶囊粉：

称取1kg动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌粉、0.5kg副干酪乳杆菌n1115菌粉、0.5kg植物乳杆菌n3117菌粉、0.5kg嗜热链球菌jmcc0003菌粉、1kg大豆低聚糖、8kg低聚半乳糖和0.5kg3’唾液酸乳糖，投入混料罐，室温下搅拌10min混合均匀，保持每一种益生菌的活菌数为≥1×10¹⁰cfu/g，制得母乳化的复合益生菌微胶囊粉。

下述分别为实施例2-6中的母乳化的复合益生菌微胶囊粉的制备方法，其分别按照实施例2-6中原料用量，制备步骤与实施例1的制备方法相同，不同之处在于各步骤中各项工艺参数有差别，具体不同工艺参数见下表：

表2实施例2-6的不同工艺参数一览表

实施例1-6制得的母乳化的复合益生菌微胶囊粉各项指标见表3：

表3产品的指标

实施例7母乳化的复合益生菌微胶囊粉的耐酸耐胆盐特性

分别配制7份近似人体胃肠道环境的低ph培养液（ph=2.0）和7份高胆盐培养液（含3‰猪胆盐）。

分别取1g实施例1-6制得的母乳化的复合益生菌微胶囊粉和1g复合益生菌菌体，分别加至7份9ml在37℃下预热的近似人体胃肠道环境的低ph培养液，温育2h；

同样分别取1g实施例1-6制得的母乳化的复合益生菌微胶囊粉和1g复合益生菌菌体，分别加至7份9ml在37℃下预热的高胆盐培养液，温育6h；

温育完成后，分别计数上述14份混合液的菌落。

计数完成后将14份混合液分别用均质机分散60s，缓慢摇晃15min后，再次对14份混合液进行菌落计数。

表4耐酸耐胆盐特性评价结果

由表4可知，与未包埋的益生菌相比，实施例1-6制得的母乳化的复合益生菌微胶囊粉包埋处理提高了益生菌的耐酸和耐碱能力，因此，本发明制得的母乳化的复合益生菌微胶囊粉具有一定的耐酸和耐碱能力，能够更好的适应人体胃肠道环境。

实施例8母乳化的复合益生菌微胶囊粉对肠道屏障功能的影响

肠道发育在婴幼儿成长过程中极为重要，为婴幼儿吸收必需的营养物质提供保证。在婴幼儿肠道发育过程中会附着一些益生菌，这些益生菌能够通过调节肠道通透性，维持肠道细胞活性，从而达到维护肠道细胞间紧密连接结构的目的。基于此，本实施例采用h2o2氧化损伤肠细胞的体外caco-2细胞研究模型，针对复合益生菌对婴幼儿肠道屏障功能的影响进行评价。

制备动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025、副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117和嗜热链球菌jmcc0003四种菌株的复合益生菌混合物的菌悬液（最终总浓度约为1×10⁸cfu/孔），与损伤的体外caco-2细胞研究模型共孵育6h，分别于2h、4h、6h测定跨膜电阻值，依据下述公式计算相对跨膜电阻值：

。

细胞间紧密连接结构是肠道机械屏障的基础，在transwell的caco-2细胞研究模型中，若紧密连接结构破坏，离子流所受到的阻力减小，跨膜电阻值减小。

上述实验结果，参见图1，证明复合益生菌混合物的菌悬液对细胞间紧密连接结构均具有一定维持作用，能够缓解h2o2对肠细胞造成的氧化损伤，并能维持和保护肠细胞的紧密连接结构，促进婴幼儿肠道的健康发育。

实施例9低聚糖促进肠道双歧杆菌增殖

选取50只昆明雄性小鼠，随机分为5组：对照组每天早上灌胃0.2ml生理盐水；干预组1-4组每天早上分别灌胃0.2ml含有2%低聚糖混合物的生理盐水溶液，持续灌胃培养2周并跟踪1周，于第0、3、5、7、9、11、13、15、21天检测小鼠粪便中双歧杆菌的量。

其中，干预组1-4组灌胃的低聚糖混合物添加不同比例的低聚糖：干预组1组的比例为大豆低聚糖：低聚半乳糖：3’唾液酸乳糖=1：1：1、干预组2组的比例为大豆低聚糖：低聚半乳糖：3’唾液酸乳糖=1：1：2、干预组3组的比例为大豆低聚糖：低聚半乳糖：3’唾液酸乳糖=2：1：2、干预组4组的比例为大豆低聚糖：低聚半乳糖：3’唾液酸乳糖=2：2：1。

经2周灌胃培养以及1周跟踪检测，结果参见图2，与对照组相比，干预组1-4组的结果中低聚糖混合物均能够促进小鼠肠道双歧杆菌的增殖。其中，干预组3组的结果最优，低聚糖混合物的添加比例为大豆低聚糖：低聚半乳糖：3’唾液酸乳糖=2：1：2。

由此证明，低聚半乳糖和3’唾液酸乳糖的添加有助于促进肠道中双歧杆菌的增殖。

实施例10母乳化的复合益生菌微胶囊粉对早期生长及双歧杆菌定殖的评价

选取30只新生c57bl/6小鼠，随机分为2组：对照组每天早上灌胃20μl生理盐水；干预组每天早上灌胃20μl含有10μg的实施例1制得的复合益生菌微胶囊粉的生理盐水溶液，持续灌胃培养2周并跟踪1周，每2天记录一次体质量。

初始体质量均设为1，其后测定的体质量为其初始体质量的倍数，并于第0、3、5、7、9、11、13、15、21天检测小鼠粪便中双歧杆菌的量。

经过2周灌胃培养以及1周跟踪检测，结果参见图3、图4，干预组和对照组的体质量均持续增长，干预组与对照组相比增长较快，且干预组的小鼠肠道双歧杆菌的含量高于对照组。

由此证明，母乳化的复合益生菌微胶囊粉能够促进新生小鼠的生长和肠道有益菌的生长定植，对早期成长具有有益影响。

实施例11一种动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025的分离纯化方法

本实施例提供了动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025的分离纯化方法，该方法按照以下步骤顺序进行：

一、采集样品

取1g婴儿或幼儿肠道粪便，然后加入到9ml生理盐水中并充分混匀，得到样品a；

二、样品富集

取2ml样品a，加入到100ml改良mrs液体培养基中，于37℃条件下厌氧培养72h，得到培养液b；

三、菌株分离筛选

取1ml培养液b1，用浓度为0.9%的无菌生理盐水以10倍梯度倍增稀释，依次为梯度稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍，对应得到菌悬液c11～c15；

取改良mrs固体培养基，融化后，分别倒入第一～第五培养皿种，待冷却、完全凝固后，得培养基d1～d5，分别吸取菌悬液c1～c5各0.1ml并一一对应涂布到培养基d1～d5上，然后倒置平板，置于37℃环境下厌氧培养72h，观察菌落生长情况；

待平板出现典型菌落后，根据标准双歧杆菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的单菌落e；

四、菌株纯化

挑取选中的单菌落e，将单菌落e培养物划线接种到改良mrs固体培养基上，37℃环境下厌氧环境培养72h，得单菌落f；

将单菌落f继续划线接种到改良mrs固体培养基上，37℃环境下厌氧环境培养72h，得单菌落g；

再将单菌落g继续划线接种到改良mrs固体培养基上，37℃环境下厌氧环境培养72h，得纯培养物h，即为所述动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025的菌株；

五、保存

将纯培养物h与无菌的质量份数为50%的甘油按照1:1比例混合，置于菌种保存管内，混匀后在-70℃环境下保存，同时接种改良mrs固体培养基试管斜面用于临时保存。

本实施例中，改良mrs液体培养基原料包括：酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、k2hpo4、mgso4·7h2o、mnso4·7h2o、半胱氨酸、蒸馏水；其中酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、k2hpo4、mgso4·7h2o、mnso4·7h2o、半胱氨酸、蒸馏水的用量比例关系为10g：10g：5g：20g：5g：2g：1g：2g：0.2g：0.05g：0.5g：1000ml；改良mrs固体培养基为每1000ml改良mrs液体培养基中添加15%质量份数的琼脂。

实施例12动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌种的细菌学基本特征

本实施例为动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025的细菌学基本特征，其基本特征如表5所示。

表5动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025的基本特征

实施例13动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌种的糖发酵特性

本实施例为实施例1中动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌种的糖发酵特性。其糖发酵特性的实验方法为：将动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌株挑取单菌落接种至灭菌的改良mrs液体培养基内，于37℃条件下培养24h，取菌悬液接种至糖发酵管中，于37℃条件下厌氧培养48h，观察颜色变化。其糖发酵特性的鉴定结果如表6所示：

表6动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025糖发酵特性的鉴定结果

注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。

本实施例采用的改良mrs液体培养基与实施例11的改良mrs液体培养基成分相同。

实施例14动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌种的胃酸及肠液耐受特性

将待测动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌株活化3代后取1ml，分别置于含9ml过滤除菌处理的ph值为3.0的人工胃液中，震荡均匀并在37℃条件下厌氧培养，在开始培养和培养2h时分别取样，测定其活菌数。然后取在ph值3.0的人工胃液中消化2h后的培养液1ml，分别接种于9ml过滤除菌的ph值为8.0的人工肠液中，继续置37℃下培养，并分别在0h，4h，6h时测定活菌数。

以双歧杆菌bb-12作为标准菌株进行对照实验，实验参数与上述动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025菌株的实验参数相同。

存活率（%）=（cfun1/cfun0）×100%

式中，n1—经人工消化液处理6h的活菌数，n0—经人工消化液处理0h的活菌数。

b.肠液：bilesalts（difco）0.9g/100ml，调整ph值为8.0，过滤除菌备用。

表7动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025模拟胃液肠液耐受结果

经过实验发现，bb-12胃酸耐受能力较强，对肠液耐受较差，而动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025对胃酸耐受较差、对肠液耐受能力较强。综合比较动物双歧杆菌乳亚种jmcc0025具有更好的模拟消化液存活率，达到7.4%优于bb-12。

序列表

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<120>母乳化的复合益生菌微胶囊粉及其制备方法和应用

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