饲用西兰花叶蛋白水解方法及其水解物与流程

本发明属于植物蛋白水解技术领域，具体涉及使用蛋白酶水解西兰花叶蛋白原料的方法以及由该方法得到的西兰花叶蛋白水解物。

背景技术：

绿色植物中蕴藏的叶蛋白资源是获得廉价蛋白质饲料的重要途径之一。西兰花叶蛋白是从西兰花加工废弃的茎叶中提取的植物蛋白浓缩物，是一种新型蛋白质饲料原料，其粗蛋白含量大约为40％～60％。但由于干燥工艺的影响，其氨基酸消化率较低，限制了其在饲料中的使用量。诸多研究表明，植物蛋白经酶解加工，不但可以提高氨基酸消化率，还可以生成一些生物活性肽。生物活性肽是蛋白质中具有生理活性的肽片段，其有抗菌、抗氧化和免疫调节作用。含有生物活性肽的植物蛋白水解物添加在饲料中可以改善动物生产性能，提高免疫力。

专利申请cn105713942a公开了一种西兰花茎叶汁的水解方法，然而该方法的水解程度不高。

为了充分有效地利用西兰花叶蛋白资源，有必要开发适用的深加工技术，进一步提高其饲用价值和经济价值。

技术实现要素：

本发明提供了一种使用蛋白酶水解西兰花叶蛋白原料的方法。

本发明采用诺维信复合蛋白酶水解西兰花叶蛋白原料，通过酶水解单因素分析和正交试验分析，确定了最佳水解条件。

本发明还提供了西兰花叶蛋白水解物。

本发明还提供了西兰花叶蛋白水解物在饲料中的应用。

具体而言，本发明如下：

1.使用蛋白酶水解西兰花叶蛋白原料的方法，其特征在于：使用诺维信复合蛋白酶，酶水解条件为，原料浓度2～3％、酶浓度0.2～0.4g酶/g西兰花叶蛋白原料、ph值8～9、反应温度50～60℃、反应时间5～10小时。

2.根据项1所述的方法，其特征在于：所述原料浓度为2％。

3.根据项1所述的方法，其特征在于：所述酶浓度为0.3～0.4g酶/g西兰花叶蛋白原料。

4.根据项2所述的方法，其特征在于：所述酶浓度为0.3g酶/g西兰花叶蛋白原料。

5.根据项3所述的方法，其特征在于：所述反应温度为55℃。

6.根据项4所述的方法，其特征在于：所述反应温度为55℃。

7.根据项6所述的方法，其特征在于：所述ph值为8。

8.根据项1至7中任一项所述的方法，其特征在于：所述反应时间为5～8小时。

9.由项1至8中任一项所述的方法获得的西兰花叶蛋白水解物。

10.项9所述的西兰花叶蛋白水解物在饲料中的应用。

附图说明

图1表示酶浓度对西兰花叶蛋白水解度的影响。

图2表示底物浓度对西兰花叶蛋白水解度的影响。

图3表示酶解温度对西兰花叶蛋白水解度的影响。

图4表示酶解初始ph值对西兰花叶蛋白水解度的影响。

图5表示酶解时间对西兰花叶蛋白水解度的影响。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，本发明给出如下实施例。应该理解的是，本发明的实施例仅用于对本发明进行解释而不是限定，本发明的保护范围仅仅由本发明的权利要求进行限定。在不违背本发明构思的情况下，对本发明的方法做出的任何改变和变形、任何等同替代，都在本发明的保护范围之中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购买自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

试验材料

西兰花叶蛋白原料采用煮沸法制备。

将500g新鲜的西兰花茎叶用粉碎机切碎，用纱布包好后挤压，取得滤液。将所得滤液转移到三角瓶中加热煮沸，然后冷却，经滤纸过滤取得固形物，65℃干燥，即为西兰花叶蛋白。

本发明所使用的蛋白酶选用诺维信复合蛋白酶(诺维信^tmprotamex)。

实施例1氨基酸的含量测定及htot的计算

采用氨基酸分析仪测定西兰花叶蛋白中各种氨基酸的含量，结果测定见表1。

表1西兰花叶蛋白肽键摩尔数的测定结果

根据各氨基酸在西兰花叶蛋白中的含量以及该氨基酸的分子量，通过下述公式计算得到氨基酸的肽键摩尔数：

氨基酸的肽键摩尔数＝氨基酸残基在西兰花叶蛋白中的含量÷氨基酸的质量

将各氨基酸的肽键摩尔数求和得到西兰花叶蛋白的肽键摩尔数。

htot为每g原料蛋白质的肽键毫摩尔数，单位mmol/g。

本试验中依据西兰花叶蛋白肽键摩尔数总和0.381695mol/100g以及氨基酸的含量45.74g/100g，按照公式

htot＝西兰花叶蛋白肽键摩尔数÷氨基酸的含量

计算得出htot为0.00839mol/g，即8.39mmol/g。

实施例2蛋白质和游离氨基(–nh2)的测定

粗蛋白(cp)的测定采用凯氏定氮法。

水解蛋白液中游离氨基(–nh2)的测定采用茚三酮显色法(赵新淮等，蛋白质水解物水解度的测定，食品科学，1994(11):65-67)。其原理是：茚三酮与西兰花叶蛋白水解液中氨基酸的α-氨基反应产生蓝色化合物，这种蓝色的化合物在570nm具有特定的吸收峰，根据570nm处的吸光值求出水解后溶液中游离的–nh2基含量。

标准溶液的测定和标准曲线的制作

标准溶液的测定和标准曲线的制作依据赵新淮等人的方法进行(赵新淮等，蛋白质水解物水解度的测定，食品科学，1994(11):65-67)。

精确称取0.1000g干燥后的甘氨酸，溶解并稀释到100ml，再从中取出2.00ml并稀释至100ml，此时溶液的浓度为20μg/ml。取此溶液再分别稀释，配制成含量为2～20μg/ml的溶液用于标准曲线绘制。取2.0ml测定用稀释液于试管中加入1.00ml显色剂，并放在沸水浴中加热15min并冷却，同时做空白试验。之后再加入5.0ml40％的乙醇溶液并混合均匀，静置15min后，用1cm比色杯，以空白为参比，在波长570nm处测定各个溶液的吸光值(x)，并记录吸光值。依据各个溶液的吸光值制作甘氨酸浓度的标准曲线。

实施例3水解试验

水解试验步骤及水解度的计算

将适量的西兰花叶蛋白原料在磁力搅拌器上边搅拌边加入蒸馏水，制成一定浓度的悬浮液，用1mol/l的naoh调节至设定的ph值，添加设定浓度的诺维信复合蛋白酶，置于恒温振荡培养箱反应一定时间进行酶解。酶解结束后沸水浴10min使酶失活，待冷却至室温后，在6000r/min的转速下离心20min，取上清液0.5ml，加入蒸馏水定容至50ml。取0.4ml稀释液于试管中，加入1.6ml蒸馏水、1ml显色剂，混匀，放在沸水浴中加热15min并冷却，同时做空白试验。之后再加入5.0ml40％的乙醇溶液并混合均匀，静置15min后，用1cm比色杯，以空白为参比，在波长570nm处测定各个溶液的吸光值(x)，并记录吸光值。利用甘氨酸标准曲线计算水解液中–nh2的含量(mg/ml)，然后依据甘氨酸的分子量(75.07)换算成mmol/ml，计算西兰花叶蛋白的水解度。

水解度(degreeofhydrolysis，简称dh)为原料蛋白质中肽键被裂解的百分数，表示蛋白质被酶催化水解的程度。

根据水解后溶液中游离的–nh2基数量按照下述公式计算出水解度。

水解度(dh)＝h/htot×100％

式中，h为水解后每g蛋白质原料被裂解的肽键数，单位mmol/g；htot为每g蛋白质原料的肽键毫摩尔数，单位mmol/g。

即，

实施例4西兰花叶蛋白酶解单因素试验

酶解体系的基准条件为：酶浓度0.2g酶/g西兰花叶蛋白原料，ph为7，底物浓度6％，酶解温度40℃，酶解时间6h。上述底物浓度是指西兰花叶蛋白原料的浓度。每个条件均设置3个重复，取平均值。

按照以下条件对水解条件的单个因素的条件进行变化，设计西兰花叶蛋白酶解单因素试验。

(1)酶浓度：设计0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3g酶/g西兰花叶蛋白原料，共计六个实验条件。

(2)底物浓度：设计2、4、6、8、10、12、14、16％，共计八个实验条件。

(3)温度：设计30、40、50、60、70℃，共计五个实验条件。

(4)ph值：设计5、6、7、8、9，共计五个实验条件。

(5)时间：设计2、4、6、8、10h，共计五个实验条件。

以下分别说明西兰花叶蛋白单因素试验结果。

4.1酶浓度对酶解反应的影响

图1表示酶浓度对西兰花叶蛋白水解度的影响。水解的基本趋势是，随着酶浓度的增加，水解度越来越高，但0.25g酶/g西兰花叶蛋白原料以后，增长趋势变缓。从水解度和成本角度考虑，以0.3g酶/g西兰花叶蛋白原料为佳。

4.2底物浓度对酶解反应的影响

图2表示底物浓度对西兰花叶蛋白水解度的影响。

酶解反应中，高浓度的底物不利于酶解平衡向水解方向移动，对酶水解反应起了抑制作用，原因是高浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子扩散性，从而降低了酶促反应速度。本试验中，底物浓度超过2％以后，水解度迅速下降。之后趋于平稳。考虑到过低的底物浓度不利于水解产物的浓缩和干燥，因此，以2％(2g/100ml)作为最佳底物浓度。

4.3温度对酶解反应的影响

图3表示酶解温度对西兰花叶蛋白水解度的影响。

本试验中，在30～50℃水解度趋于平稳，50～60℃迅速提高，之后又迅速下降。由此可见，酶解的适宜温度为60℃。

4.4ph值对酶解反应的影响

图4表示酶解初始ph值对西兰花叶蛋白水解度的影响。

在本试验设定的ph范围5～9内，随着ph值的升高，水解度直线上升。因此，适宜ph值取ph＝9。

4.5酶解时间对酶解反应的影响

图5表示酶解时间对西兰花叶蛋白水解度的影响。

随着时间的延长，水解度逐渐升高。但在最初的6h水解度平缓上升，6h以后增长加快，8h后趋于平稳，10h最高。在生产中可根据实际需要，延长水解时间。

实施例5西兰花叶蛋白酶解正交试验设计

为了进一步优化酶解反应条件，本发明对酶浓度、ph、温度和时间4个因素通过正交试验进行评估。各实验条件中底物浓度皆设置为2％。

表2表示正交试验设计的实验条件，实验因素为酶浓度、ph、温度和时间，每个实验因素设定3个实验水平。

表2正交试验设计

表3为正交试验设计表，实验号1～9分别对应表1中各因素的实验水平。

表3正交试验表(l3⁴)

西兰花叶蛋白正交验结果如表4所示。

表4西兰花叶蛋白酶解工艺正交试验结果分析

依据本实验正交试验结果，酶浓度对酶解反应的影响最大，其次是酶解时间、ph值和酶解温度。其中，酶浓度、酶解时间对水解度影响显著(p＜0.05)。因素a、b、c、d的最优水平分别为2、1、2、3，最优水平与正交试验的试验号4的试验条件一致。试验结果显示试验号4的水解度最高，为52.45％。

结论

水解度是判断西兰花叶蛋白酶解效果的重要指标。本试验中确定西兰花叶蛋白的最佳水解工艺条件为：酶浓度0.3g酶/g西兰花叶蛋白原料，ph值8，反应温度55℃，反应时间5h，底物浓度2％。在此条件下，西兰花叶蛋白的水解度为52.45％。在实际生产上，也可以考虑延长水解时间至6～8h，以提高水解率。