用于治疗口腔感染性疾病的酿酒酵母布拉迪变种菌株的制作方法

母专利申请本专利申请要求于2018年12月19日提交的法国专利申请号fr1873321的优先权。该法国专利申请的内容通过引用整体并入。本发明涉及口腔健康领域。更特别地，本发明涉及单独使用的酿酒酵母布拉迪变种(saccharomycescerevisiaevar.boulardii)菌株，或其与灭活干燥的酿酒酵母的组合，其用于治疗和/或预防口腔感染性疾病，诸如龋齿和牙周病。
背景技术：
：在人类中，口腔是一个复杂的生态系统，其向内部开放，并且栖居着众多微生物，包括检测到的700多种细菌(ghannoumetal.,plospathog.,2010；6:e1000713；marshetal.,periodontol.,2000,55:16-35；pasteretal.,periodontol.,2000,42:80-87)。对于给定的个体，常驻细菌物种的数量从150到250不等。这些物种中的大多数是共生的，并且是维持生态系统平衡所必需的。但是，在某些情况下(高碳水化合物摄入、烟草使用或生理变化，诸如衰老、青春期或怀孕等)，这种平衡会发生破坏，并可能导致产生口腔感染性疾病。口腔的主要感染性疾病是龋齿和牙周病。龋齿是一种多细菌疾病，表现为牙齿硬组织脱矿质。这种脱矿质是由于牙菌斑中存在的发酵细菌产生酸。变形链球菌和乳酸杆菌被认为是主要的致龋菌。世界卫生组织(who)关于口腔健康的报告指出，龋齿的患病率很高，特别是在最年轻的人群中。与世界其他地区相比，发达国家(北美、澳大利亚、欧洲、日本)儿童患龋齿的风险要高得多，因为这些国家的饮食含糖量非常高。牙周病是一组影响牙周组织(即支撑牙齿的组织-骨骼和牙龈粘膜)的疾病。这些疾病分为两大类：牙龈炎和牙周炎。牙龈炎是任何局限于浅表牙周组织的炎症。牙周炎是牙周组织的晚期感染性病变，常继发于牙龈炎。某些细菌的存在和强烈的炎症反应会导致牙周组织的破坏。从健康状态到牙周病状态的变化伴随着逐渐过渡到富含厌氧菌和革兰氏阴性菌的菌群。这种现象称为厌氧漂移。牙周病中最常见的细菌种类包括：具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)和牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)，它们的共聚集似乎提高了它们的存活率和致病性(diazetal.,microbiology,2002,148:467-472；saitoetal.,femsimmunol.med.microbiol.,2008,54:349-355；polaketal.,j.clin.periodontol.,2009,36:406-410)。仅影响牙釉质或牙本质的龋齿治疗包括用复合材料或银汞合金填充。当牙齿严重受损时，牙医会使用牙冠进行修复；如果神经受到影响，则必须进行根管治疗。未经治疗的龋齿继续发展，细菌最终会攻击牙根下的牙槽骨，导致疼痛的脓肿，其必须用抗生素治疗，然后进行机械治疗。抗生素还用于与刮治和根面平整、刮除术、牙科手术相结合来治疗牙周病，或作为单独的治疗以在这些常见的牙周手术之前和/或之后减少细菌。抗生素的大量使用引入了选择压力，导致产生耐药微生物群体以及治疗效果的普遍下降。这些耐药性(最初是零星的)已经变得巨大而令人担忧。一些细菌菌株已具有多重耐药性，即对若干种抗生素具有耐药性，而其他菌株已变得完全耐药，即对所有可用的抗生素都具有耐药性。幸运的是，后一种情况仍然很少见，但这种现象正在增加，并使医生陷入治疗僵局。因此，在当前不断增加且令人担忧的抗生素耐药性的背景下，科学家和卫生专业人员正在寻求确定新的治疗策略，包括治疗和/或预防口腔感染性疾病。发明简述本发明人惊奇地发现，与其他益生菌相比，酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株具有更强的抑制牙周和致龋因子生长的能力。例如，这些菌株之一是由申请人于2007年8月21日以保藏号i-3799保藏于cncm(collectionnationaledeculturesdemicroorganismes,25ruedudocteurroux,75724pariscedex15,france)的酵母菌株酿酒酵母布拉迪变种。本发明人还证明了酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株和干燥且灭活形式的酿酒酵母菌株之间的协同作用，以显著抑制某些牙周和致龋病原体的生长。例如，一种该酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株是上文已经描述的保藏号为i-3799的菌株。例如，该酿酒酵母菌株是由申请人于2007年10月17日以保藏号i-3856保藏于cncm的酿酒酵母菌株。因此，本发明的目的在于酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株的组合，其用于预防和/或治疗受试者的口腔感染性疾病。在某些实施方案中，该酿酒酵母布拉迪变种酵母是干燥的活的形式。在某些实施方案中，该酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株是于2007年8月21日以保藏号i-3799保藏于cncm的菌株。在某些实施方案中，该酵母菌株酿酒酵母是于2007年10月17日以保藏号i-3856保藏于cncm的菌株。本发明还涉及包含如上文所定义的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株的组合的膳食补充剂，其用于预防和/或治疗受试者的口腔感染性疾病。在某些实施方案中，该膳食补充剂的形式为待吸入的锭剂、糖果、咀嚼口香糖、口腔分散粉末或待以棒状或小袋形式在水中稀释的粉末、待吸入或咀嚼的片剂、口香糖、胶囊、片剂、滴剂、带测量帽的小瓶。本发明还涉及包含如上文所定义的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株的组合的辅助药物或化妆品组合物，其用于预防和/或治疗受试者的口腔感染性疾病。在某些实施方案中，该辅助药物或化妆品组合物的形式为牙膏、漱口水、口腔喷雾、口腔乳膏或凝胶、口腔分散片、待直接喷入口腔的粉末、口腔分散粉末或待以棒状或小袋形式在水中稀释的粉末、带测量帽的小瓶。本发明还涉及药物组合物，其用于预防和/或治疗受试者的口腔感染性疾病，该药物组合物包含有效量的如上文所定义的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株的组合，和至少一种生理上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，该药物组合物旨在用于局部施用或口服施用。在某些实施方案中，该药物组合物进一步包含至少一种额外的药物活性成分，所述药物活性成分具有舒缓、抗刺激、镇痛、止痛、抗炎、愈合、抗生素、解热或抗真菌活性。本发明还涉及包含如上文所定义的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株的组合的牙科医疗装置，其用于预防和/或治疗受试者的口腔感染性疾病。在某些实施方案中，该牙科医疗装置是牙种植体、牙冠、牙桥、牙嵌体或假牙。在某些实施方案中，根据本发明的待预防或治疗的感染性疾病是龋齿、牙龈炎或牙周炎。在某些实施方案中，根据本发明的待预防或治疗的感染性疾病是医学治疗的副作用，或者在患有免疫缺陷的患者中存在或可能发生或复发，或者在孕妇、老人、儿童或患有高炎症表型的患者中存在。下文给出本发明某些优选实施方案的更详细描述。发明详述如上所述，本发明涉及具有抑制牙周病原和致龋因子生长能力的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株及其单独或与干燥且灭活的酿酒酵母组合在治疗和/或预防口腔感染性疾病中的用途。i-酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株表述“酵母菌株”是指相对同质的酵母细胞群体。从克隆获得酵母菌株，克隆是从单个酵母细胞获得的细胞群体。例如，可用于本发明上下文中的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株是本申请人于2007年8月21日以保藏号i-3799保藏于cncm(collectionnationaledeculturesdemicroorganismes,25ruedudocteurroux,75724pariscedex15,france)的菌株。这种酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株先前已由本申请人自己在wo2009/103884中描述，其中提出它可用于预防和/或治疗肠道的病理、病症或疾病。在本发明的上下文中，酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株是通过培养(或增殖)起始菌株获得的酵母细胞形式。可以通过任何合适的方法培养酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株。用于培养酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株的方法是本领域已知的，技术人员知晓如何根据其性质优化每个菌株的培养条件。例如，酵母细胞可以如参考书“yeasttechnology”,2ndedition,1991,reedandnagodawithana,publishedbyvannostrandreinhold(isbn0-442-31892-8)”所述，通过在培养基中增殖酿酒酵母布拉迪变种菌株获得。因此，例如，在工业规模上，可用于本发明上下文中的酿酒酵母布拉迪变种酵母可通过包括以下步骤的方法获得：-在培养基中分几个步骤培养酿酒酵母布拉迪变种菌株(例如菌株编号i-3799)，首先在半厌氧条件下，然后在有氧条件下(富氧培养基/大气)，以获得起始酵母细胞的增殖；-和通过离心分离由此产生的酵母细胞以获得含有12％-25％酵母干物质的液体酵母膏。本发明上下文中使用的酿酒酵母布拉迪变种酵母是活酵母的形式。术语“活酵母”与“活性酵母”同义，是指具有代谢活性的酵母细胞群体。本发明上下文中使用的活酵母是干酵母的形式。干酵母的特征在于低含水量，并且通常包含大于90％的酵母干物质含量，优选包含92％-98％的干物质含量，例如包含94.5％-96.5％的干物质含量。干酵母的优点之一是其储存期长。因此，用于制备酿酒酵母布拉迪变种酵母的方法还可以包括随后的干燥步骤，以获得干燥形式的酵母。该干燥步骤之后可以进行或可以不进行研磨操作。干燥可以是例如冷冻干燥、流化床干燥、滚筒干燥或喷雾干燥。在冷冻干燥的情况下，可以使用麦芽糖糊精或乳糖类载体。ii-酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株与干燥灭活的酿酒酵母菌株的组合如上所述，本发明人已经证明了酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株(例如保藏号为i-3799的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株)和干燥灭活形式的酿酒酵母菌株之间的协同，以显著抑制牙周病菌和致龋菌的生长。术语“协同”和“协同作用”在本文中可互换使用，是指两种酵母菌株的协调作用产生的效果大于它们独立作用时预期效果的总和，或产生它们各自单独作用无法达到的效果。与酿酒酵母布拉迪变种酵母组合使用的酿酒酵母是干燥灭活的酵母。术语“灭活酵母”和“失活酵母”在本文中可互换使用，是指不再存活的酵母，即其代谢已不可逆转地停止的酵母。可以通过任何合适的方法获得根据本发明的灭活酵母。本领域技术人员熟知的合适技术包括酵母的热处理、喷雾处理、滚筒干燥或这些处理的任何组合。灭活酵母通常以干燥形式存在。干酵母的特征在于低含水量，并且通常包含大于90％的酵母干物质含量，优选包含92％-98％的干物质含量，例如包含94.5％-96.5％的干物质含量。干酵母的优点之一是其储存期长。组合中使用的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株可以是任何酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株。组合中使用的干燥灭活的酿酒酵母菌株可以是任何酿酒酵母菌株。在某些具体实施方案中，在本发明的上下文中以灭活干燥形式与酿酒酵母布拉迪变种菌株组合使用的酿酒酵母菌株是于2007年10月17日以保藏号i-3856保藏于cncm的的酿酒酵母菌株。这种酿酒酵母菌株先前已由本申请人自己描述于wo2009/103884中，其中它被描述为可用于预防和/或治疗肠道的病理、障碍或疾病；并且描述于wo2014/009656中，其中它被描述为有效控制阴道念珠菌过度生长和预防阴道或外阴阴道念珠菌病的复发。在某些具体实施方案中，在本发明的上下文中与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株组合使用的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株是于2007年8月21日以保藏号i-3799保藏于cncm的的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株。如本文所用，术语“组合”是指酿酒酵母布拉迪变种(例如菌株保藏号i-3799)和灭活干燥形式的酿酒酵母(例如菌株保藏号i-3856)的混合物。该混合物可以以任何比例制备。因此，优选地，该组合包含范围从约90:10(w/w＝重量/重量)至约10:90(w/w)的酿酒酵母布拉迪变种i-3799与灭活干燥形式的酿酒酵母的比率。因此，酿酒酵母布拉迪变种i-3799与灭活干燥形式的酿酒酵母的比率可以是例如约90:10(w/w)、约80:20(w/w)、约70:30(w/w)w)、约60:40(w/w)、约50:50(w/w)、约40:60(w/w)、约30:70(w/w)、约20:80(w/w)或约10:90(w/w)。如本文所用的关于数字的术语“约”通常包括在数值的任一方向(大于或小于该数值)落入10％范围内的数值，除非该数值超过可能数值的100％。在本发明的某些具体实施方案中，灭活干燥形式的酿酒酵母布拉迪变种i-3799与酿酒酵母i-3856的比率为约50:50(w/w)。iii-酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株及其组合在治疗和/或预防口腔感染性疾病中的用途因此，本发明涉及酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株(例如菌株保藏号i-3799)或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合，其用于治疗和/或预防口腔感染性疾病。本发明还涉及用于治疗和/或预防受试者口腔感染性疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3799)，或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合的步骤。本发明还涉及酿酒酵母布拉迪变种菌株(例如菌株保藏号i-3799)或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合在制备用于治疗和/或预防口腔感染性疾病的药物产品中的用途。在本发明的上下文中，“治疗”是指一种方法，其目的是：(1)延迟或预防疾病或临床病症的发作；(2)减缓或者停止疾病症状的发展、加重或者恶化；(3)提供疾病症状的改善；和/或(4)治愈疾病。治疗可以在疾病发作之前进行，以起到预防作用(称为“预防”)，或者可以在疾病开始之后进行治疗，以起到治疗作用。术语“受试者”在此是指哺乳动物，更特别是指人，其有可能成为口腔感染的受害者，但不必定具有这种感染。术语“受试者”并不指特定年龄，因此包括新生儿、儿童、青少年、成人和老年人。当受试者患有(即已被诊断为患有)口腔感染性疾病时，本文有时使用术语“患者”而不是“受试者”。术语“口腔感染性疾病”是指由病原微生物感染引起的口腔局部疾病。口腔感染性疾病包括龋齿和牙周病。术语“蛀齿”或“龋齿”是指对牙釉质、牙本质和/或牙髓/骨质造成损害的牙齿感染性疾病。致龋菌，即促进龋齿发展的细菌，包括：变形链球菌(其促进光滑和近端表面龋齿)；变形链球菌和乳酸杆菌(其促进裂隙龋)；粘稠放线菌和内氏放线菌(其促进牙根龋齿和牙本质和牙根的定植)；和乳酸杆菌(其促进牙本质和牙根的定植)。牙齿定植从链球菌开始，然后是放线菌，最后是乳酸杆菌。细菌优势随病变深度而变化。变形链球菌与初始病变有关，而乳酸杆菌则出现在较深的病变中。还已知以下病原体与龋齿的发生有关：远缘链球菌和乳酸杆菌。术语“牙周病”是指影响牙齿的支持组织，即骨骼和牙龈的疾病和病理病症。这些是由致病菌及其毒素在牙齿周围的牙龈线上积聚引起的感染。主要的牙周病是牙龈炎和牙周炎。牙龈炎是牙齿周围牙龈的炎症。该病症在治疗后是可逆的。另一方面，牙周炎是一种更严重的病理，它会破坏牙龈和支撑牙齿的骨骼。例如，以下细菌也已知与牙周病的发生有关：牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)、齿状密螺旋体(treponemadenticola)、福赛斯坦纳菌(tannerellaforsythensis)、聚集性放线菌(aggregatibacteractinomycetemcomitans)、伴放线放线杆菌(actinobacillusactinomycetemcomitans)、溶牙放线菌(actinomycetesodontolyticus)、内氏放线菌(actinomycetesnaeslundii)、具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)、直肠弯曲杆菌(campylobacterrectus)、微消化链球菌(peptostreptococcusmicros)、产黑色素普氏菌(prevotellamelaninogenica)、中间普氏菌(prevotellaintermedia)、二氧化碳噬菌体(capnocytophaga)、艾肯氏菌(eikenella)、拟杆菌门(bacteroidetes)、隐藏真杆菌(eubacteriumsaphenum)、牙髓假单胞菌(p.endodontalis)、栖牙普雷沃菌(prevotelladenticola)、微小单胞菌(parvimonasmicra)、龈沟产线菌(filifactoralocis)、desulfobulus种和互养菌门种(synergistetes)。根据guerra等人的荟萃分析，在人口腔微生物组中已鉴定出600种细菌。但是，口腔微生物组中53％的物种尚未确定，并且35％的物种不可培养。根据本发明的用于治疗和/或预防口腔感染性疾病的方法包括向受试者施用有效量的酿酒酵母布拉迪变种菌株(例如菌株保藏号i-3799)或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合。可以以一剂或多剂施用的有效量可由医师或牙医确定。确切的施用量可以因患者而异，取决于患者的年龄、体重和一般状况、龋齿或牙周病的严重情况和/或程度等。施用的有效量也可根据所需的治疗效果(即预防口腔感染性疾病或治疗口腔感染性疾病)而变化。优选地，施用酿酒酵母布拉迪变种(例如菌株保藏号i-3799)或其与灭活干燥形式的酿酒酵母(例如菌株保藏号i-3856)的组合是对口腔具有局部作用的口服施用，但是，在某些实施方案中，酵母(或组合)可吞咽(见下文)。例如，干燥形式的酿酒酵母布拉迪变种酵母(例如菌株保藏号i-3799)与灭活干燥形式的酿酒酵母(例如菌株保藏号i-3856)的组合的剂量可以是1mg-10g，优选100mg-5g的混合物。活酿酒酵母布拉迪变种酵母的推荐浓度可以为1·107-1·1011cfu/g，并且优选地为5·108-1·1010cfu/g。根据本发明的治疗方法可用于治疗口腔感染性疾病特别是牙龈炎或牙周炎的首次发作，或复发。在任何一种情况下，患者之前可能已经接受过标准抗生素治疗。或者，酿酒酵母布拉迪变种(例如菌株保藏号i-3799)，或其与酿酒酵母(例如菌株保藏号i-3856)的组合，可以是针对患者的首次治疗。根据本发明的治疗方法还可用于预防患者的口腔感染性疾病，无论口腔感染性疾病是首次发作还是复发。接受已知会引起牙周障碍的药物治疗的患者可能就是这种情况，诸如免疫抑制剂、苯妥英(抗癫痫药)、钙通道阻滞剂(诸如硝苯地平(其适用于治疗各种心脏病，诸如心绞痛、心律失常和高血压))。这也可能发生在具有免疫脆弱性的患者身上，例如，与诸如干燥综合征、hiv感染、不受控制的糖尿病、某些内分泌失调、营养不良或吸收不良(诸如维生素b缺乏症)相关的疾病。对于唾液流量减少的患者(例如某些老年人)，情况也可能如此。吸烟者或处于压力下的人也可能如此。对于在怀孕初期就开始预防口腔疾病的孕妇来说，情况也是如此。最后，具有高炎症表型(即具有通过响应相同强度的攻击而引起加剧的炎症反应的倾向，伴随促炎细胞因子(pge2、il-1、tnf)的过度产生，这些因子在牙周破坏中起主要作用)的人也是如此。在某些实施方案中，根据本发明的治疗是单独施用的。换句话说，酿酒酵母布拉迪变种酵母(例如菌株保藏号i-3799)，或其与灭活干燥形式的酿酒酵母(例如菌株保藏号i-3856)的组合，是唯一待施用的试剂，可能的消毒漱口水除外。在其他实施方案中，根据本发明的治疗与另一种疗法联合施用，例如与标准抗生素或防腐剂，和/或与机械或外科手术(诸如刮治、根面平整、刮除、填充、修复或根管治疗)联合施用。iv-膳食补充剂、化妆品和药物组合物如上所述，酿酒酵母布拉迪变种菌株(例如菌株保藏号i-3799)，或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合，可以原样或作为制剂或组合物施用。因此，在某些实施方案中，酿酒酵母布拉迪变种菌株(例如菌株保藏号i-3799)，或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合存在于为待吸入的锭剂、糖果、咀嚼口香糖、口腔分散粉末或待以棒状或小袋形式在水中稀释的粉末、待吸入或咀嚼的片剂、口香糖、胶囊、片剂、滴剂、带测量帽的小瓶等形式的膳食补充剂中。在其它实施方案中，酿酒酵母布拉迪变种菌株(例如菌株保藏号i-3799)，或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合存在于为牙膏、漱口水、口腔喷雾、乳膏或口腔凝胶、口腔分散片、待直接喷入口腔的粉末、口腔分散粉末或待以棒状或小袋形式在水中稀释的粉末、带测量帽的小瓶等形式的辅助药物(或化妆品)组合物中。又在其他实施方案中，酿酒酵母布拉迪变种菌株(例如菌株保藏号i-3799)或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合与至少一种生理学上可接受的赋形剂一起存在于药物组合物中。因此，更具体地，根据本发明的药物组合物包含有效量的酿酒酵母布拉迪变种酵母菌株(例如菌株保藏号i-3799)或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合，以及至少一种生理上可接受的赋形剂。根据本发明的药物组合物可分类为可通过处方或非处方获得的药物制剂。在本发明的上下文中，“生理学上可接受的赋形剂”被理解为是指不干扰活性成分(本文中指，酿酒酵母布拉迪变种菌株或其组合)的生物活性功效，并且在施用浓度下不会对患者或受试者产生过度毒性的任何介质或添加剂。生理学上可接受的赋形剂可以是适合施用于哺乳动物，特别是人的赋形剂。根据本发明的药物组合物可以使用剂量和施用途径的任意组合施用，以有效实现所需的治疗/预防效果。已如上所述，施用的确切量可能因患者而异，具体取决于患者的年龄、体重和一般情况、口腔感染的严重情况和程度以及相关口腔疾病的性质(龋齿、牙龈炎、牙周炎)等。施用途径(局部或全身)可以根据细菌感染的严重性和程度和/或根据患者的年龄和/或健康状况进行选择。例如，本发明的目的是如上定义的药物组合物，其使用量为1mg-10g，优选为100mg-5g的酿酒酵母布拉迪变种酵母(例如菌株保藏号i-3799)与灭活干燥形式的酿酒酵母(例如菌株保藏号i-3856)的组合，该量可以每天施用一次或多次。酿酒酵母布拉迪变种酵母的推荐浓度可以为1·107-1·1011cfu/g，优选为5·108-1·1010cfu/g。根据本发明的药物组合物的制剂可以根据施用途径和组合物意欲使用的剂量而变化。在用至少一种生理上可接受的赋形剂配制后，本发明的药物组合物可以为任何适合施用于人的形式，例如为片剂、糖包衣丸剂、胶囊剂、滴剂、糖浆剂、乳剂、软膏剂、糊剂、凝胶剂、粉剂、小袋剂、可注射溶液剂等的形式。本领域知晓如何选择最合适的载体和赋形剂，从而制备给定类型的制剂。根据本发明的组合物可以进一步包含添加剂，诸如防腐剂、甜味剂、调味剂、粘度剂、染料、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂等。在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物仅包含一种活性剂：酿酒酵母布拉迪变种酵母(例如菌株保藏号i-3799)或其与灭活干燥形式的酿酒酵母的组合(例如菌株保藏号i-3856)。特别地，该药物组合物不包含另一种活微生物或活微生物的组合。在其他实施方案中，根据本发明的药物组合物进一步包含至少一种额外的药物活性成分(即，除了酿酒酵母布拉迪变种酵母或组合的酵母之外)。“药物活性成分”应理解为是指任何化合物或物质，其施用具有治疗效果，或者其施用对施用其的患者或受试者的健康或一般状况具有有益效果。因此，药物活性成分可以对通过施用药物组合物来预防或治疗的口腔细菌感染具有活性；或者可以对与口腔感染性疾病相关的病症或症状(例如疼痛或发烧或口臭)具有活性；或可以增加药物组合物的活性成分的可用性和/或活性。可存在于本发明组合物中的活性药物成分的实例包括但不限于具有舒缓、抗刺激、镇痛、止痛、抗炎、愈合、抗生素、解热或抗真菌活性等(对酿酒酵母布拉迪变种酵母或其与灭活干燥形式的酿酒酵母的组合没有影响)的活性成分。在其他实施方案中，酿酒酵母布拉迪变种菌株(例如菌株保藏号i-3799)或其与灭活干燥形式的酿酒酵母菌株(例如菌株保藏号i-3856)的组合存在于牙科医疗装置之上/之中：例如牙种植体、牙冠、牙桥、牙嵌体、假牙等。除非另有定义，本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。类似地，本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用并入。实施例以下实施例描述了本发明的某些实施方案。但应理解，这些实施例和附图仅作为说明而提供，决不限制本发明的范围。附图说明图1：在以下致病菌种存在下，使用保藏号为i-3856的酿酒酵母菌株获得的光晕(halo)结果(a)：具核梭杆菌(fn)、中间普氏菌(pi)、聚集性放线菌(aa)、牙龈卟啉单胞菌(pg)；在以下致病菌种存在下，使用保藏号为i-3799的酿酒酵母布拉迪变种菌株获得的光晕结果(b)：具核梭杆菌(fn)、中间普氏菌(pi)、聚集性放线菌(aa)、和牙龈卟啉单胞菌(pg)；(a)在有氧条件下或(b)在厌氧条件下。图2：保藏号为i-3856的酿酒酵母菌株(i-3856)；保藏号为i-3799的酿酒酵母布拉迪变种菌株(布拉迪)；以及对照(control)对14物种-生物膜中不同细菌种类的作用，包括4种牙周病原体(a到d)，和2种龋齿病原体(e和f)：(a)聚集性放线菌(aa)、(b)具核梭杆菌(fn)、(c)牙龈卟啉单胞菌(pg)、(d)中间普氏菌(pi)、(e)变形链球菌(sm)、(f)远缘链球菌。数值代表来自三次重复的平均值±se(n＝3)。*p<0.05vs.对照；**p<0.01vs.对照；***p<0.001vs.对照；****p<0.0001vs.对照。图3：保藏号为i-3856的灭活干燥形式的酿酒酵母(iy))；保藏号为i-3799的酿酒酵母布拉迪变种菌株(布拉迪)；保藏号为i-3856的灭活干燥形式的酿酒酵母菌株和保藏号为i-3799的酿酒酵母布拉迪变种菌株的组合(iy+布拉迪)；以及对照对14物种-生物膜中不同细菌种类的作用，包括4种牙周病原体(a到d)，和2种龋齿病原体(e和f)：(a)聚集性放线菌(aa)、(b)具核梭杆菌(fn)、(c)牙龈卟啉单胞菌(pg)、(d)中间普氏菌(pi)、(e)变形链球菌(sm)、(f)远缘链球菌。数值代表来自三次重复的平均值±se(n＝3)。*p<0.05vs.对照；**p<0.01vs.对照；***p<0.001vs.对照；****p<0.0001vs.对照；#p<0.05vs.nutri；$p<0.05vs.布拉迪。图4：lps攻击后通过原代人单核细胞，酿酒酵母布拉迪变种cncmi-3799酵母对以下不同炎症参数分泌的剂量反应曲线：(a)il-6、(b)il-8、(c)il-10、(d)mcp-1、(e)pge-2和(f)异前列烷。数值代表对三个供体进行的重复实验的平均值±se(n＝6)。***p<0.001vs.对照；****p<0.0001vs.对照。图5：通过原代人牙龈成纤维细胞，酿酒酵母布拉迪变种cncmi-3799酵母对以下不同炎症参数分泌的剂量反应曲线：(a)il-6、(b)il-8、(c)pge-2和(d)异前列烷。数值代表三个实验(n＝3)的平均值±se(n＝3)。***p<0.001vs.对照，****p<0.0001vs.对照。不同益生菌对牙周致病菌和致龋菌的作用a.测试的益生菌和牙周致病菌或致龋菌酵母产品在下文描述的研究中，评估了两种活的干酵母和一种灭活的干酵母。两种活酵母是：-保藏号为cncmi-3856的酿酒酵母菌株(由申请人于2007年10月17日在cncm保藏)，和-保藏号为cncmi-3799的酿酒酵母布拉迪变种菌株(上文已描述)。灭活的干酵母是：-灭活干燥形式的保藏号为i-3856的酿酒酵母菌株(上文已描述)。14-物种复杂生物膜的组成：牙周致病菌和致龋菌。使用的牙周致病菌包括：-中间普氏菌(之前称为中间拟杆菌)，其是一种涉及牙周感染(包括牙龈炎和牙周炎)的专性厌氧革兰氏阴性致病菌，常见于急性坏死性溃疡性牙龈炎；-牙龈卟啉单胞菌，其是一种在口腔中发现的厌氧、非运动性、革兰氏阴性、杆状致病菌，涉及某些形式的牙周病；-具核梭杆菌，其是一种厌氧、侵袭性、粘附性和炎症性细菌，对人口腔来说是外来的，并且由于其丰富性且能够与口腔中的其他物种结合的能力，通过作为牙周斑块的关键组成部分在牙周病中发挥作用；和-聚集性放线菌，它是一种小型、生长缓慢、兼性厌氧、革兰氏阴性细菌，属于人口腔生理菌群，并在牙周病中起作用。使用的致龋菌包括：-变形链球菌，其是一种革兰氏阳性球菌，是口腔共生菌群的一部分，在口腔中它与膳食糖结合(其转化为乳酸)导致龋齿；和-远缘链球菌，其是一种革兰氏阴性、非运动性、厌氧菌，大量存在于龋病患者的牙菌斑中。口腔共生细菌。本研究中使用的口腔共生细菌包括：血链球菌(streptococcussanguinis)；戈登链球菌(streptococcusgordonii)；唾液链球菌(streptococcussalivarius)；细链球菌(streptococcusmitis)；口腔链球菌(streptococcusoralis)；粘稠放线菌(actinomycesviscosus)；内氏放线菌(actinomycesnaeslundii)；和小韦荣球菌(veillonellaparvula)。b.酵母对6种致病菌种的抗菌活性方案。光晕技术用于检测和量化琼脂平板上共生菌和致病菌的抑制率。该技术是一项竞争性测试，其在于在琼脂平板上接种两个彼此靠近且每个含有不同细菌种类的点。然后，可以评估一种抑制另一种生长的能力。在琼脂平板上接种2种酵母(活)之一的培养物，在600nm处的光密度(od600)调整为0.5，其对应于大约108cfu/ml的浓度—bhi-2琼脂平板不含血红素、甲萘醌或血液。每个点含有7μl浓度为108cfu/ml的2种活酵母之一的培养物。有氧或厌氧培养24小时后，再次在琼脂平板上接种7μl致病菌种(具核梭杆菌(fn)、中间普氏菌(pi)、聚集性放线菌(aa)和牙龈卟啉单胞菌(pg))培养物24h，靠近含有酵母物种的点。总体而言，将琼脂平板在厌氧或有氧条件下孵育48小时。孵育48小时后，检查并校准抑制表面(用尺子)(表1)，并对每个琼脂板拍摄标准化照片(琼脂板和相机之间的距离)(图1)。用2种活酵母测试的病原体如下：具核梭杆菌(fn)、中间普氏菌(pi)、聚集性放线菌(aa)和牙龈卟啉单胞菌(pg)。结果。获得的结果如图1所示，并汇总在表1中。表1.酵母物种酿酒酵母布拉迪变种i-3799对某些口腔致病菌生长的抑制率(平均值±标准差，n＝3)。*sd＝标准偏差表1提供了某些口腔病原体的生长受到显著抑制的情况下测量的抑制距离。获得的结果表明，酿酒酵母布拉迪变种菌株在厌氧条件下显著抑制致病菌种中间普氏菌、聚集性放线菌和牙龈卟啉单胞菌的生长。此外，在有氧条件下，聚集性放线菌的生长也受到酿酒酵母布拉迪变种菌株的抑制。表1显示，与其他细菌和病原体相比，观察到在厌氧条件下中间普氏菌的生长受到最大程度的抑制。在图1中还观察到，酿酒酵母cncmi-3856菌株对致病菌种没有明显的抑制。结论：只有酿酒酵母布拉迪变种菌株抑制琼脂平板上口腔病原体的生长。c.酵母产品对包含14种物种的复杂生物膜组成的作用的评估。1)研究的活酵母的作用生物反应器方案。在biostatb反应器(sartorius，德国)中建立了一个多物种群落。将含有750mlbhi-2的培养基(脑心浸液肉汤(bhi)，补充有2.5g/l粘蛋白、1.0g/l酵母提取物、0.1g/l半胱氨酸、2.0g/l碳酸氢钠和0.25％(v/v)谷氨酸)以及5.0mg/ml血红素、1.0mg/ml甲萘醌和200μl/l消泡剂y-30(sigma，st.louis，usa)添加到生物反应器中。通过将100％的氮气(n2)和5％的二氧化碳(co2)鼓泡到混合物中，同时以300rpm的速度连续搅拌，在6.7±0.1的ph值下，将混合物在37℃下预还原24小时。24小时后，在1.4的光密度下添加变形链球菌(e)、远缘链球菌(f)、中间普氏菌(d)、牙龈卟啉单胞菌(c)、具核梭杆菌(b)和聚集性放线菌(a)的培养物并将其添加到生物反应器混合物中。前48小时不更换培养基，然后以200ml/24小时的速度更换。培养方案。将保藏号为i-3856的酿酒酵母菌株(i-3856)和保藏号为i-3799的酿酒酵母布拉迪变种菌株(布拉迪)的培养物在bhi-2(参见上述组合物)中调整(过夜进行)至600nm处的光密度(od600)为0.5(～1·108cfu/ml)。将1800μl的这些调整后的培养物的等分试样接种到每孔底部含有羟基磷灰石圆盘的24孔板上。将200μl来自生物反应器的14物种-生物膜混合物添加到每孔中。对照包含200μl的14-物种样品和1800μl的bhi-2。24孔板在微有氧条件(6％氧气)下孵育24小时。然后，去除上清液并用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤附着在羟基磷灰石盘上的生物膜。将生物膜用1500μl的0.05％胰蛋白酶-edta在37℃和230rpm下剥离45分钟，转移到埃彭多夫管中，并离心(6010×g，5分钟)。去除胰蛋白酶后，将生物膜沉淀(pellet)重悬于500μl的pbs中，按照qiagen说明书进行dna提取并通过qpcr分析。在活酵母上获得的结果。获得的结果显示在图2(a-f)中。观察到酿酒酵母布拉迪变种菌株能够显著抑制以下牙周致病菌：聚集性放线菌(a)、具核梭杆菌(b)、牙龈卟啉单胞菌(c)和中间普氏菌(d)，以及龋病菌变形链球菌(cariopathogenstreptococcusmutans)(e)。结论。生物膜实验证实了在多物种群落中酿酒酵母布拉迪变种菌株对口腔病原体的抑制活性，这已在上述琼脂平板实验中得到证实。2)菌株酿酒酵母布拉迪变种菌株i-3799(布拉迪酵母)、灭活干燥形式的酿酒酵母菌株i-3856(iy酵母)及其组合的作用37℃下，将酵母产品(布拉迪和iy)分别溶解在100mlpbs中，并涡旋3分钟。将10ml这些溶液以6010×g离心10分钟。去除上清液，通过将浓度调整为平均5·108cfu/ml，将“布拉迪”酵母沉淀悬浮在bhi-2中。将“iy”酵母沉淀悬浮在含有以1:5稀释的生物反应器混合物样品的溶液中。-将以下物质置于第一孔中：1ml悬浮在bhi-2中的“布拉迪”酵母溶液和1ml不含“iy”的以1:5稀释的生物反应器混合物(单独“布拉迪”条件)。-将以下物质置于第二孔中：1ml酵母溶液“iy”和以1:5稀释的生物反应器混合物和1ml不含“布拉迪”的bhi-2(单独iy条件)。-将以下物质置于第三孔中：1ml悬浮在bhi-2中的“布拉迪”酵母溶液和1ml的“iy”酵母溶液和以1/5稀释的生物反应器混合物(布拉迪+iy组合条件)。-将以下物质置于第四孔中：1ml的以1:5稀释的生物反应器混合物和1mlbhi-2。此孔构成对照孔。将24孔板在微氧条件下(6％氧气)孵育24小时。然后，去除上清液，并用pbs清洗附着在羟基磷灰石盘上的生物膜。在37℃、230rpm下，用1500μl的0.05％胰蛋白酶-edta剥离生物膜45分钟，转移至埃彭多夫管并离心(6010×g，5分钟)。去除胰蛋白酶后，将生物膜沉淀重悬于500μlpbs中，根据qiagen说明书进行dna提取并通过qpcr进行分析。结果。所得结果如图3和表2所示。表2。在酿酒酵母变种布拉迪菌株i-3799(布拉迪)、灭活干燥形式的酿酒酵母菌株i-3856(iy)以及它们的组合的存在下，生物膜的对照值和致病菌种值(以下简称δ)之差。致病菌种δiyδ布拉迪δiy+δ布拉迪的总和δiy+布拉迪组合aa0.460.380.841.1fn0.650.591.241.47pg0.320.20.520.77pi0.30.60.91.38sm0.510.430.941.4注：表2中的数值不是绝对值。它们是对照值与病原体值之差。这些结果表明，两种菌株中的每一种(酿酒酵母布拉迪变种(布拉迪)和灭活的酿酒酵母(iy)及其组合都能够显著抑制两种牙周病原体聚集性放线菌或aa(a)和具核梭杆菌或fn(b)和致龋菌变形链球菌或sm(e)的生长。此外，表2显示iy+布拉迪组合的δ大于单独取iyδ和布拉迪δ的总和。根据图3(c)，牙龈卟啉单胞菌或pg(c)的生长受到灭活的酿酒酵母(iy)以及组合的抑制，但不受酿酒酵母布拉迪变种菌株(布拉迪)的显著抑制。此外，可以观察到灭活酵母(iy)和布拉迪+iy组合之间抑制的显著差异，从而证明了该组合对牙龈卟啉单胞菌(c)生长抑制的协同作用，其由表2证实。根据图3(d)，中间普氏菌或pi(d)的生长被酿酒酵母布拉迪变种菌株以及组合抑制，但不受灭活酵母(iy)的显著抑制。此外，可以观察到布拉迪菌株和布拉迪+iy组合之间的抑制的显著差异，表明该组合对抑制中间普氏菌(d)的生长具有协同作用，其由表2证实。结论。因此，已经证明，与对口腔病原体生长的抑制谱较小的单独使用的酿酒酵母布拉迪变种菌株和灭活的酿酒酵母相反，在所使用的多物种模型中，显示酿酒酵母布拉迪变种菌株和灭活干燥的酿酒酵母菌株的组合诱导大多数病原体的生长抑制。酿酒酵母布拉迪变种i-3799的抗炎作用下文介绍的研究的目的是评估酵母酿酒酵母布拉迪变种cncmi-3799对原代人单核细胞和牙龈成纤维细胞的炎症参数的潜在抗炎作用。a.原代人单核细胞抗炎潜力的评估原代人单核细胞炎症参数的刺激和测定。从健康人献血者的血沉棕黄层中分离并富集了原代人单核细胞。将细胞接种在24孔板中(1ml中大约500000个细胞/ml)用于elisa实验。用lps(10ng/ml)将细胞孵育24小时。在lps处理前30分钟将酵母样品(5个剂量，范围从4.3e6cfu到4.3e8cfu/ml，即：0.1mg/ml；1mg/ml；2.5mg/ml；5mg/ml；10mg/ml)直接添加细胞培养物中。地塞米松用作阳性对照(2个剂量，1μm和10μm)。24小时后，去除上清液，离心并评估mcp-1、il-8、il-6、il-10、异前列烷和pge2的浓度。根据制造商的方案评估eia(pge2和异前列烷，来自cayman)或elisa(mcp-1、il-6和il-8，来自ebioscience)中的浓度。使用来自3个不同供体的血沉棕黄层研究每个剂量6次(每个血沉棕黄层n＝2，总共n＝6)。统计分析。使用dunnett多重比较检验的单向方差分析，显著性水平为0.5。结果。获得的结果如图4所示。这些结果表明酿酒酵母布拉迪变种cncmi-3799菌株在原代人单核细胞中具有剂量依赖性抗炎作用。更准确地说，酿酒酵母布拉迪变种cncmi-3799能够以2.5mg/ml(1e8cfu/ml)-10mg/ml(4.3e8cfu/ml)的剂量抑制il-6、il-10、mcp-1、pge-2和异前列烷的分泌，而细胞因子il-8在10mg/ml(4.3e8cfu/ml)的最小剂量下被抑制。在低剂量(0.1-1mg/ml或4.3e6-4.3e7cfu/ml)下，酿酒酵母布拉迪变种cncmi-3799能够刺激抗炎细胞因子il-10的分泌，表明具有“免疫训练”效应。在较高剂量下，促炎细胞因子和pge-2/异前列烷标志物的抑制表明抗炎作用和抑制涉及疼痛和骨骼破坏发展的前列腺素途径。b.原代人牙龈成纤维细胞的抗炎潜力的评估测量原代人牙龈成纤维细胞中的il-8、il-6、异前列烷和pge2。由provitro(berlin,germany)提供的原代人牙龈成纤维细胞的培养物根据供应商的方案进行维持。刺激前，将细胞接种在24孔板中进行elisa实验。将细胞在不存在(未刺激的对照)或存在il-1β(10u/ml)的情况下孵育24小时。在il-1β处理前30分钟以5个剂量(0.1mg/ml；1mg/ml；2.5mg/ml；5mg/ml；10mg/ml)(n＝3)添加酵母样品。地塞米松用作阳性对照(1个剂量，1μm)。24小时后，收集上清液，离心，并按照制造商的方案，通过eia(pge2和异前列烷，来自cayman)或elisa(il-6和il-8,来自ebioscience)评估il-6、il-8、异前列烷和pge2浓度。每个剂量研究至少3次。结果。获得的结果如图5所示。这些结果表明酿酒酵母布拉迪变种cncmi-3799菌株在原代人牙龈成纤维细胞中具有剂量依赖性抗炎作用。具体而言，酿酒酵母布拉迪变种cncmi-3799能够以1mg/ml(4.3e7cfu/ml)-10mg/ml(4.3e8cfu/ml)的剂量抑制il-6、il-8、pge-2和异前列烷的分泌。促炎细胞因子和pge-2/异前列烷标志物的抑制表明抗炎作用和抑制涉及疼痛和骨骼破坏发展的前列腺素途径。当前第1页12