一种大豆ACE抑制肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于大豆蛋白深加工领域，具体涉及一种大豆ace抑制肽及其制备方法和应用。

背景技术：

高血压是一种全球性的公共健康问题。血管紧张素转换酶(ace)抑制肽，是一类通过抑制ace活性而达到降血压效果的小分子多肽的总称，因其降血压效果明显、无毒副作用而受到广泛关注。

从大豆中分离获得的大豆分离蛋白，营养丰富，疏水性氨基酸含量高，是制备ace抑制肽的优异原料。但目前采用大豆分离蛋白制备ace抑制肽的研究成果多处于实验室阶段，市场上尚未见明确降压功效的大豆肽产品，主要是因为工业上制备大豆ace抑制肽仍存在较多技术难点，主要归结为以下两方面：

(1)大豆肽中ace抑制活性低，这也是制约大豆肽产品大范围推广应用的瓶颈，在终端产品中大豆肽添加量过大，不仅会增加终端产品的成本，大豆肽本身风味也会影响终端产品的风味品质。

(2)生产得率低、生产周期长导致最终生产成本高，作为工业化产品，产品的得率和生产周期是生产大豆肽核算成本的重要参数，低生产得率及长周期必然导致最终成本过高，降低市场竞争力，限制市场推广应用。

尽管大豆蛋白中含有较多的ace肽，但这些活性多肽隐藏在蛋白质内部，需要选择合适的蛋白酶将其靶向释放出来，才能呈现出ace抑制活性。其中蛋白酶的选择是一个关键因素，其决定了水解肽键的位置和数量，不同的酶因作用基团的特异性水解蛋白质长肽链上不同的部位，生成不同的酶解产物，因此蛋白酶的选择决定了大豆肽的水解效率和ace抑制活性。

酶解体系中氢离子浓度对酶反应速度的影响也较大，每种酶都有特定的最适ph值，高于或低于这个数值，酶的活力降低，甚至引起酶蛋白变性而丧失活力。

此外，蛋白质的酶水解作用与底物的初始蛋白浓度呈反比关系，即底物中初始蛋白浓度对酶水解作用起着反作用，其浓度越大，对酶水解的抑制作用越强，但在工业生产中，底物浓度过小，会增加装载物料的设备容量，以及后期浓缩的成本，导致生产产能降低，提高生产成本。

因此，针对大豆分离蛋白极易吸水膨胀的特点，通过采用合适的预处理方式暴露更多的酶切位点，选择合适蛋白酶靶向释放很多的ace抑制肽是制备大豆ace抑制肽亟待解决的工业化难题。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种大豆ace抑制肽的制备方法。为了克服现有酶解大豆蛋白制备ace抑制肽方法中的技术难题，如大豆蛋白极易吸水膨胀影响酶解效率、大豆肽澄清度差、ace抑制活性低的问题，本发明采用热碱处理高浓大豆蛋白液，可暴露更多的酶解位点，有利于酶解的进行。同时，采用茶多酚助滤可兼具提高大豆肽澄清度及进一步提升其ace抑制活性的效果。

本发明的另一目的在于提供上述方法制得的大豆ace抑制肽的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种大豆ace抑制肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)按重量取1份大豆分离蛋白与3-5份碱性溶液混匀，磨浆得到大豆蛋白浆液。

(2)将大豆蛋白浆液升温至90-95℃保温1.0-1.5小时，降温至58-62℃，加入碱性蛋白酶保温水解12-14小时，调节酶解体系ph值至6.0-6.5，再加入中性蛋白酶水解5-7小时，然后灭酶，离心分离，得到的上清液为大豆酶解液；以大豆分离蛋白的质量为计算基准，碱性蛋白酶的加入量占1.2-2.0％，中性蛋白酶的加入量占0.5-0.8％。

(3)往大豆酶解液中加入茶多酚和硅藻土，升温至65-70℃保温搅拌30-60分钟；然后过滤，收集透过液，浓缩，杀菌，喷雾干燥，得大豆ace抑制肽；以大豆酶解液中干物质质量为计算基准，茶多酚的加入量占0.6-1.0％，硅藻土的加入量占8.0-10.0％；

步骤(1)所述的碱性溶液优选氢氧化钾溶液，ph值为9.5-10.0。

步骤(1)所述的磨浆，优选通过胶体磨磨浆。

步骤(2)所述的灭酶，优选在85-95℃下保温15-30分钟。

步骤(3)所述的过滤，优选板框过滤；所述板框中装有600目的滤布和孔径为100-200μm的滤纸，滤布在内，滤纸在外。

步骤(3)所述的浓缩，优选浓缩至固形物含量为45-50％。

由所述方法制得的大豆ace抑制肽可用于制备保健品和食品，使用时，大豆ace抑制肽可单独使用或与其他具有降血压作用的中草药复配按照常规制剂工艺制成保健食品；或可单独使用或与其他具有降血压作用的药食同源食品，以及普通食品配料按照常规制备工艺制成普通食品；

所述保健品的剂型是口服液、胶囊剂、片剂、粉剂或颗粒剂。

所述食品可以是固体饮料、口服液或压片糖果。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用高浓度(16.6-25.0％)的大豆蛋白进行酶解，既可解决大豆蛋白酶解体系中有效水浓度过低，降低分子的扩散和运动，从而降低酶解反应速度的难题，又可减少转载物料设备的容量和后期物料浓缩的能耗等，极大增加生产产能，及降低生产成本，具有极大的工业推广意义。

(2)本发明采用热碱对大豆分离蛋白进行预处理，一方面可破坏大豆蛋白质表面水化层，暴露蛋白内部的疏水基团，提高蛋白酶切位点，有利于后续酶解的进行；另外还可水解部分大豆蛋白，释放具有双性的多肽官能团，从而降低蛋白溶液的ph值，有利于蛋白酶的作用；且更多疏水基团的暴露及蛋白质被降解，蛋白水溶液的粘度明显降低，更利于蛋白酶与蛋白的接触几率。因此，热碱预处理可明显提高大豆分离蛋白的酶解效率，降低生产成本。

(3)本发明采用碱性蛋白酶和中性蛋白酶分步协同水解大豆蛋白，热碱预处理大豆蛋白可释放部分的具有缓冲调节ph作用的多肽官能团，使得大豆蛋白溶液的ph接近碱性蛋白酶的最适酶解ph值(8.5-9.5)，释放更多的目标功能性肽；经过碱性蛋白酶水解一段时期后，调节酶解体系ph至弱酸性，再加入中性蛋白酶，可进一步水解更多的功能性肽，提高大豆蛋白的酶解蛋白利用率。

(4)本发明采用茶多酚和硅藻土对大豆酶解液进行过滤，首先硅藻土不会像常规过滤介质活性炭那样吸附蛋白酶解液中疏水性肽和氨基酸，避免了具有降血压功效的疏水性大豆肽的损失；再者部分茶多酚可与大豆酶解液中大分子蛋白和肽发生结合生成不溶物；此外，茶多酚中含有大量具有降血压作用的儿茶素等活性物质，溶于大豆酶解液透过液中的茶多酚会成为大豆ace抑制肽产品中成分，与具有降血压功效的大豆肽协同作用，进一步提升其降血压功效。

(5)本发明采用的碱液为氢氧化钾溶液，而钾离子在因摄入高钠而导致高血压的疾病中具有明显降血压作用。本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染，所得大豆肽的ace抑制活性强，可广泛应用于食品领域中。

附图说明

图1是实施例和对比例所制得大豆肽粉的蛋白回收率。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下各实施例中，各测定方法如下：

(1)蛋白回收率测定

采用凯氏定氮法分别测定大豆肽粉的蛋白含量以及原料大豆分离蛋白的蛋白含量，大豆肽的蛋白回收率计算公式如下：

蛋白回收率(pr)＝(大豆肽粉蛋白含量×大豆肽产量)÷(原料蛋白含量×原料总量)×100％

(2)肽分子量分布测定

采用gb/t22492-2008中肽相对分子质量分布的测定方法对样品中肽分子量分布进行测定。

(3)ace抑制活性测定

ace体外切割模拟底物hhl生成ha，采用高效液相色谱法测定其在228nm处峰面积从而评定大豆肽的ace抑制活性，具体步骤如下：

将30μl底物(hhl，5mm)与20μl浓度为1mg蛋白/ml大豆肽溶液或硼酸钠缓冲液(ph8.3，0.1m硼酸，0.3m氯化钠)混合，在37℃下温浴5min，加入30μlace溶液(0.1u/l)启动反应，在37℃下反应30min，加入10μlhcl(0.1m)终止反应，并通过高效液相色谱法测定其在228nm处的峰面积。反应体系总体积为90μl，且底物、样品、ace溶液均由硼酸钠缓冲液配置。抑制活性计算公式如下：

ace抑制率(acei)＝(a空白-a样品)÷a空白×100％

式中，a样品指样品组产物ha峰面积；a空白指硼酸钠缓冲液组产物ha峰面积。色谱条件如下：

色谱柱：zorbaxeclipsexdb-c18分析色谱柱(5μm4.5×250mm)

检测波长：228nm；流速：0.5ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl，自动进样；

流动相：a为乙腈，b为0.5％tfa；

洗脱条件：0-11mina20％、b80％，12-15min，a20-35％、b80-65％，16-17min，a35-20％、b65-80％，18-25min，a20％、b80％。

(4)儿茶素的测定

采用gb/t31740.2-2015中儿茶素类及咖啡碱含量的检测方法对大豆肽中儿茶素含量进行测定。

实施例1

一种大豆ace抑制肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)取100kg大豆分离蛋白与300kg碱性溶液(ph＝10.0)经高速搅拌(1000r/min)混合，然后通过胶体磨磨浆得到大豆蛋白浆液。

(2)将大豆蛋白浆液温度提升至90℃保温1.5小时，然后降温至58℃，加入2kg诺维信公司的碱性蛋白酶(novozym37071)，在58℃下保温水解12小时，接着将酶解体系ph调节至6.0，再加入0.5kg诺维信公司的中性蛋白酶(neutrase1.5mg)继续酶解7小时；酶解结束后升温至95℃保温15分钟进行灭酶，经过离心机分离得到的上清液为大豆酶解液。

(3)测定大豆酶解液中固形物质量，加入其固形物质量1.0％的茶多酚和8.0％的硅藻土，然后升温至65℃保温搅拌60分钟；然后通过内层装有600目滤布和外层装有100μm滤纸板框过滤器进行压滤，收集透过液，采用真空浓缩器将其浓缩至固形物50％，再经过uht(120-125℃，4-6s)对其进行杀菌，最终通过喷雾干燥获得大豆ace抑制肽粉a。

大豆ace抑制肽粉a的蛋白回收率见图1。

大豆ace抑制肽粉a的ace抑制活性见表1。

大豆ace抑制肽粉a中儿茶素的含量见表1。

实施例2

一种大豆ace抑制肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)取100kg大豆分离蛋白与500kg碱性溶液(ph＝9.5)经高速搅拌(800r/min)混合，然后通过胶体磨磨浆得到大豆蛋白浆液。

(2)将大豆蛋白浆液温度提升至95℃保温1.0小时，然后降温至62℃，加入1.2kg丹尼斯克食品级碱性蛋白酶(foodproalkalineprotease)，在62℃下保温水解14小时，接着将酶解体系ph调节至6.5，再加入0.8kg丹尼斯克公司的中性蛋白酶(alphalasenp)继续酶解5小时；酶解结束后升温至85℃保温30分钟进行灭酶，经过离心机分离得到的上清液为大豆酶解液。

(3)测定大豆酶解液中固形物质量，加入其固形物质量0.6％的茶多酚和10.0％的硅藻土，然后升温至70℃保温搅拌30分钟；然后通过内层装有600目滤布和外层装有200μm滤纸板框过滤器进行压滤，收集透过液，采用真空浓缩器将其浓缩至固形物45％，再经过uht(120-125℃，4-6s)对其进行杀菌，最终通过喷雾干燥获得大豆ace抑制肽粉b。

大豆ace抑制肽粉b的蛋白回收率见图1。

大豆ace抑制肽b的ace抑制活性见表1。

大豆ace抑制肽粉b中儿茶素的含量表1。

实施例3

一种大豆ace抑制肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)取100kg大豆分离蛋白与400kg碱性溶液(ph＝9.8)经高速搅拌(900r/min)混合，然后通过胶体磨磨浆得到大豆蛋白浆液。

(2)将大豆蛋白浆液温度提升至92℃保温1.3小时，然后降温至60℃，加入1.6kg诺维信公司的碱性蛋白酶(novozym37071)，在60℃下保温水解13小时，接着将酶解体系ph调节至6.3，再加入0.6kg诺维信公司的中性蛋白酶(neutrase1.5mg)继续酶解6小时；酶解结束后升温至90℃保温20分钟进行灭酶，经过离心机分离得到的上清液为大豆酶解液。

(3)测定大豆酶解液中固形物质量，加入其固形物质量0.8％的茶多酚和10.0％的硅藻土，然后升温至68℃保温搅拌40分钟；然后通过内层装有600目滤布和外层装有150μm滤纸板框过滤器进行压滤，收集透过液，采用真空浓缩器将其浓缩至固形物48％，再经过uht(120-125℃，4-6s)对其进行杀菌，最终通过喷雾干燥获得大豆ace抑制肽粉c。

大豆ace抑制肽粉c的蛋白回收率见图1。

大豆ace抑制肽粉c的ace抑制活性见表1。

大豆ace抑制肽粉c中儿茶素的含量见表1。

对比例1

一种大豆肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)取100kg大豆分离蛋白与500kg去离子水经高速搅拌(800r/min)混合，然后通过胶体磨磨浆得到大豆蛋白浆液。

(2)将大豆蛋白浆液温度提升至95℃保温1.0小时，然后降温至62℃，加入1.2kg诺维信公司的碱性蛋白酶(novozym37071)，在62℃下保温水解14小时，接着将酶解体系ph调节至6.5，再加入0.8kg诺维信公司的中性蛋白酶(neutrase1.5mg)继续酶解5小时；酶解结束后升温至85℃保温30分钟进行灭酶，经过离心机分离得到的上清液为大豆酶解液。

(3)测定大豆酶解液中固形物质量，加入其固形物质量0.6％的茶多酚和10.0％的硅藻土，然后升温至70℃保温搅拌30分钟；然后通过内层装有600目滤布和外层装有200μm滤纸板框过滤器进行压滤，收集透过液，采用真空浓缩器将其浓缩至固形物45％，再经过uht(120-125℃，4-6s)对其进行杀菌，最终通过喷雾干燥获得大豆肽粉1。

大豆肽粉1的蛋白回收率见图1。

大豆肽粉1的ace抑制活性见表1。

大豆肽粉1中儿茶素的含量见表1。

对比例2

一种大豆肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)取100kg大豆分离蛋白与500kg碱性溶液(ph＝9.5)经高速搅拌(800r/min)混合，然后通过胶体磨磨浆得到大豆蛋白浆液。

(2)将大豆蛋白浆液温度提升至95℃保温1.0小时，然后降温至62℃，加入1.2kg诺维信公司的碱性蛋白酶(novozym37071)和0.8kg诺维信公司的中性蛋白酶(neutrase1.5mg)，在62℃下保温水解19小时；酶解结束后升温至85℃保温30分钟进行灭酶，经过离心机分离得到的上清液为大豆酶解液。

(3)测定大豆酶解液中固形物质量，加入其固形物质量0.6％的茶多酚和10.0％的硅藻土，然后升温至70℃保温搅拌30分钟；然后通过内层装有600目滤布和外层装有200μm滤纸板框过滤器进行压滤，收集透过液，采用真空浓缩器将其浓缩至固形物45％，再经过uht(120-125℃，4-6s)对其进行杀菌，最终通过喷雾干燥获得大豆肽粉2。

大豆肽粉2的蛋白回收率见图1。

大豆肽粉2的ace抑制活性见表1。

大豆肽粉2中儿茶素的含量见表1。

对比例3

一种大豆肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)取100kg大豆分离蛋白与500kg碱性溶液(ph＝9.5)经高速搅拌(800r/min)混合，然后通过胶体磨磨浆得到大豆蛋白浆液。

(2)将大豆蛋白浆液温度提升至95℃保温1.0小时，然后降温至62℃，加入1.2kg诺维信公司的碱性蛋白酶(novozym37071)，在62℃下保温水解14小时，接着将酶解体系ph调节至6.5，再加入0.8kg诺维信公司的中性蛋白酶(neutrase1.5mg)继续酶解5小时；酶解结束后升温至85℃保温30分钟进行灭酶，经过离心机分离得到的上清液为大豆酶解液。

(3)测定大豆酶解液中固形物质量，加入其固形物质量10.0％的硅藻土，然后升温至70℃保温搅拌30分钟；然后通过内层装有600目滤布和外层装有200μm滤纸板框过滤器进行压滤，收集透过液，采用真空浓缩器将其浓缩至固形物45％，再经过uht(120-125℃，4-6s)对其进行杀菌，最终通过喷雾干燥获得大豆肽粉3。

大豆肽粉3的蛋白回收率见图1。

大豆肽粉3的ace抑制活性见表1。

大豆肽粉3中儿茶素的含量表1。

表1大豆肽的肽分子量分布

表2大豆肽粉aci抑制率及儿茶素含量

由图1可发现，采用本发明方法对大豆分离蛋白进行水解制备的大豆肽(大豆ace抑制肽粉1～3)，可得到较高的蛋白回收率(60.71～62.32％)。然而，在对比例中，大豆肽粉1和大豆肽粉2的蛋白回收率分别仅为48.95％和46.62％，对比例1和对比例2中工艺与本发明专利工艺不同点在于：对比例1中未采用热碱处理大豆分离蛋白，而对比例2将碱性蛋白酶与中性蛋白酶同时加入作用，且未对酶解体系进行酸碱调节，说明热碱处理可使得高浓大豆分离蛋白液(16.6％-25.0％)的酶解效率得到显著提升，且碱性蛋白酶和中性蛋白酶在其最佳作用酸碱中先后加入协同水解，可进一步提升大豆分离蛋白的水解程度。

而大豆肽粉3仍可得到较高的蛋白回收率(61.22％)，其工艺与本发明方法不同之处在于过滤前未添加茶多酚，主要是因为大豆酶解液中大分子蛋白未与茶多酚结合产生沉淀被截留，使得最终的酶解蛋白回收率较高，这也再次证明本发明专利中热碱处理和双酶协同工艺的优越性。

表1为各实施例和对比例大豆肽的肽分子量分布情况，由表中可知，采用本发明方法获得的大豆ace抑制肽(实施例1～3)的肽分子量主要分布在3000da以下(88％以上)，而大豆肽2和大豆肽3(对比例2和对比例3)中仍存在较多的大分子肽，主要是因为本发明专利中采用碱性蛋白酶与中性蛋白酶协同作用可获得分子量较低的大豆肽，且茶多酚与大分子蛋白结合通过硅藻土过滤去除了大部分的大分子蛋白和多肽。

由表3可看出，采用本发明方法制备的大豆ace抑制肽(1～3)具有较强的ace抑制率(62.13％～64.81％)，主要是因为热碱处理结合双酶协同水解大豆蛋白可以获得分子量集中在3000da以下的大豆肽，然后通过茶多酚结合作用过滤去除了大分子量肽和蛋白，小于3000da的小肽具有较强的ace抑制活性。此外，本发明采用的茶多酚除具有结合蛋白的作用外，具有强ace抑制活性的部分茶多酚也会透过硅藻土进入最后的大豆肽粉中，进一步增强其ace抑制活性，经分析发现本发明专利制备的大豆ace抑制肽中儿茶素(茶多酚中主要成分)含量达到0.22g/kg～0.28g/kg，既起到增强大豆肽的ace作用，也符合蛋白固体饮料中儿茶素的限量要求(gb2760-2014)，表明采用本发明方法制备获到的大豆ace抑制肽可作为普通食品食用，具有较好的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。