一种含免疫调节肽功能成分的LGG发酵产物的制备方法及其应用与流程

本发明属于使用益生菌发酵产生功能性成分，具体涉及一种益生菌发酵产生免疫调节肽、类吗啡肽和功能蛋白的制备方法及其应用。

背景技术：

近年来，继提出益生菌(probiotics)、益生元(prebiotics)和合生元(synbiotics)等概念后，益生菌界又提出了postbiotic(译为后生元)一词。postbiotic是益生菌产生的、可对宿主发挥益生作用的代谢产物，包括多肽、分泌蛋白、脂肪酸、磷壁酸、胞外多糖、细菌素等。目前，解析postbiotic的益生作用已成为益生菌研究领域的热点，在该方面研究得较为深入的是乳酸菌的postbiotic。某些乳酸菌的代谢产物有着类似于活菌本身的益生作用，可在多个层面上保护肠道屏障功能。

目前研究发现的主要功能：

1、抑制细菌生长：抑菌类产物是益生菌代谢产物中研究得最多的一类，已鉴定出的抑菌性物质主要是有机酸类，如乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸。这些酸性物质可以降低肠道的ph值，有效地抑制多种病原菌的生长和繁殖，对周围的益生菌却没有影响，协助肠道内建立以益生菌为主导地位的微生态环境；

2、维持肠道屏障的完整性：研究表明，某些益生菌的代谢产物能有效抑制有害物质引起的肠上皮细胞间紧密连接破坏、肠道通透性增加和肠上皮细胞凋亡；

3、调节炎症反应：益生菌代谢产物有抑制肠道过度炎症反应的作用。

鼠李糖乳杆菌gg株(lgg)是1983年由美国北卡罗来纳州立大学sherwoodgorbac教授和barrygoldin教授设定严格的筛选条件，从健康人体肠道中分离得到的一株益生菌菌株，不管是菌体本身还是其代谢产物，lgg都是目前研究得最为深入的益生菌菌株之一，其分泌的多肽或蛋白组分被认为是其发挥益生作用的主要活性成分，这些组分直接作用于肠上皮细胞和肠道免疫细胞，在维持肠道屏障完整性、抑制肠上皮细胞凋亡、调节炎症反应等方面发挥益生作用，并具有抑菌作用。

乳中存在多种生物活性肽类，如吗啡肽、降血压肽、矿物元素促进肽类等，但这些生物活性肽(bioactivepeptides)在乳蛋白(称之为前体)中以非活性状态存在，只有在酶促作用下水解而释放出来，通过受体或游离化合物发挥生理作用。

rokka等对lgg发酵乳经进一步胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，研究表明：这种作用物中存在着类吗啡肽、免疫调节肽、ace抑制肽和降血压肽(见表1)。

表1lgg发酵乳经进一步酶水解后所释放的活性肽

这表明lgg酸奶制品的生理作用部分归因于lgg菌的这种酶促作用，这些生理作用包括lgg菌对rotavirus痢疾的辅助治疗/lga生成刺激等。

这些肽是通过lgg发酵牛乳后，再进一步在体外用胰蛋白酶和胃蛋白酶保温水解8个小时后获得。

通过益生菌lgg对牛奶等发酵直接获得这些具有生理作用的功能肽迄今为止还未见到报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备方法及其应用，包括：

步骤a，发酵底物的预处理步骤：对所述发酵底物进行预处理，选用动物奶或者动物蛋白浓缩物作为底物，并在50-60℃下搅拌溶解20-30分钟，充分溶解水合，形成原料混合液；

步骤b，碳源添加步骤：向所述原料混合液中添加碳源，并在50-60℃下搅拌溶解20-30分钟，所述碳源的添加量相对于原料混合液的质量百分比为0.1-10％；

步骤c，营养因子添加步骤：向所述原料混合液中加入营养分子，所述营养因子的添加量相当于原料混合液质量百分比的0.00001-10％；

步骤d，均质灭菌步骤：将添加了所述碳源和营养因子的所述原料混合液均质及灭菌；

步骤e，接种步骤：将经过均质灭菌的所述原料混合液冷却至25-50℃，在无菌条件下接种用于发酵的鼠李糖乳杆菌lgg，添加量以活菌数计为10³-10⁸cfu/ml(g)；

步骤f，发酵步骤：将所述接种后的原料混合液在预设温度下培养，终止后进行后酵；

步骤g，后处理步骤：将所述发酵产物依使用方式的差别而直接包装使用，或经过干燥制成固体粉末；

通过以上步骤，获得含有氨基酸系列为thr-thr-met-pro-leu-trp(缩写为ttmplw)的免疫调节肽、氨基酸系列为tyr-pro-phe-pro(缩写为ypfp)的类吗啡肽、p40蛋白、p75蛋白等功能性成分的发酵物液体或粉末。

进一步地，上述含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备方法及应用中，所述发酵菌种为鼠李糖乳杆菌lgg(美国菌种保藏中心菌株保藏编号为atcc53103)，菌种添加量以活菌数计为10⁵-10⁷cfu/ml(g)。

进一步地，上述含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备方法及应用中,所述发酵底物为所述动物奶至少包括牛奶或羊奶，所述动物蛋白浓缩物至少包括牛奶蛋白。

进一步地，上述含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备方法及其应用中，所述发酵碳源为萄萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖或其组合，所述碳源的添加量相对于原料混合液质量百分比的0.5-7％。

进一步地，上述含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备方法及其应用中，所述营养因子为酵母抽提物(包括酵母膏、酵母粉等)、麦芽汁、玉米汁、复合维生素、复合氨基酸、硫酸镁、硫酸锰等促生长因子，所述营养因子为酵母膏、酵母粉、麦芽汁、玉米汁，其添加量相当于原料混合液质量百分比的0.01-5％。

进一步地，上述的含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备方法及应用中，所述发酵温度为35-45℃。

进一步地，上述的含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备及方法中，培养时间为10-100小时。

进一步地，上述的含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备及方法中，最终发酵产物ph值为3.3-4.5，并进行后酵。

进一步地，上述的含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备及方法中，通过以上步骤，获得含有氨基酸系列为thr-thr-met-pro-leu-trp(缩写为ttmplw)的免疫调节肽、氨基酸系列为tyr-pro-phe-pro(缩写为ypfp)的类吗啡肽、p40蛋白、p75蛋白等功能性成分的发酵物液体或粉末，其含量分别为0.1ug-1000ug/ml(g)。

与现有技术相比，本发明的技术效果在于，以鼠李糖乳杆菌lgg为唯一发酵菌株，原料预处理、添加碳源和营养因子、均质灭菌、接种等步骤，并经过长时间发酵培养和后酵，和/或干燥等步骤，获得含有氨基酸系列为thr-thr-met-pro-leu-trp(缩写为ttmplw)的免疫调节肽、氨基酸系列为tyr-pro-phe-pro(缩写为ypfp)的类吗啡肽、p40蛋白、p75蛋白等功能性成分的发酵物液体或粉末。

本发明可广泛应用于新鲜或热处理的各类食品、保健品、特医食品、甚至药品中，提升食品的健康价值，改善食用者健康水平。

附图说明：

图1为本发明实施例的样品分析总离子流图；

图2为本发明实施例的p75蛋白多肽aqqqtat对应质荷比提取离子流图，时间为31.16min；

图3为本发明实施例的p40蛋白多肽agngwgnga对应质荷比提取离子流图，时间为17.25min；

图4为本发明实施例的免疫调节肽ttmplw对应质荷比提取离子流图25.85min；

图5为本发明实施例的样品免疫调节肽定量检测图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但要求保护的范围并不局限于此。

根据本发明的一个实施方案，提供了一种含免疫调节肽等功能成分的lgg发酵产物的制备方法及其应用，该方法包括：

发酵底物的预处理步骤，对发酵底物进行预处理，所用底物选用牛奶、羊奶等动物奶或奶粉、牛奶蛋白等动物蛋白浓缩物，并在50-60℃下搅拌溶解20-30分钟，充分溶解水合；

碳源添加步骤，向所述原料混合液中添加碳源，并在50-60℃下搅拌溶解20-30分钟，其中，所述碳源选自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、核糖、鼠李糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨糖、纤维二糖、海藻糖、塔格糖、岩藻糖或其组合，所述碳源的添加量相对于原料混合液的质量百分比为0.1-10％；

营养因子添加步骤，向所述原料混合液中加入酵母抽提物(包括酵母膏、酵母粉等)、麦芽汁、玉米汁、复合维生素、复合氨基酸、硫酸镁、硫酸锰等促生长因子，所述营养因子的添加量相当于原料混合液质量百分比的0.00001-10％；

均质灭菌步骤，将添加了所述碳源和营养因子的所述原料混合液加热至65-75℃，在16-20mpa下均质，然后在90-95℃下灭菌20-30分钟；

接种步骤，将经过均质灭菌的所述原料混合液冷却至25-50℃，在无菌条件下接种用于发酵的鼠李糖乳杆菌lgg，添加量以活菌数计为10³-10⁸cfu/ml(g)发酵基质；

发酵步骤，将接种后的原料混合液在35-45℃下培养6-600小时，得到ph值3.0-5.0的发酵物，并进行后酵；

后处理步骤，将所述发酵产物依使用方式的差别而直接使用，或经过干燥制成固体粉末；

通过以上步骤，获得含有氨基酸系列为thr-thr-met-pro-leu-trp(缩写为ttmplw)的免疫调节肽、氨基酸系列为tyr-pro-phe-pro(缩写为ypfp)的类吗啡肽、p40蛋白、p75蛋白等功能性成分的发酵物液体或粉末，其含量分别为0.1ug-1000ug/ml(g)。

下面通过具体实时例对本发明进行说明。

实施例一

步骤a,将乳蛋白为3.1，总固形物为12％的鲜牛奶做为发酵底物进行预处理，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟，充分溶解水合，形成原料混合液；

步骤b,向所述原料混合液中添加葡萄糖，其添加量为原料混合液质量百分比的0.5％，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟，；

步骤c，向所述原料混合液中加入酵母膏和麦芽汁做为营养分子，酵母膏的添加量为原料混合液质量百分比的0.03％，麦芽汁为0.05％；

步骤d，将添加了所述碳源和营养因子的所述原料混合液均质及灭菌；

步骤e，将经过均质灭菌的所述原料混合液冷却至46℃，在无菌条件下接种用于发酵的鼠李糖乳杆菌lgg，添加量以活菌数计为5*10⁵cfu/ml(g)；

步骤f，将所述接种后的原料混合液在43℃培养,发酵时间16小时，发酵结束时ph值为4.5，并进行后酵；

通过以上步骤，获得含有氨基酸系列为thr-thr-met-pro-leu-trp(缩写为ttmplw)的免疫调节肽、氨基酸系列为tyr-pro-phe-pro(缩写为ypfp)的类吗啡肽、p40蛋白、p75蛋白功能性成分的发酵物液体，免疫调节肽ttmplw生成量为0.5ug/ml。

实施例二

步骤a,将质量百分比为12％的全脂奶粉，0.5％的wpc80，做为发酵底物，进行预处理，并在50-60℃下搅拌溶解30分钟，充分溶解水合，形成原料混合液；

步骤b,向所述原料混合液中添加麦芽糖，其添加量为原料混合液质量百分比的1％，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟，；

步骤c，向所述原料混合液中加入麦芽汁和玉米汁做为营养分子，麦芽汁的添加量为原料混合液质量百分比的0.05％，玉米汁为0.05％；

步骤d，将添加了所述碳源和营养因子的所述原料混合液均质及灭菌；

步骤e，将经过均质灭菌的所述原料混合液冷却至38℃，在无菌条件下接种用于发酵的鼠李糖乳杆菌lgg，添加量以活菌数计为1.2*10⁶cfu/ml(g)；

步骤f，将所述接种后的原料混合液在37℃培养,发酵时间24小时，发酵结束时ph值为3.8，并进行后酵；

通过以上步骤，获得含有氨基酸系列为thr-thr-met-pro-leu-trp(缩写为ttmplw)的免疫调节肽、氨基酸系列为tyr-pro-phe-pro(缩写为ypfp)的类吗啡肽、p40蛋白、p75蛋白等功能性成分的发酵物液体，免疫调节肽ttmplw生成量为3.2ug/ml。

实施例三

步骤a,将质量百分比为10％的羊奶粉，0.8％的wpc80，做为发酵底物，进行预处理，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟，充分溶解水合，形成原料混合液；

步骤b,向所述原料混合液中添加麦芽糖和果糖，麦芽糖添加量为原料混合液质量百分比的2％，果糖为0.1％，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟；

步骤c，向所述原料混合液中加入酵母粉和复合氨基酸做为营养分子，酵母粉的添加量为原料混合液质量百分比的0.01％，复合氨基酸为0.05％；

步骤d，将添加了所述碳源和营养因子的所述原料混合液均质及灭菌；

步骤e，将经过均质灭菌的所述原料混合液冷却至43℃，在无菌条件下接种用于发酵的鼠李糖乳杆菌lgg，添加量以活菌数计为5.5*10⁶cfu/ml(g)；

步骤f，将所述接种后的原料混合液在40℃培养,发酵时间50小时，发酵结束时ph值为3.7，并进行后酵。

通过以上步骤，获得含有氨基酸系列为thr-thr-met-pro-leu-trp(缩写为ttmplw)的免疫调节肽、氨基酸系列为tyr-pro-phe-pro(缩写为ypfp)的类吗啡肽、p40蛋白、p75蛋白等功能性成分的发酵物液体，免疫调节肽ttmplw生成量为10.9ug/ml。

实施例四

步骤a,将质量百分比为15％的全脂奶粉、1％的wpc80做为发酵底物，进行预处理，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟，充分溶解水合，形成原料混合液；

步骤b,向所述原料混合液中添加半乳糖和果糖，半乳糖添加量为原料混合液质量百分比的3％，果糖为4％，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟；

步骤c，向所述原料混合液中加入麦芽汁和复合维生素做为营养分子，麦芽汁的添加量为原料混合液质量百分比的0.05％，复合维生素为0.005％；

步骤d，将添加了所述碳源和营养因子的所述原料混合液均质及灭菌；

步骤e，将经过均质灭菌的所述原料混合液冷却至38℃，在无菌条件下接种用于发酵的鼠李糖乳杆菌lgg，添加量以活菌数计为3.6*10⁷cfu/ml(g)；

步骤f，将所述接种后的原料混合液在35℃培养,发酵时间200小时，发酵结束时ph值为3.4，并进行后酵；

步骤g，将所述发酵产物干燥处理；

通过以上步骤，获得含有氨基酸系列为thr-thr-met-pro-leu-trp(缩写为ttmplw)的免疫调节肽、氨基酸系列为tyr-pro-phe-pro(缩写为ypfp)的类吗啡肽、p40蛋白、p75蛋白等功能性成分的发酵物粉末，免疫调节肽ttmplw生成量为500ug/g。

实施例五

步骤a,将乳蛋白为3.1，总固形物为12％的鲜牛奶、质量百分比为5％的脱脂奶粉,做为发酵底物进行预处理，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟，充分溶解水合，形成原料混合液；

步骤b,向所述原料混合液中添加半乳糖、麦芽糖和海藻糖，半乳糖添加量为原料混合液质量百分比的1.5％，麦芽糖为3％，海藻糖为1％，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟；

步骤c，向所述原料混合液中加入酵母粉、复合氨基酸、麦芽汁做为营养分子，酵母粉的添加量为原料混合液质量百分比的0.03％，复合氨基酸为0.05％，麦芽汁为0.07％；

步骤d，将添加了所述碳源和营养因子的所述原料混合液均质及灭菌；

步骤e，将经过均质灭菌的所述原料混合液冷却至38℃，在无菌条件下接种用于发酵的鼠李糖乳杆菌lgg，添加量以活菌数计为2*10⁶cfu/ml(g)；

步骤f，将所述接种后的原料混合液在36℃培养,发酵时间500小时，发酵结束时ph值为3.3，并进行后酵；

步骤g，将所述发酵产物干燥处理；

通过以上步骤，获得含有氨基酸系列为thr-thr-met-pro-leu-trp(缩写为ttmplw)的免疫调节肽、氨基酸系列为tyr-pro-phe-pro(缩写为ypfp)的类吗啡肽、p40蛋白、p75蛋白功能性成分的发酵物粉末，免疫调节肽ttmplw生成量为900ug/ml。

对比例一

步骤a,将质量百分比为12％的全脂奶粉、0.8％的wpc80，做为发酵底物，进行预处理，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟，充分溶解水合，形成原料混合液；

步骤b,向所述原料混合液中添加麦芽糖和果糖，麦芽糖添加量为原料混合液质量百分比的2％，果糖为0.1％，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟；

步骤c，向所述原料混合液中加入酵母粉和复合氨基酸做为营养分子，酵母粉的添加量为原料混合液质量百分比的0.01％，复合氨基酸为0.05％；

步骤d，将添加了所述碳源和营养因子的所述原料混合液均质及灭菌；

步骤e，将经过均质灭菌的所述原料混合液冷却至43℃，在无菌条件下接种用于发酵的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，添加量以活菌数计为5.5*10⁶cfu/ml(g)；

步骤f，将所述接种后的原料混合液在40℃培养,发酵时间20小时，发酵结束时ph值为3.7，并进行后酵，得到发酵产物。

上述发酵产物中未检测到免疫调节肽ttmplw。

对比例二

步骤a,将乳蛋白为3.1，总固形物为12％的鲜牛奶做为发酵底物进行预处理，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟，充分溶解水合，形成原料混合液；

步骤b,向所述原料混合液中添加葡萄糖，其添加量为原料混合液质量百分比的0.5％，并在50-60℃下搅拌溶解25分钟；

步骤d，将添加了所述碳源的所述原料混合液均质及灭菌；

步骤e，将经过均质灭菌的所述原料混合液冷却至38℃，在无菌条件下接种用于发酵嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌lgg，添加量以活菌数计为5*10⁶cfu/ml(g)；

步骤f，将所述接种后的原料混合液在43℃培养,发酵时间6小时，发酵结束时ph值为4.1。

通过以上步骤，获得的发酵物液体，未检测到免疫调节肽ttmplw。

下表列出实施例的参数，以免疫调节肽ttmplw的生成量对发酵结果进行比较。

表2免疫调节肽ttmplw的生成量对发酵结果进行比较表

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。