本发明属于生物技术领域，具体涉及微生物发酵饲料技术领域，具体涉及一种用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液、仔猪液态发酵饲料的制备方法和应用。
背景技术：
随着仔猪的断奶日龄不断提前，面临着“早期断奶综合征”的挑战，如得不到有效解决将使早期断奶失去预期价值。长久以来，人们习惯添加抗生素来增强仔猪的免疫能力，以此来控制腹泻等各种疾病。经过广泛和长期使用抗生素，抗生素带来的负面效应越来越多。在食品安全倍受关注的今天，世界各国人民纷纷禁用抗生素。如何能提高饲料的利用率，改善饲料风味，提高适口性，防治“断奶仔猪综合征”等方面亟需新的饲料出现。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液，液态仔猪饲料经过液体菌液的发酵，还原糖、乳酸含量明显增加，益生菌数明显增加，具有酸香味。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液，其包括芽孢菌液和乳酸菌液；所述芽孢菌液为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液；所述乳酸菌液为植物乳杆菌和粪肠球菌的混合菌液。
如上所述的用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液，优选地，所述芽孢菌和乳酸菌混合的体积份数比为2:1～3:1；所述地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合体积份数比为1:1，所述植物乳杆菌和粪肠球菌的混合体积份数比为1:2。
优选地，在混合前，所述地衣芽孢杆菌中的活菌数不少于4.3×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌中的活菌数不少于6.7×107cfu/ml；植物乳杆菌中的活菌数不少于5.6×109cfu/ml，所述粪肠球菌中的活菌数不少于3.4×109cfu/ml。
如上所述的用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液，优选地，所述地衣芽孢杆菌的菌种标号为cgmccno.18911，所述枯草芽孢杆菌的菌种标号为cgmccno.18912，所述植物乳杆菌的菌种编号为cgmccno.18915，所述粪肠球菌的菌种编号cgmccno.18916。
本发明的另一目的是提供一种仔猪液态发酵饲料制备方法，目的在于提高饲料的利用率，改善饲料风味，提高适口性，能取代抗生素的添加及防治“断奶仔猪综合征”等方面。
一种仔猪液态发酵饲料，其是采用如上所述用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液对植物性原料发酵获得的饲料。
如上所述的仔猪液态发酵饲料的制备方法，其包括如下步骤：
(1)、制备如上所述的用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液；
(2)、将植物性原料粉碎，与水混合均匀，加热到100℃，维持时间10min；
(3)、待温度降到30℃左右，按体积l与重量kg为4％～6％接种步骤(1)制备的液体菌液，混合均匀后装入桶内发酵；20～30℃发酵3～5天。
如上所得的制备方法，优选地，在步骤(1)中，制备如上所述的用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液按如下进行：将植物乳杆菌和粪肠球菌分别用mrs培养基于40℃培养箱静置培养36h，分别获得植物乳杆菌液和粪肠球菌液；将地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别用lb培养基于37℃摇床180r/min，培养18h，分别获得植物乳杆菌液和粪肠球菌液；
将获得植物乳杆菌液和粪肠球菌液按体积份数比为1:2混合获得乳酸菌液，将地衣芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液按体积份数比为1:1混合获得芽孢菌液，将所述芽孢菌液和所述乳酸菌液按体积份数比为2:1～3:1，混合获得用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液。
如上所得的制备方法，优选地，在步骤(1)中，混合前，所述地衣芽孢杆菌的菌液中活菌数不少于4.3×107cfu/ml，所述枯草芽孢杆菌的菌液中活菌数不少于6.7×107cfu/ml，所述植物乳杆菌的菌液中活菌数不少于5.6×109cfu/ml，所述粪肠球菌的菌液中活菌数不少于3.4×109cfu/ml。
如上所得的制备方法，优选地，在步骤(2)中，所述植物性原料为按质量分数计玉米45％～70％、去皮豆粕25％～45％、预混料5％～10％的原料，混合后粉碎备用；其中，预混料配方为按质量分数计：次粉61.24％、麸皮22.30％、氯化胆碱0.41％、希杰蛋氨酸0.65％、赖氨酸0.42％、磷酸氢钙6.37％、石粉5.43％、食盐0.59％、植酸酶0.16％、乙氧基喹啉0.20％。
如上所得的制备方法，优选地，在步骤(2)中，所述植物性原料为按质量分数计玉米59％、去皮豆粕32.5％、预混料8.5％的原料。
如上所得的制备方法，优选地，在步骤(2)中，所述植物性原料混合后，粉碎过40目，留细粉备用。
如上所得的制备方法，优选地，在步骤(2)中，所述植物性原料按质量kg与水按体积l的比为1:3～1:4.5(w/v，kg/l)进行配比。
如上所述的仔猪液态发酵饲料或由上述制备方法获得仔猪液态发酵饲料在喂养保育期仔猪中的应用。
如上所述应用优选为采用猪液态发酵饲料替代50％全价粉料进行。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液在提高饲料的利用率，改善饲料风味方面的应用。特别是在提高防治断奶仔猪综合征方面的应用。采用用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液的饲料经过发酵，还原糖、乳酸含量明显增加，益生菌数明显增加，消除大肠杆菌对饲料的污染，具有酸香味。实验结果显示:发酵液态仔猪饲料液体菌液增加了饲料消化吸收效率，而且发酵饲料中的益生菌改善肠道的微生态环境，使仔猪腹泻率下降54.88％，提高了机体免疫力。该发酵液态仔猪饲料通过发酵后，提高了饲料的适口性和消化率，大大减缓由母乳直接到固体饲料对断奶仔猪的应激，从而减少腹泻率和死亡率。
与其他的饲料相比，本发明用用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液制备的仔猪液态发酵饲料有以下优势：第一，在物理形态与母乳相似，仔猪可以同时获得养分和水的供应；第二，发酵过程中产生大量的乳酸等微生物代谢产物，使液体发酵饲料含有特殊的香味，适口性好，诱使仔猪采食量增加，生长速度加快；第三，仔猪液态发酵饲料含有大量的益生菌，其主要是通过消耗氧气、产生乳酸和分泌一些抗菌物质来增强仔猪免疫功能，杀灭病原微生物，防止仔猪腹泻等疾病的发生。第四，仔猪液态发酵饲料可取代抗生素的添加及防治仔猪“早期断奶综合征”。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
(1)发酵菌种的筛选
本发明从博益德(北京)生物科技有限公司自有菌种库的9株菌中筛选目标菌株。菌种按类别可分为芽孢菌4株，分别是地衣芽孢杆菌bfc190102(cgmccno.18911)标记为b1、枯草芽孢杆菌bfc190103(cgmccno.18912)标记为b2、枯草芽孢杆菌bfc1601标记为b3，解淀粉芽孢杆菌bfc190306标记为b4；乳酸菌5株，分别是植物乳杆菌bfc190204(cgmccno.18915)标记为r1、粪肠球菌bfc190205(cgmccno.18916)标记为r2、凝结芽孢杆菌bfc190307标记为r3、豆粕乳杆菌bfc1607标记为r4、发酵乳杆菌bfc1609标记为r5。
1)芽孢菌菌株的筛选
将活化好的芽孢菌分别点接到淀粉培养基(牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g、可溶性淀粉0.2g、水100ml、ph7.0～7.2、琼脂2g)和酪素培养基(kh2po40.036g、mgso4·7h2o0.05g、zncl20.0014g、na2hpo4·7h2o0.107g、nacl0.016g、cacl20.0002g、feso40.0002g、酪素0.4g、trypticase0.005g、琼脂2.0g)平板上，然后放入37℃恒温生化培养箱中培养，观察菌株周围是否有透明圈产生，挑取产生透明圈的菌株再次活化，稀释涂布到平板上，使之产生单菌落，观察产生透明圈的大小，挑取透明圈大的菌株.通过产淀粉酶实验和产蛋白酶实验从4株芽孢菌中筛选出高产淀粉酶和高产蛋白酶的菌株。分别是地衣芽孢杆菌b1、枯草芽孢杆菌b2。
2)乳酸菌菌株的筛选
将活化好的5株乳酸菌菌液(菌液中活菌数都达到了109cfu/ml)，分别按照体积与重量的单位比是l/kg为5％的比例接种于植物性原料混合物中，然后搅拌饲料使之充分混匀，装入发酵袋置于37℃环境中发酵3d后进行检测。检测时称取5g发酵饲料放入三角瓶中，加入45ml蒸馏水振荡20min，然后离心取上清，稀释10倍后用生物传感分析仪测定其乳酸含量，选取乳酸含量高的2株菌株。通过乳酸菌产乳酸性能实验从5株乳酸菌中筛选出产酸高的乳酸菌，分别是植物乳杆菌r1、粪肠球菌r2。其中，植物性原料混合物为按质量百分比计玉米占59％、去皮豆粕占32.5％、预混料占8.5％；预混料配方为：次粉61.24％、麸皮22.30％、氯化胆碱0.41％、希杰蛋氨酸0.65％、赖氨酸0.42％、磷酸氢钙6.37％、石粉5.43％、食盐0.59％、植酸酶0.16％、乙氧基喹啉0.20％。
(2)发酵条件的优化：
1)发酵饲料2株芽孢菌比例的优化：
将2株芽孢菌(地衣芽孢杆菌b1和枯草芽孢杆菌b2)活化2代后，液体菌液中b1活菌数达到4.3×107cfu/ml，b2活菌数达到6.7×107cfu/ml，接入预先混合好的植物性原料混合物中，接种量按(v/w，l/kg)为8％，2株芽孢菌b1和b2接种比例分别为3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，料水比为1:3.5，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标，结果如表1所示。
表1两种芽孢菌不同混合比例发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表1可以看出，芽孢菌b1和b2的混合比例为1:1与其他混合比例相比，还原糖含量最高。因此，最终确定2株芽孢菌b1和b2的混合比例为1:1。
2)发酵饲料2株乳酸菌比例的优化:
将2株乳酸菌(植物乳杆菌r1、粪肠球菌r2)活化2代后，菌液中r1的活菌数达到5.6×109cfu/ml，菌液中r2的活菌数达到3.4×109cfu/ml，接入预先混合好的植物性原料混合物中，接种量为8％，2株乳酸菌r1和r2比例分别为3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，料水比为1:3.5，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标，结果如表2所示。
表2两种乳酸菌不同混合比例发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表3可以看出，两种乳酸菌r1和r2的混合比例为1:2时，还原糖含量最高。因此，最终确定2株乳酸菌r1和r2的混合比例为1:2。
2)发酵液态饲料芽孢菌与乳酸菌混合比例的优化：
将筛选出的2株芽孢菌(地衣芽孢杆菌b1和枯草芽孢杆菌b2)和2株乳酸菌(植物乳杆菌r1和粪肠球菌r2)活化2代(菌液中活菌数量都达到上述菌液浓度)，接入预先混合好的植物性原料混合物中，接种量为8％(v/w)，芽孢菌液与乳酸菌液接种比例按体积比分别为1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，其中，2株芽孢菌液接种比例按体积比为1:1，2株乳酸菌接种比例为1:2，料(植物性原料混合物)与水的比为1:3.5，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标，结果如表3所示。
表3芽孢菌与乳酸菌混合比例发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表1可以看出，当芽孢菌和乳酸菌的混合比例为2:1时，还原糖含量最高，益生菌数也较高。因此，芽孢菌与乳酸菌的混合比例选择是2:1。
4)发酵饲料接种量的优化：
同上操作将2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，接入预先混合好的植物性原料混合物中，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1，2株芽孢菌b1和b2接种比例为1:1，2株乳酸菌r1和r2比例为1:2，接种量分别为4％，6％，8％，10％，12％，料水比为1:3.5(w/v，kg/l)，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标。
表4不同接种量发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表4可以看出，随着接种量的增加，还原糖含量先减小后增加再减小，在接种量为4％和10％时还原糖含量最高且一样，乳酸含量也高，但接种量高成本也增加，因此，选择接种量为4％～6％(v/w，l/kg)，其中接种量为4％时最合适。
5)发酵饲料料水比的优化：
同上操作将2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，接入预先混合好的植物性原料混合物中，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1，2株芽孢菌b1和b2接种比例为1:1，2株乳酸菌r1和r2比例为1:2，接种量为4％，料水比(w/v，kg/l)分别为1:3，1:3.5，1:4，1:4.5，1:5，37℃恒温生化培养箱中发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标。
表5不同料水比发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表5可以看出，当料水比为1:3.5时，还原糖含量最高，益生菌数相对较高，因此，选择料水比选择为1:3～1:4.5，最适为1:3.5。
6)发酵饲料温度的优化：
将2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，接入预先混合好的植物性原料混合物中，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1，2株芽孢菌b1和b2接种比例为1:1，2株乳酸菌r1和r2比例为1:2，接种量为4％，料水比为1:3.5，分别置于20℃、26℃发酵5d，32℃、37℃、42℃发酵3d后，检测其中的还原糖含量、乳酸含量和益生菌数等指标。
表6不同发酵温度发酵后还原糖含量、乳酸含量与益生菌数
由表6可看出，随着温度的升高，还原糖先增加后减小，32℃达到最高。实际发酵过程中可选择20-30℃范围作为发酵温度。
(3)正交试验优化发酵条件
将筛选出的2株芽孢菌和2株乳酸菌活化2代，以单因素优化的条件进行正交实验，采用l9(33)型三水平三因素正交实验对芽孢菌与乳酸菌的接种比例，总接种量，料水比进行分析。发酵3d后，测定其乳酸含量，还原糖，芽孢菌数和乳酸菌数，以还原糖含量作为指标，选取还原糖含量最高的作为最终饲料发酵条件。
表7正交实验影响因素与水平列表
表8正交试验极差分析
表9正交试验方差分析
从正交实验结果直观分析r值可知，影响试验结果的因素依次为a>c>b，即对产乳酸影响因素依次为接种量、料水比、接种比例，即优化后的最适的条件是接种量为4％，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2:1，料水比为1:3.5。
(4)仔猪液态发酵饲料的制备方法
通过上述多次实验研究，最终仔猪液态发酵饲料即微生物发酵保育期仔猪液态饲料的制备方法如下：
1)将乳酸菌r1和乳酸菌r2即植物乳杆菌的菌种编号为cgmccno.18915和粪肠球菌的菌种编号cgmccno.18916在mrs培养基，芽孢菌b1与芽孢菌b2即地衣芽孢杆菌的菌种标号为cgmccno.18911和枯草芽孢杆菌的菌种标号为cgmccno.18912分别在lb培养基分别进行扩大培养，得到乳酸菌种子液和芽孢菌种子液；
2)将植物性原料粉碎，与水混合均匀，植物性原料与水质量比为1:3～1:4.5(w/v)，加热到100℃，维持时间10min；
3)待温度降到30℃左右，接种液体微生物种子液，微生物种子液是由芽孢菌、乳酸菌混菌组合而成。芽孢菌与乳酸菌混合种子液总计接种量为4％～6％(v/w)，其中芽孢菌液与乳酸菌液接种比例为2:1～3:1(v/v)，芽孢菌b1与芽孢菌b2接种比例为1:1(v/v)，乳酸菌r1和乳酸菌r2接种比例为1:2(v/v)，料水比为1:3～1:4.5(w/v)。混合均匀后装入塑料桶或不锈钢桶内发酵；20～30℃发酵3-5天。
实施例2
一种仔猪液态发酵饲料的制备方法，其包括如下方法，
(1)用于发酵仔猪液态饲料的液体菌液的制备，它是由芽孢菌液和乳酸菌液组合而成；其中，芽孢菌液包括为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，乳酸菌液为植物乳杆菌和粪肠球菌的混合菌液。具体操作为将乳酸菌：植物乳杆菌和粪肠球菌分别用mrs培养基于40℃培养箱静置培养36h，芽孢菌：地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别用lb培养基于37℃摇床180r/min，培养18h，将获得植物乳杆菌液和粪肠球菌液按体积份数比为1:2(v/v)混合获得乳酸菌液，将地衣芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液按体积份数比为1:1(v/v)混合获得芽孢菌液，将芽孢菌液和乳酸菌液按体积份数比为2:1(v/v)，混合获得用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液；
其中，将得到的植物乳杆菌液经测定活菌数不少于5.6×109cfu/ml，粪肠球菌液经测定活菌数不少于3.4×109cfu/ml，地衣芽孢杆菌液测定活菌数不少于4.3×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌液经测定活菌数不少于6.7×107cfu/ml。
(2)将植物性原料(玉米59％、去皮豆粕32.5％、预混料8.5％)称量混合后粉碎，粉碎通过40目筛，与水混合均匀，植物性原料与水质量比为1:3(w/v)，加热到100℃，维持时间10min。
(3)待步骤(2)中植物性原料与水的混合料温度降到30℃左右，接种步骤(1)获得的用于发酵液态仔猪饲料的液体菌液，接种量为4％(v/w)；
(4)混合均匀后装入塑料桶或不锈钢桶内发酵；30℃发酵3天。
在此工艺条件下制备的仔猪液态发酵饲料，还原糖含量较发酵前提高了1.56％，乳酸含量达到3.2％，消除大肠杆菌对饲料的污染。
实施例3
以实施例2方法制作的仔猪液态发酵饲料，饲喂7日龄-15日龄仔猪，共24只，分两个处理组，每个处理组三个重复，对照组饲喂全价粉料(全价粉料由天津牧丰饲料有限公司提供)，试验组仔猪液态发酵饲料替代50％全价粉料。
试验仔猪断奶后立即转入保育舍，圈舍均为高床平养，保持舍内通风顺畅。试验组采用以食槽无剩余料为原则，自由采食和饮水，每天在早上08:00、中午12:00、下午17:00和晚上21:00等4个时间点定时饲喂，为期31天。乳头式饮水器饮水，猪舍温度控制在25-30℃，每天打扫2次猪舍。其他日常管理按常规进行，喂养效果见表10。
表10全价粉料与仔猪液态发酵饲料饲喂效果
上述结果说明：
(1)微生物菌体本身就是良好的饲料蛋白质，其蛋白质含量高，且氨基酸组成与动物所需氨基酸组成更为相似，更容易被消化吸收，因此料肉比降低8.65％；
(2)植物性蛋白质经微生物发酵后，大分子蛋白质被降解为小分子物质，而且植物性蛋白质的抗原特性降低，提供了生物活性物质，如功能性多肽、酶等，改善了饲料口味，提高了饲料的适口性，日采食量提高1.96％。
(3)植物中往往含有一些抗营养因子，如胰蛋白酶抑制因子和植酸磷等，容易影响幼龄动物小肠中营养物质的吸收利用，但玉米和豆粕等大原料经过发酵后，可消除或减少上述抗营养因子，并将植物蛋白降解为小肠更容易吸收的小肽、寡肽和游离氨基酸，微生物发酵还将产生很多酶，如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，都能大大提高饲料的消化吸收率，日增重提高11.68％。
(4)由于微生物发酵减少了饲料中的抗营养因子，增加了饲料消化吸收效率，而且发酵饲料中的益生菌改善肠道的微生态环境，使仔猪腹泻率下降54.88％。