葡萄糖氧化酶联合过氧化物酶在霉菌毒素脱毒中的应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及葡萄糖氧化酶联合过氧化物酶应用于霉菌毒素生物脱毒领域。

背景技术：

过氧化物酶(peroxidase，pod)是由微生物或植物产生的一类氧化还原酶，该类酶以过氧化氢为电子受体，催化底物发生氧化反应，其主要存在于载体的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物和烃类氧化产物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用。过氧化物酶包括染料脱色过氧化物酶(dye-decolorizingperoxidase,dyp)、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,hrp)、乳过氧化物酶(lactoperoxidase,lpo)、木质素过氧化物酶(ligninperoxidase,li)、锰过氧化物酶(manganeseperoxidase,mnp)、氯过氧化物酶(chloroperoxidase,cpo)和大豆过氧化物酶(soybeanperoxidase,sbp)等。

目前有报道来源于白腐真菌的锰过氧化物酶能够降解霉菌毒素，但是其需要以过氧化氢为底物，如果对粮食和饲料中的霉菌毒素进行脱毒无法引进过氧化氢则使锰过氧化物酶无法发挥降解毒素的作用。关于降解霉菌毒素的其他过氧化物酶类的研究报道相对较少。基于以上原因，我们提出联合应用葡萄糖氧化酶和过氧化物酶，以葡萄糖为底物用于霉菌毒素的生物脱毒。因为葡萄糖氧化酶在有氧条件下能专一性地催化β-d-葡糖生成过氧化氢和葡萄糖酸。生产的过氧化氢正好为过氧化物酶的底物，从而发挥过氧化物酶的作用。同时，我们也证实来源于芽孢杆菌的染料脱色过氧化物酶能够催化降解霉菌毒素。因此，为了进一步解决饲料和食品霉菌毒素污染问题，需推进一切切实可行的解毒脱毒方法用于实际生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种葡萄糖氧化酶god联合过氧化物酶pod在霉菌毒素脱毒中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述葡萄糖氧化酶god和过氧化物酶pod的复合酶。

本发明的另一目的在于提供上述复合酶在霉菌毒素脱毒中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种霉菌毒素的脱毒方法，具体涉及将葡萄糖氧化酶god和过氧化物酶pod联合应用于霉菌毒素脱毒领域。

上述脱毒方法中，将葡萄糖氧化酶god，与染料脱色过氧化物酶dyp、辣根过氧化物酶hrp、乳过氧化物酶lpo、木质素过氧化物酶lip、锰过氧化物酶mnp、氯过氧化物酶cpo和大豆过氧化物酶sbp中的一种或几种过氧化物酶混合配制，用于霉菌毒素脱毒领域。

优选为，葡萄糖氧化酶god和大豆过氧化物酶sbp、葡萄糖氧化酶god和辣根过氧化物酶hrp、葡萄糖氧化酶god和染料脱色过氧化物酶dyp联合应用于霉菌毒素脱毒；

更优选为，葡萄糖氧化酶god和染料脱色过氧化物酶dyp联合应用于霉菌毒素脱毒。

上述所述的葡萄糖氧化酶god和过氧化物酶pod的用量百分比可以为：1:1或1:2或1:3或1:4或1:5或1:6或1:7或1:8或1:9或1:10。

上述应用中，所述的霉菌毒素包括但不限于玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2、m1或m2、单端孢霉烯族类毒素(包括呕吐毒素、t-2毒素等)、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、展青霉素、胶霉毒素和杂色曲霉素中的一种或多种，优选为玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素b1和呕吐毒素。

上述应用中，所述的霉菌毒素的浓度为0.001-500mg/kg，葡萄糖氧化酶god的浓度为0.1u/ml-1u/ml，过氧化物酶pod的浓度为1u/ml-10u/ml。

本发明还提供一种复合酶，包括葡萄糖氧化酶god和过氧化物酶pod。

上述所述的过氧化物酶pod，包括但不限于染料脱色过氧化物酶dyp、辣根过氧化物酶hrp、乳过氧化物酶lpo、木质素过氧化物酶lip、锰过氧化物酶mnp、氯过氧化物酶cpo和大豆过氧化物酶sbp中的一种或几种。

上述所述的葡萄糖氧化酶god和过氧化物酶pod的用量百分比可以为：1:1或1:2或1:3或1:4或1:5或1:6或1:7或1:8或1:9或1:10。

上述所述的复合酶，还包括各种辅助过氧化物酶降解霉菌毒素的天然和合成介体，所述的介体包括但不限于乙酰丁香酮、丁香酸甲酯、乙酰香草酮、对香豆酸、丁香醛、肉桂醛、柠檬醛、紫苏醛、异戊醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚、香草酚、柠檬烯、γ-萜品烯、大蒜素、茴香脑、薄荷酮、沉香醇、芳樟醇、姜油酮、异硫氰酸酯、紫脲酸vio、2,2-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)abts、1-羟基苯并三唑hbt、2,2’,6,6’-四甲基呱啶氧化物tempo或多金属氧酸盐中的一种或多种，介体的用量占酶用量的1％-5％。

本发明还提供了上述复合酶在霉菌毒素脱毒中的应用。

上述应用中，所述的霉菌毒素包括但不限于玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2、m1或m2、单端孢霉烯族类毒素(包括呕吐毒素、t-2毒素等)、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、展青霉素、胶霉毒素和杂色曲霉素中的一种或多种，优选为玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素b1和呕吐毒素。

上述应用中，所述的霉菌毒素的浓度为0.001-500mg/kg，葡萄糖氧化酶god的浓度为0.1u/ml-1u/ml，过氧化物酶pod的浓度为1u/ml-10u/ml，介体的用量占酶用量的1％-5％。

上述应用中，所述的葡萄糖氧化酶god和过氧化物酶可以是通过基因工程技术外源表达的，也可以来源于市售。

本发明的优点和有益效果：

本发明第一次提出将葡萄糖氧化酶god和过氧化物酶pod联合应用于霉菌毒素脱毒领域。试验证实这两类酶复合应用能够降解多种霉菌毒素，特别对玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和呕吐毒素的脱毒效率高。这两种酶均可以自制，生产成本低，适合用于饲料和食品中霉菌毒素的生物脱毒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是本发明的复合酶降解玉米赤霉烯酮的效果；

图2是本发明的复合酶降解afb1的液相色谱图；

图3是本发明的复合酶降解呕吐毒素的液相色谱图；

图4是本发明的复合酶降解玉米赤霉烯酮的液相色谱图；

具体实施方式

本发明提供了一种联合应用葡萄糖氧化酶god和过氧化物酶pod用于霉菌毒素脱毒的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1葡萄糖氧化酶god和染料脱色过氧化物酶dyp联合应用对玉米赤霉烯酮的降解效果

染料脱色过氧化物酶dyp溶解在磷酸钠缓冲液(0.1m，ph7.0)中，取1ml染料脱色过氧化物酶dyp溶解液(酶活5u/ml)，分别加入0.0125、0.025、0.5、1、2、4和8u/ml葡萄糖氧化酶god，再加入200μm葡萄糖和zen，zen浓度达到10μg/ml；以未加入染料脱色过氧化物酶dyp的体系作为对照；在37℃下分别反应3h，加入1ml甲醇终止反应，采用高效液相色谱检测zen含量。

结果如图1所示，随着葡萄糖氧化酶god浓度增加，染料脱色过氧化物酶dyp对zen的降解率增加，当god的浓度为1u/ml时，染料脱色过氧化物酶dyp对zen的降解率达到68％。

实施例2一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god和辣根过氧化物酶hrp，按质量百分比1:3比例混合，制得降解霉菌毒素的复合酶；再将制得的复合酶用于降解黄曲霉毒素b1(afb1)，将1mg复合酶溶于1ml柠檬酸钠缓冲液(0.1m，ph6)反应体系，加入100μm葡萄糖，再加入afb1，afb1浓度为1μg/ml，在37℃下反应12h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测afb1含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与1μg/mlafb1反应12h，其对afb1的降解率为82％(图2)。

实施例3一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god和乳过氧化物酶lpo，按质量百分比1:4比例混合，再加入占酶量1％的介体abts，制得降解霉菌毒素的复合酶；再将制得的复合酶用于降解呕吐毒素(don)，将1mg复合酶溶于1ml柠檬酸钠缓冲液(0.1m，ph5.0)反应体系，加入200μm葡萄糖，再加入don，don浓度为20μg/ml，在37℃下反应24h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测don含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与20μg/mldon反应24h，其对don的降解率为63％(图3)。

实施例4一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god和染料脱色过氧化物酶dyp，按酶活比例1:5混合，制得降解霉菌毒素的复合酶。将制得的复合酶用于降解玉米赤霉烯酮(zen)，将含有0.5u葡萄糖氧化酶god和2.5u染料脱色过氧化物酶dyp的复合酶溶于1ml磷酸钠缓冲液(0.1m，ph8.0)反应体系，加入300μm葡萄糖，再加入zen，zen浓度为10μg/ml，在42℃下反应12h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测zen含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与10μg/mlzen反应12h，其对zen的降解率为96％(图4)。

实施例5一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god和染料脱色过氧化物酶dyp，按质量百分比1:3混合，制得降解霉菌毒素的复合酶。再将制得的复合酶用于降解玉米赤霉烯酮(zen)，将1mg的复合酶溶于1ml柠檬酸钠缓冲液(0.1m，ph6.0)反应体系，加入300μm葡萄糖，5mmabts，再加入zen，zen浓度为10μg/ml，在42℃下反应6h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测zen含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与10μg/mlzen在介体abts参与下反应6h，可降解100％的zen。

实施例6一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god和大豆过氧化物酶sbp，按质量百分比1:1比例混合，再加入占酶量2％的介体乙酰丁香酮，制得降解霉菌毒素的复合酶。再将制得的复合酶用于降解玉米赤霉烯酮(zen)，将1mg复合酶溶于1ml柠檬酸钠缓冲液(0.1m，ph4.0)反应体系，加入200μm葡萄糖，再加入zen，zen浓度为10μg/ml，在37℃下反应12h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测zen含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与10μg/mlzen反应12h，其对zen的降解率为86％。

实施例7一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god和木质素过氧化物酶lip，按质量百分比1:4比例混合，再加入占酶量1.5％的介体丁香醛，制得降解霉菌毒素的复合酶。再将制得的复合酶用于降解玉米赤霉烯酮(zen)，将1mg复合酶溶于1ml磷酸钠缓冲液(0.1m，ph7.0)反应体系，加入300μm葡萄糖，再加入zen，zen浓度为10μg/ml，在37℃下反应12h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测zen含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与10μg/mlzen反应12h，其对zen的降解率为88％。

实施例8一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god和锰过氧化物酶mnp，按酶活比例1:8混合，制得降解霉菌毒素的复合酶。再将制得的复合酶用于降解黄曲霉毒素b1(afb1)，将含有0.3u葡萄糖氧化酶god和2.4u锰过氧化物酶mnp的复合酶溶于1ml丙二酸钠缓冲液(0.1m，ph4.5)反应体系，加入100μm葡萄糖，1mmmnso4，再加入afb1，afb1浓度为1μg/ml，在37℃下反应12h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测afb1含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与1μg/mlafb1反应12h，其对afb1的降解率为90％。

实施例9一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god和氯过氧化物酶cpo，按质量百分比1:5比例混合，再加入占酶量0.8％的介体丁香醛和0.7％的介体乙酰丁香酮，制得降解霉菌毒素的复合酶。再将制得的复合酶用于降解呕吐毒素(don)，将1mg复合酶溶于1ml柠檬酸钠缓冲液(0.1m，ph6.0)反应体系，加入200μm葡萄糖，再加入don，don浓度为20μg/ml，在30℃下反应24h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测don含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与20μg/mldon反应24h，其对don的降解率为81％。

实施例10一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god、染料脱色过氧化物酶dyp和辣根过氧化物酶hrp，按质量百分比1:3:3比例混合，制得降解霉菌毒素的复合酶。再将制得的复合酶用于降解黄曲霉毒素b1(afb1)，将1mg复合酶溶于1ml柠檬酸钠缓冲液(0.1m，ph6.0)反应体系，加入100μm葡萄糖，再加入afb1，afb1浓度为1μg/ml，在37℃下反应12h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测afb1含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与1μg/mlafb1反应12h，其对afb1的降解率为85％。

实施例11一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god、染料脱色过氧化物酶dyp和木质素过氧化物酶lip，按酶活比例1:5:1混合，制得降解霉菌毒素的复合酶。将含有0.4u葡萄糖氧化酶god、2u染料脱色过氧化物酶dyp和0.4u木质素过氧化物酶lip的复合酶溶于1ml磷酸钠缓冲液(0.1m，ph8.0)反应体系，加入150μm葡萄糖，再加入zen，zen浓度为10μg/ml，在42℃下反应12h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测zen含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与10μg/mlzen反应12h，其对zen的降解率为90％。

实施例12一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god、染料脱色过氧化物酶dyp和乳过氧化物酶lpo，按酶活比例1:5:3混合，制得降解霉菌毒素的复合酶。再将制得的复合酶用于降解黄曲霉毒素b1(afb1)，将含有0.5u葡萄糖氧化酶god、2.5u染料脱色过氧化物酶dyp和1.5u乳过氧化物酶lpo的复合酶溶于1ml磷酸钠缓冲液(0.1m，ph7.0)反应体系，加入400μm葡萄糖，按总质量的1％加入abts(1mm)，再加入afb1，afb1浓度为1μg/ml，在37℃下反应24h，加入1ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用高效液相色谱检测afb1含量。

结果表明，降解霉菌毒素的复合酶与1μg/mlafb1反应12h，其对afb1的降解率为93％。

实施例13一种降解霉菌毒素的复合酶的制备方法及其应用

称取一定量的葡萄糖氧化酶god、染料脱色过氧化物酶dyp、辣根过氧化物酶hrp和大豆过氧化物酶sbp，按质量百分比1:2:1:2比例混合，再按总质量1％的比例混入介体丁香醛，制得降解霉菌毒素的复合酶。再将制得的复合酶用于降解α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、黄曲霉毒素b2、g1、g2、m1或m2、t-2毒素、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、展青霉素、胶霉毒素和杂色曲霉素。

将α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、afb2、afg1、afg2、afm1或afm2、t-2毒素、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、展青霉素、胶霉毒素和杂色曲霉素分别溶解到二甲基亚砜中，按如下反应体系进行试验：将1mg复合酶溶于1ml磷酸钠缓冲液(0.1m，ph8)，加入500μm葡萄糖，再加入毒素，其中α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮的浓度为10μg/ml，afb2、afg1、afg2、afm1或afm2、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、展青霉素、胶霉毒素和杂色曲霉素浓度为2μg/ml，t-2毒素浓度为20μg/ml；以未加入复合酶的体系作为对照；在37℃下分别反应24h后，加入1ml甲醇终止反应，采用高效液相色谱检测各毒素含量。降解霉菌毒素的复合酶对不同毒素的降解效率见表1。

表1降解霉菌毒素的复合酶对不同毒素的降解效率

实施例14降解霉菌毒素的复合酶对霉变饲料中zen的降解效果

称取一定量的葡萄糖氧化酶god、染料脱色过氧化物酶dyp、辣根过氧化物酶hrp、大豆过氧化物酶sbp和氯过氧化物酶cpo，按质量百分比1:1:1:1:2比例混合，再按总质量1.5％的比例混入乙酰丁香酮，制得降解霉菌毒素的复合酶。将1g复合酶、300μm葡萄糖，1g霉变饲料(2μg/gzen)溶于10mlph2.5的人工模拟胃液中，置于37℃水浴锅中，避光保温消化3h，然后用0.1mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至6.8，再加入10ml人工模拟肠液，置于37℃水浴锅中，避光保温消化8h，待消化完成后，加入20ml甲醇终止反应；以未加入复合酶的体系作为对照；采用免疫亲和柱-高效液相色谱方法检测体系中zen含量。

结果表明，复合酶能降解霉变饲料中73％的zen。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。