一种紫菜提取物的制备方法及在水产养殖中的应用与流程

本发明涉及水产养殖领域，具体涉及一种紫菜提取物的制备方法及在水产养殖中的应用。
背景技术：
：水产养殖在我国发展迅猛，无论是产量还是规模都名列世界前茅。然而与此同时，制约养殖生产的问题也日益突出，其中由于环境污染和高密度养殖导致的水产动物病害问题迫在眉睫。抗生素等化学药物仍然是鱼病防治的常用方法，但是抗生素的大量使用会导致耐药菌株的产生，水产生物的免疫能力下降，另一方面，渔业抗生素在水产品中的积累也会直接影响人体健康。因此，开发安全、无毒、绿色的水产养殖抗病害制剂已然形成一种趋势。紫菜作为世界上产值最高的栽培海藻，在我国种植广泛。紫菜中富含蛋白质以及多种维生素和大量生物活性物质。后期紫菜因口感较差而售价很低，属于低值紫菜。研究表明低值紫菜仍具有大量活性物质，但是目前这些活性物质没有得到充分应用，目前诸多研究也都证明了紫菜当中许多活性物质具有免疫调节和抑菌的作用。将紫菜直接添加到水产饲料中可以一定程度促进水产动物的生产发育，且随着添加量的增加作用增强，但是当添加量大于20％时，对水产动物的促生长水平不在增强，这说明，直接将紫菜添加到水产饲料中，水产动物可以利用其部分有效物质，但是吸收利用率较低。因此，建立紫菜活性物质的提取工艺并将活性物质应用于水产饲料中，将提高水产动物对紫菜活性物质的吸收利用，对于水产动物的生长发育和免疫活性有更好的作用。目前有研究显示，微生物多糖、甲壳素、动植物提取物等对水产动物都有不同程度的免疫增强作用，但考虑制备成本和技术难度，目前这些免疫增强剂的应用还需进一步改良。免疫增强剂的制备方式是其实用性的重要量度，加工过程越简单，产品质量越稳定，越有利于其商业化应用。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，从预防病害发生的角度，从水产饲料入手，在紫菜当中开发具有免疫活性产物，提供一种紫菜提取物作为水产饲料添加剂的制备方法和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：紫菜提取物制备方案：(1)称取一定量的紫菜溶于20-40倍去离子水中，搅拌均匀，调节ph为4.5-5.5，分别按照紫菜干重的0.5-3％加入纤维素酶和果胶酶，优选1.5％纤维素酶，1％的果胶酶；40-60℃搅拌反应1-4h，优选50℃，反应2h；(2)上述(1)反应结束后，调节ph为7.5-9.5，按照紫菜干重的0.5-3％加入胰蛋白酶，优选1.5％；30-40℃搅拌反应0.5-3h，优选37℃，1h；然后加入0.5-4％碱性蛋白酶，优选1.5％；40-60℃搅拌反应1-4h，优选50℃，反应3h；(3)反应(2)结束后，将反应溶液加热到90-100℃，加热10-25min，优选95℃，15min。将反应液在4500-7500rpm离心20-40min，优选6000rpm，30min；将上清液用纳滤膜脱盐，将截留液45-55℃浓缩至初始体积1/4，将浓缩液喷雾干燥或冷冻干燥，得紫菜提取物。进一步地，所述紫菜提取物为一种包括多糖，多肽，氨基酸的混合物。本发明还提供上述紫菜提取物在水产养殖中的应用。进一步地，所述在水产养殖中应用对象为鱼虾贝蟹等。进一步地，所述含紫菜提取物的饲料制备方法为：将紫菜提取物按饲料总重0.05-5％添加到饲料中，搅拌混匀，保存备用。或是，先将紫菜提取物制成8-12％的溶液，然后在搅拌下加入无水乙醇使乙醇的总浓度为10％-20％；将制得的溶液均匀的喷雾与饲料上，烘干或者晾干后保存备用。本发明与现有技术比较拥有以下优点：1、本发明能够有效刺激水产动物非特异性免疫，使其提高其免疫力和存活率。饲喂紫菜活性物质对环境更为友好，同时也降低了渔业抗生素的使用，提高了水产品质量。2、本发明在用作免疫添加剂的同时也能够丰富饲料营养，其中含有的大量多糖及多肽使得水产动物营养摄取更加均衡，有利于水产动物的生长和增重。3、本发明方法简单，实验材料易得，便于大批量制备。附图说明图1为实施例1实验流程图，紫菜提取物的制备路线。图2对斑点叉尾鮰增重率和成活率的影响柱状图。图3对中国对虾及中华绒螯蟹增重率和成活率的影响柱状图。图4对草鱼增重率和存活率的影响图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。实施例1，紫菜提取物的制备(p1)取粉碎紫菜100g，加入30倍水，加入1.5g纤维素酶、1g果胶酶，调ph5.5，50℃，反应2h，加入1.5g胰蛋白酶，调节ph8.0，37℃，1h；然后加入1.5g碱性蛋白酶，ph8.0，50℃，3h；加热到95℃灭酶15min，6000rpm离心30min，截留液50℃减压浓缩，纳滤脱盐，冻干,即得紫菜提取物p1。实施例2，紫菜提取物的制备(p2)取粉碎紫菜100g，加入40倍水，加入3.0g纤维素酶，3.0g果胶酶，调ph5.0，55℃，反应3h，加入3.0g胰蛋白酶，调节ph9.0，40℃，3h；然后加入3.0g碱性蛋白酶，ph9.0，55℃，4h；加热到90℃灭酶20min，7000rpm离心20min，截留液55℃减压浓缩，纳滤脱盐，冻干,即得紫菜提取物p2。实施例3，紫菜提取物的制备(p3)取粉碎紫菜100g，加入20倍水，加入1.0g纤维素酶，1.0g果胶酶，调ph5.5，50℃，反应2h，加入1.0g胰蛋白酶，调节ph9.0，35℃，2h；然后加入1.5g碱性蛋白酶，ph7.8，45℃，2h；加热到100℃灭酶10min，7500rpm离心30min，截留液50℃减压浓缩，纳滤脱盐，冻干,即得紫菜提取物p3。实施例4，含有紫菜和紫菜提取物的水产饲料的制备(zf，pf)将实施例2制备的紫菜提取物按饲料总重0.05-5％添加到饲料中，在这个范围内的任何一浓度都可以显著提高鱼虾贝蟹的非特异性免疫力，增进机体细胞免疫力，明显加快其生长，增重，实施例中仅以几种不同浓度作为代表样品。制备方法为：先将紫菜提取物配制成8-12％的溶液，优选10％；然后在搅拌下加入无水乙醇使乙醇的总浓度为10％-20％，优选15％；将制得的溶液均匀的喷雾与饲料上，制得紫菜提取物占饲料总重量的0.05-5％的饲料，烘干或者晾干后保存备用。按同样方法制备含紫菜粉20％的饲料，记为zf。实施例5，紫菜提取物化学组成分析对实施例1-3制备的样品p1、p2和p3进行化学组成分析，苯酚硫酸法测定样品总糖含量，bca法测定样品的蛋白含量，茚三酮法测定样品多肽含量，实验结果如表1所示。样品p1-p3在总糖含量为12.0-22.0％，蛋白质含量为14.0-27％，多肽的含量为11-25％，可见不同的加酶量、反应ph、反应时间和温度对样品中多糖、蛋白质和多糖的含量有一定影响，一般而言随着加酶量的增加，细胞壁破坏更加充分，总糖含量有所提高，蛋白质被降解成多肽的比例增大，但是蛋白质和多肽的总量基本维持不变。表1紫菜提取物化学组成分析实施例6，口服含有紫菜提取物的水产饲料促进斑点叉尾鮰生长发育及生理功能的影响本试验使用实施例2的紫菜提取物的水产饲料喂养斑点叉尾鮰，通过斑点叉尾鮰的生长发育和生理功能相关指标变化，来说明其对斑点叉尾鮰生长发育和免疫调节的作用。测试样品：实施例4制备的含有紫菜提取物的水产饲料pf，zf，阳性对照品：市售水产饲料f(和实施例4中未加紫菜提取物的水产饲料为同一饲料)试验方法：选择健康均匀的斑点叉尾鮰随机分成9组，分别使用不同的饵料，按正常的饲养管理程序进行。第1组为基础饲料对照组，第2组为20％紫菜粉添加饲料(zf)对照组，第3-9组为实验组，分别喂养紫菜提取物重量百分含量依次为0.05％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％的饲料，试验期为90天，每隔30天对斑点叉尾鮰的非特异性指标、增重率、存活率制备进行测定。投喂试验结束后，测定全鱼的水分(恒重法)、灰分、粗蛋白(凯氏定氮)及粗脂肪(氯仿甲醇)。依次取出肝脏及肠道组织样品。测定肠道中淀粉酶、脂肪酶(elisa)；碱性磷酸酶(试剂盒)；抗氧化酶(sod、cat、gsh、mda)。结果：试验期间，斑点叉尾鮰的增重率和存活率如图2所示，3～9组增重率较基础饲料组显著提高，并且最低添加剂量组增重率也高于20％紫菜粉添加组，证明紫菜提取物对斑点叉尾鮰的增重有明显促进作用且其增重效果优于直接添加高剂量紫菜粉。试验期间3～9组斑点叉尾鮰的存活率也比基础饲料组和20％紫菜粉添加组更高。由表2可以看出，饲喂添加有紫菜提取物的3～9组比对照组血清溶菌酶活性均有显著提高，在前60天饲喂过程中，3～9组血清溶菌酶活性呈上升趋势，但饲喂90天后溶菌酶活性有轻微下降。对于血液白细胞总数，3～9组较基础饲料组也有明显增加，并随饲喂实验的延长而增加。对于补体含量，添加紫菜提取物的实验组较对照组更高，随时间推移也有升高。值得一提的是最低添加剂量的紫菜提取物组的各项指标也明显优于高剂量紫菜粉添加组。血清溶菌酶活性、白细胞总数和补体含量与斑点叉尾鮰的免疫能力密切相关，这两项指标的升高证明了添加了紫菜提取物的饲料具有免疫增强作用。由表3可以看出，全鱼营养成分也因饲喂添加了紫菜提取物的饲料而发生改变，3～9组灰分比基础饲料组和紫菜粉添加组更低，粗蛋白比基础饲料组和紫菜粉添加组更高。由表4肠道中部分生理功能指标可以看出，3～9组斑点叉尾鮰的肠道淀粉酶、脂肪酶、碱性磷酸酶和多种抗氧化酶的活性均有提高并优于紫菜粉添加组。表2对斑点叉尾鮰血清中特异性指标影响表3全鱼营养成分分析水分(恒重法)、灰分、粗蛋白(凯氏定氮)、粗脂肪(氯仿甲醇)组别水分％灰分％粗蛋白％粗脂肪％173.443.9916.997.32271.793.8716.927.42373.293.4517.567.44472.783.2817.677.82572.613.0618.117.22671.363.3517.937.96771.572.9418.647.25872.683.8918.026.41972.713.8517.667.32测定肠道中淀粉酶、脂肪酶(elisa)；碱性磷酸酶(试剂盒)；抗氧化酶(sod、cat、gsh、mda)。测定肝脏组织中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶(试剂盒)；甘油三酯；抗氧化酶(sod、cat、gsh、mda)。表4肠道中部分生理功能指标的影响实施例7，口服含有紫菜提取物的水产饲料促进中国对虾及中华绒螯蟹生长发育及生理功能的影响本试验使用实施例2的紫菜提取物的水产饲料喂养中国对虾及中华绒螯蟹，通过中国对虾及中华绒螯蟹的生长发育和生理功能相关指标变化号，来说明其对中国对虾及中华绒螯蟹生长发育和免疫调节的作用。测试样品：实施例4制备的含有紫菜提取物的水产饲料pf，对照品：市售水产饲料f(和实施例4中未加紫菜提取物的水产饲料为同一饲料)、20％紫菜粉添加(zf)组。试验方法：选择健康均匀的中国对虾及中华绒螯蟹分别随机分成9组，分别使用不同的饵料，按正常的饲养管理程序进行。第1组为基础饲料对照组，第2组为20％紫菜粉添加(zf)对照组，第3-9组为实验组，分别喂养紫菜提取物重量百分含量依次为0.05％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％的饲料，试验期为45天，对中国对虾及中华绒螯蟹的非特异性指标、增重率、成活率进行测定。结果：试验期间，中国对虾和中华绒螯蟹的增重率和存活率如图3所示，3～9组中国对虾和中华绒螯蟹增重率均较基础饲料对照组和20％紫菜粉对照组有显著提高，证明紫菜提取物对中国对虾和中华绒螯蟹的增重有促进作用，并且中国对虾和中华绒螯蟹存活率比对照组也有提高。由表4可知，2～8组中国对虾及中华绒螯蟹的血清溶菌酶活性相较基础饲料对照组和20％紫菜粉添加组均明显提高，并与紫菜提取物含量存在正相关，说明该紫菜提取物对中国对虾和中华绒螯蟹具有免疫增强作用。其中图3对中国对虾及中华绒螯蟹增重率和成活率的影响表5对中国对虾及中华绒螯蟹血清中特异性指标影响实施例8，饲喂添加酶解紫菜提取物的水产饲料与添加未酶解紫菜提取物的水产饲料对促进草鱼生长发育的影响本试验通过使用实施例2中的酶解紫菜提取物的水产饲料与未酶解紫菜水提物喂养草鱼并监测草鱼生长指标变化，来表现酶解紫菜提取物与未酶解紫菜水提物用于水产养殖的差异，从而说明酶解过程的必要性。测试样品：实施例4制备的含有紫菜提取物的水产饲料pf，对照品：市售水产饲料f、按实施例4方式制备含有未酶解紫菜提取物的水产饲料组(未酶解紫菜提取物的制备除不添加任何酶外，与实施例3方法相同)。试验方法：选择健康均匀的草鱼随机分成3组，分别使用不同的饵料，按正常的饲养管理程序进行。第1组为基础饲料对照组，第2组为添加5％未酶解紫菜提取物组，第3组为添加5％酶解紫菜提取物组，实施例4制备的含有紫菜提取物的水产饲料pf。试验期为45天，对草鱼的增重率、存活率进行测定。结果：试验期间，草鱼的增重率和存活率如图4所示，第2组与对照组相比表现出明显差异，第3组草鱼增重率较基础饲料对照组有显著提高，证明酶解紫菜提取物对草鱼的增重有促进作用。此试验证明在水产饲料应用中，酶解过程是紫菜活性物质提取的必要过程。其中图4对草鱼增重率和存活率的影响。以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12