一株布氏乳杆菌BL4及其制备青贮饲料的方法

本发明涉及乳杆菌发酵技术领域。

背景技术：

畜禽养殖业是我国农村经济的重要支柱产业和经济增长点，是肉制品的主要来源，对整个国民经济发展发挥着重要的作用。饲料是制约畜禽养殖的重要因素。虽可用于饲料生产的原料众多，但随着养殖化程度的提高，我国“人畜争粮”的矛盾日益突出，导致蛋白饲料原料不足，特别是近年中美贸易摩擦导致大豆、苜蓿等价格上升，给养殖企业带来巨大的冲击；同时，养殖过程抗生素等药物超标以及粪便等污染问题严重，这些都限制了养殖业的进一步发展。因此，亟需开发一种非常规饲料原料。

构树(broussonetiapapyrifera)，俗称构皮树或楮树，为桑科(moraceae)构树属(broussonetia)的双子叶植物，生长迅速、适应性强，在我国广泛种植，资源丰富，同时其富含粗蛋白和各种生物活性物质，可开发价值极高，是畜禽养殖的新型优质木本植物饲料原料。

青贮发酵，利用微生物的代谢作用，可延长构树的保存期、改善构树的适口性、提高饲料的利用率，且所形成的饲料富含有益的微生物，从而提升构树饲料的品质。但构树粉碎后直接青储，具有发酵周期长，发酵效果差，有氧稳定性差等缺点。构树粉碎料的直接青贮发酵和仅添加玉米粉等辅料的青贮发酵，无法达到理想的ph，且有较多杂菌生长。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)bl4，该菌株于2020年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为cgmcc，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为cgmccno.20935。

本发明还提供了一种青贮饲料组合物，其重量份成份包括：构树全株鲜料100份，玉米粉8份，红糖2份，尿素0.5份和布氏乳杆菌bl40.1份。

本发明另外提供了一种利用布氏乳杆菌bl4，以杂交构树全株为主料的青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：

红糖、尿素和布氏乳杆菌bl4充分溶解于水中，然后和构树粉碎鲜料及玉米粉拌匀得初混料；

将初混料装入青贮袋放置在空旷阴凉处发酵至少7天，得青贮饲料。

进一步地，所述构树粉碎鲜料的制备方法，包括如下步骤：

将新鲜收割的构树全株通过湿粉机粉碎为0.5-1cm长大小，得构树粉碎鲜料。

通过上述工艺添加布氏乳酸菌bl4进行青贮发酵，其能很好的在青贮发酵期间繁殖，并有效降低青贮发酵ph值并抑制杂菌的生长，发酵完成后ph值低，气味佳，杂菌少，并且粗蛋白含量提高，氨基酸含量更均衡。

附图说明

图1为青贮发酵完成后的开袋视觉效果。

具体实施方式

实施例

布氏乳杆菌bl4的分离鉴定

s1、富集：将采集自江西省吉安市泰和县灌溪镇千烟洲试验站的构树进行粉碎后，与质量比分别为8％、2％和0.5％的玉米粉、红糖、尿素混合均匀，密封后置于28℃发酵21天后得发酵完成的构树料。

s2、分离：取发酵完成的构树料1g，混匀于10ml水中，静置取上清，十倍梯度稀释到10^-2和10^-3，每个梯度稀释液取100μl涂布于mrs培养基上，28℃培养24-36h，观察菌落生长状况，选取单菌落通过划线法接种于新的mrs培养基进行纯化，纯化后的单菌落冷冻保藏于20％甘油中备用。

mrs培养基：蛋白陈10.0g，葡萄糖20.0g牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，吐温801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000ml，ph6.2，115℃30分钟灭菌备用。

通过上述分离纯化过程得到一株布氏乳杆菌，该菌在mrs培养基上菌落凸起，呈乳白色，不透明，边缘或光滑或放射状。

s3、鉴定：对所得菌株进行分子生物学鉴定，通过细菌16srdna序列pcr扩增后进行测序比对。

扩增引物为27f：agagtttgatcmtggctcag和1492r：tacggytaccttgttacgactt；

扩增体系为：10×buffer2μl，2.5mmdntp1.5μl，27f1μl，1492r1μl，模板1μl，酶0.3μl，水13.2μl，总体积20μl；

扩增程序为：95℃预变性5分钟，30个循环的95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，72℃延伸10分钟，4℃保温至取出。

pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序。

测序结果通过序列拼接获得该菌的16srdna序列(seqidno.1)，将该序列于ncbi数据库进行blast比对，结果显示与多株布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)的16srdna序列具有高于99.9％的相似性，菌株命名为布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)bl4。

布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)bl4已于2020年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为cgmcc，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.20935。

布氏乳杆菌bl4扩大培养

s1、活化：从冷冻保藏的冻存管中挑取布氏乳杆菌bl4的菌液，通过划线法接种于mrs平板上，28℃培养36h进行活化，得单菌落。

s2、种子液制备：挑取s1中活化平板上的单菌落，接种于50mlmrs液体培养基中，28-30℃，200rpm摇培24h，得种子液。

s3、液体发酵：s2中的种子液，按照1％的接种量接种于至少1lmrs液体培养基中，28-30℃，200rpm摇培36-40h。

mrs液体培养基：蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，吐温801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1000ml，ph6.2，115℃30分钟灭菌备用。

通过该方法获得的布氏乳杆菌bl4的菌体量能够满足构树青贮发酵的要求。

利用布氏乳杆菌bl4，构树全株为主料的青贮发酵制备工艺：

由以下原料各组分的重量份组成：构树全株鲜料100份，玉米粉8份，红糖2份，尿素0.5份，布氏乳杆菌bl40.1份(在混合料中的终浓度10⁶cfu/g)，调节水分含量为70％。

制备工艺包括以下步骤：

s1、收割：1-1.5米高构树植株，留茬5-10cm全株收割；

s2、粉碎：新鲜收割的构树全株，利用构树湿粉机，粉碎为0.5-1cm长大小；

s3、混料：红糖、尿素和布氏乳杆菌bl4充分溶解于水中，然后和构树粉碎鲜料及玉米粉拌匀；

s4、装袋：将s3中混合好的物料装入22丝青贮袋，压实后赶排空气，用封口条扎紧袋口；

s5、发酵：将s4中生产的袋装物料放于室温，置于空旷阴凉处至少7天。

对比例1：

构树粉碎料，不添加玉米粉、红糖和尿素等辅料和布氏乳杆菌bl4，冷藏于-20℃；

对比例2：构树粉碎料，不添加玉米粉、红糖和尿素等辅料和布氏乳杆菌bl4，直接装袋、压实、密封后进行青贮发酵；

对比例3：构树粉碎料，添加玉米粉、红糖和尿素等辅料，不添加布氏乳杆菌bl4，装袋、压实、密封后进行青贮发酵；

将实施例和对比例1-3所制得的构树全株青贮饲料进行检测：

步骤一：通过嗅闻和直接观察，测定青贮的物理性状；

发酵完成后，实施例和对比例2-3均散发一定气味。其中，对比例2-3虽具酸香味，但略带刺激性，长时间嗅闻刺激性增强，有厌恶感；实施例无刺激性，带醇香味，无明显厌恶感。

通过视觉观察，如图1所示，对比例2的表面呈现青黑色，伴有较多的杂菌；对比例3表面呈黄色，并伴有杂菌生长；实施例发酵料呈青黄色，无明显杂菌生长。从形态上分辨，杂菌多为丝状真菌和酵母。

步骤二：参照北京华夏草业产业技术创新战略联盟发布的t/hxcy003—2019《构树青贮质量分级》团体标准，对青贮饲料的基本营养成分和发酵品质进行检测。具体方法如下：

干物质：参照gb/t6435；

粗蛋白：参照gb/t6432；

中性洗涤纤维：参照gb/t20806；

酸性洗涤纤维：参照gb/t1459；

粗灰分：参照gb/t6438；

ph：参照gb/t10468；

氨态氮/总氮：参照t/hxcy003-2019；

粗脂肪：索氏提取法；

粗纤维：理化分析；

无氮浸出物：理化分析；

17种氨基酸：hplc法；

色氨酸：hplc法；

钙：icp法；

磷：icp法；

有机酸：称取适量混合均匀试样，加水3ml，涡旋混匀，超声20min，6000r/min离心5min，过0.45μm滤膜后进行hplc分析。

试验数据经excel2016进行整理和统计分析。

表1结果显示了不同处理青贮发酵和未发酵的构树的营养成分。可以看出，青贮发酵保留了构树的营养成分。而添加布氏乳杆菌bl4的青贮发酵，能够增加粗蛋白含量，保持粗脂肪的含量，同时，氨基酸的组成也发生了一定的变化。

表1杂交构树全株青贮营养成分

表2结果展示了不同处理青贮发酵的发酵品质。可以看出，仅有添加布氏乳杆菌bl4的青贮发酵的ph可达到4.6以下，品质最佳。其氨态氮/总氮比值虽大于14，但考虑到添加了尿素，这一值明显低于对比例3(同样添加尿素但未添加bl-4)，说明蛋白降解率在可接受的范围，达到一般青贮合格水平。参照北京华夏草业产业技术创新战略联盟发布的t/hxcy003—2019《构树青贮质量分级》团体标准，实施例的青贮发酵可达到一级水平。

表2杂交构树全株青贮发酵品质

步骤三：乳杆菌含量的检测：取发酵完成的构树料1g，混匀于10ml水中，静置取上清，十倍梯度稀释到10^-4和10^-5，每个梯度稀释液取100μl涂布于mrs培养基上，28℃培养24-36h，观察菌落生长状况，并计数。

表3展示了青贮发酵完成后的乳杆菌的计数结果。如表3可见，构树青贮发酵时的主要乳杆菌为植物乳酸菌和布氏乳酸菌，但仅有布氏乳杆菌可以大量繁殖，从而保证青贮发酵的效果。

表3杂交构树全株青贮发酵乳杆菌含量

综上步骤一、二、三的结果，按照本制备工艺，添加布氏乳杆菌bl4进行青贮发酵，乳杆菌能够很好的在构树全株青贮发酵过程中繁殖，降低发酵ph，减少杂菌生长，提高构树青贮发酵的粗蛋白含量。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一株布氏乳杆菌bl4及其制备青贮饲料的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1395

<212>dna

<213>布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)

<400>1

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