饲用鞣酸蛋白的制备方法及制备的鞣酸蛋白与流程

本发明涉及一种动物饲料蛋白及其制备方法，特别涉及一种饲用鞣酸蛋白及其制备方法，本发明属于动物饲料技术领域。

背景技术：

五倍子，又被称为中国五倍子(chinesegallnut)，是五倍子蚜虫寄生在漆树科植物的复叶上形成的虫瘿，其中含有的单宁酸(ta)和棓酸(ga)是重要的化工原料，在食品、医药、化工、电子和功能材料等领域有着广泛的用途。中国是五倍子的主产国，其产量占世界总产量的95％以上，主要集中在湖北、湖南、贵州、四川、陕西和云南等省。五倍子的利用部位是瘿壁，在加工过程中粉碎、筛分工序会产生大量的筛下物，主要包括五倍子蚜虫干虫体及附着在虫体表面的分泌物，以及破碎过程中通过筛孔的细微棓粉(以下简称筛下物)。筛下物的质量约占整个五倍子质量的10％左右，一个五倍子年处理量为1000吨的工厂，每年的加工筛下物就达到100吨左右。目前，五倍子筛下物不仅造成了企业的资源浪费，且对环境造成压力，不符合当下农林产业绿色、可持续发展理念。

五倍子干虫体营养成分合理，除含有一定量粗蛋白质外，还含有粗脂肪和粗纤维。氨基酸含量和种类也较为丰富，具备较好的利用价值。但因为五倍子筛下物中含有少量棓粉，并且棓粉与五倍子蚜虫干虫体很难分离，棓粉中单宁的酸性和涩口性，使其同五倍子加工废渣一样，难以直接作为肥料或饲料利用，目前尚无五倍子加工筛下物利用的研究报道。多项研究表明，单宁酸应用在畜禽饲料上，具有抗菌、抗氧化、抗腹泻、抗病毒、抗寄生虫等作用，目前市场上已有肠溶包衣单宁酸产品，多以五倍子或成品单宁酸为原料，通过包被单宁的方法获取。如何处理五倍子加工过程中粉碎剩余物，同时利用筛下物中干虫体的营养成分和残留棓粉中的单宁酸为本发明人所关注的焦点。本发明以五倍子加工筛下物的资源化利用为目标，充分利用其中含有的蛋白质及单宁酸，达到变废为宝的目的。通过简单的处理步骤，制备了一种鞣酸蛋白，并对该鞣酸蛋白产品的抗腹泻作用进行了评价，为将该鞣酸蛋白产品在畜禽饲料中的应用提供科学依据。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有鞣酸蛋白均系以食用蛋白如大豆蛋白或血清蛋白等与食用单宁酸制备的问题，提供一种饲用鞣酸蛋白及其制备方法，本发明方法以五倍子加工剩余物----五倍子粉碎筛下物为原料制备畜禽饲料鞣酸蛋白，制备的鞣酸蛋白不仅屏蔽了单宁作为饲料添加剂的涩口性，提高了饲料的适口性，又解决了五倍子加工厂中废弃物的利用问题，利于环保，还提升了五倍子加工筛下物的利用价值，减少了五倍子加工企业的环保负担。本发明方法绿色、清洁，操作简单易行，工艺路线简捷，操作条件容易控制，适宜工业化生产，达到了废弃物资源化利用目的。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种鞣酸蛋白的制备方法，包括将五倍子加工筛下物与水混合后，依次进行粉碎处理、超声波处理、结合反应。

其中，所述五倍子加工筛下物为五倍子干燥、破碎、过筛分离后的筛下物，主要成分为五倍子蚜虫干虫体及附着在虫体表面的分泌物；破碎过程中通过筛孔的棓粉。

特别是，所述五倍子加工筛下物的质量与水的体积之比为1：(8-12)(m/v)，即每1g五倍子加工筛下物与8-12ml水混合，优选为1:10。

其中，所述的粉碎处理为采用破壁粉碎机对五倍子加工筛下物进行超微粉碎处理，其中超微粉碎处理后的五倍子粉碎匀浆液中五倍子加工筛下物粉末的粒径低于100μm，优选为低于80μm，进一步优选为低于70μm，更进一步优选为40-70μm。

特别是，所述超微粉碎处理时间为2-5min，优选为3min；转速为15000-25000rpm，优选为20000rpm。

尤其是，所述超微粉碎处理为间歇式粉碎，即采用破壁粉碎机进行至少2次的粉碎处理，其中，每次粉碎处理时间为0.5-2min，优选为1min；相邻两次粉碎处理之间的间隔时间≥1min，优选为1-3min。

特别是，采用破壁粉碎机进行2-4次的粉碎处理，优选为2-3次。

其中，所述超声波处理过程中，超声波频率为20-30khz，优选为20-25khz(通常为20-30khz)；超声波脉冲时间为3～5s/8～10s(on/off)，优选为4s/9s，即超声波持续发生时间为(on)3～5s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为8～10s。

特别是，所述超声波处理过程中超声波的功率与粉碎处理后的五倍子粉碎匀浆液的体积之比为100-150：100，优选为120:100，即在超声波处理过程中，每100ml五倍子粉碎匀浆液，超声波功率为100～150w；每1000ml五倍子粉碎匀浆液，超声波功率为1000～1500w，优选为1200w；超声波处理时间为20-30min，优选为25min。

其中，所述结合反应是将经过超声波处理后的五倍子混合物料在搅拌状态下，混合物料中的五倍子单宁酸与蛋白质进行结合，生产鞣酸蛋白。

特别是，所述结合反应过程中温度低于60℃，优选为10-60℃；搅拌速率为100-250rpm；反应时间≥8h，优选为8-30h，进一步优选为10-30h，更进一步优选为20-24h。

尤其是，将超声波处理后的五倍子混合物料在搅拌状态下，分阶段、逐级升温的条件下，进行五倍子单宁酸与蛋白质的结合反应，其中每个阶段的温度分别保持恒定，且后一阶段的反应温度高于前一阶段的反应温度；每个反应阶段的反应时间至少4h，优选为4-6h，进一步优选为5-6h。

其中，结合反应温度低于45℃，优选为10-40℃，进一步优选为25-40℃；搅拌速率为100-250rpm。

特别是，在搅拌状态下，分2-5个阶段，且逐级升温，进行五倍子单宁酸与蛋白的结合反应，制备鞣酸蛋白。

尤其是，在搅拌状态下，分3-4个阶段，进行五倍子单宁酸与蛋白质的结合反应，制备鞣酸蛋白

特别是，结合反应时间至少8h，优选为至少16h，进一步优选为20-24h。

尤其是，在搅拌状态下，分4个阶段，且逐级升温，进行五倍子单宁与蛋白的结合反应，制备鞣酸蛋白。

特别是，如果采用2个阶段进行反应的话，则第1反应阶段的温度为10-25℃，优选为20-25℃，进一步优选为25℃；最后一个反应阶段的温度为40-45℃，优选为40℃。

特别是，如果采用3个阶段进行反应的话，则第1反应阶段的温度为10-25℃，优选为20-25℃，进一步优选为25℃；第3反应阶段的温度为40-45℃，优选为40℃；第2反应阶段的温度高于第1阶段反应阶段温度，低于第3反应阶段温度。

尤其是，如果采用3个阶段进行反应的话，3个反应阶段的温度优选为等梯度升温进行反应。例如：如果反应温度为20-40℃，则第1反应阶段的反应温度为20℃，第2反应阶段的反应温度为30℃，第3反应阶段的反应温度为40℃；如果反应温度为15-45℃，则第1反应阶段的反应温度为15℃，第2反应阶段的反应温度为30℃，第3反应阶段的反应温度为45℃；其他反应温度，以此类推。

特别是，如果采用4个阶段进行反应的话，则第1反应阶段的温度为10-25℃，优选为20-25℃，进一步优选为25℃；第4反应阶段的温度为40-45℃，优选为40℃；第2、3反应阶段的温度介于第1阶段与第4反应阶段温度之间，且第2反应阶段温度低于第3反应阶段温度。

尤其是，如果采用4个阶段进行反应的话，4个反应阶段的温度优选为等梯度升温进行反应。例如：如果反应温度为20-40℃，则第1反应阶段的反应温度为20℃，第2反应阶段的反应温度为26.7℃，第3反应阶段的反应温度为33.3℃，第4反应阶段的反应温度为40℃；如果反应温度为15-45℃，则第1反应阶段的反应温度为15℃，第2反应阶段的反应温度为25℃，第3反应阶段的反应温度为35℃，第4反应阶段的反应温度为45℃；如果反应温度为25-40℃，则第1反应阶段的反应温度为25℃，第2反应阶段的反应温度为30℃，第3反应阶段的反应温度为35℃，第4反应阶段的反应温度为40℃；其他反应温度，以此类推。

特别是，如果采用5个阶段进行反应的话，则第1反应阶段的温度为10-25℃，优选为20-25℃，进一步优选为25℃；第5反应阶段的温度为40-45℃，优选为40℃；第2、3、4反应阶段的温度介于第1阶段与第5反应阶段温度之间，且第2、3、4反应阶段的温度逐步升高，即第2反应阶段温度低于第3反应阶段温度，第3反应阶段温度低于第4反应阶段温度。

尤其是，如果采用5个阶段进行反应的话，5个反应阶段的温度优选为等梯度升温进行反应。例如：如果反应温度为20-40℃，则第1反应阶段的反应温度为20℃，第2反应阶段的反应温度为25℃，第3反应阶段的反应温度为30℃，第4反应阶段的反应温度为35℃，第5反应阶段的反应温度为40℃；如果反应温度为15-45℃，则第1反应阶段的反应温度为15℃，第2反应阶段的反应温度为22.5℃，第3反应阶段的反应温度为30℃，第4反应阶段的反应温度为37.5℃，第5反应阶段的反应温度为45℃，其他反应温度，以此类推。

特别是，还包括对结合反应后的反应体系进行过滤，并对滤饼采用水进行洗涤，去除游离单宁酸；然后对滤饼进行干燥处理，干燥后的滤饼即为饲用鞣酸蛋白。

尤其是，干燥处理温度为50-100℃，优选为60℃；干燥至滤饼含水率低于10％，优选为4-6％。

本发明另一方面提供一种按照上述任一方法制备而成的饲用鞣酸蛋白。

本发明方法开发一种五倍子加工筛下物(五倍子蚜虫与残留棓粉)的利用方法，通过简单的操作制备了一种饲用鞣酸蛋白，并对该产品的抗腹泻作用进行了评价，以期作为添加剂将其应用到动物饲料中。通过常规成分分析发现，五倍子加工筛下物中含有一定量的粗蛋白(21.38％)和粗脂肪(36.54％)、粗纤维(6.67％)以及部分单宁酸(6.3％)。为了充分利用其中的营养成分，首先采用高速破壁的方法将五倍子加工筛下物进行匀浆，破坏五倍子蚜虫体表甲壳素，使虫体组织暴露；超声处理辅助棓粉中单宁酸溶出；然后梯度升温，搅拌，使虫体中的蛋白与溶出的单宁酸充分结合；后经过滤与干燥工艺得到鞣酸蛋白产品。

与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：

本发明方法制备的饲用鞣酸蛋白中蛋白质含量高，并且单宁酸与蛋白质结合紧密，经过口腔咀嚼，在唾液淀粉酶的消化作用下，鞣酸蛋白中与蛋白结合的单宁酸不释放，屏蔽了其涩口性，动物食用适口性好，动物食用方便；而且本发明方法制备的鞣酸蛋白在小肠中蛋白与单宁完全释放，为动物生长提供营养。

本发明方法制备的饲用鞣酸蛋白充分利用了五倍子加工筛下物中五倍子蚜虫虫尸的蛋白质和粗脂肪、粗纤维等营养成分，以及棓粉中的单宁组分，制备的鞣酸蛋白产品营养丰富，为畜禽生长提供全面营养。

本发明降低了鞣酸蛋白的生产成本，传统鞣酸蛋白企业是直接采用高含量单宁酸产品或富含单宁酸的原料与蛋白质结合，随着单宁酸原料资源稀缺性困境凸显，单宁酸成本逐年增加，鞣酸蛋白的成本也随之增加，利用五倍子加工筛下物制备鞣酸蛋白可为企业节约生产成本，还将五倍子加工的废弃物得到了充分利用。

本发明方法绿色环保、清洁，制备过程中仅使用水，不添加其他化学试剂，产品质量安全，且不会对环境造成污染。

本发明的鞣酸蛋白的制备工艺路线简单易行，操作工艺条件温和、容易控制，产品质量稳定，适宜工业化生产，充分发挥和利用了工业废弃物五倍子加工筛下物中的营养和功效成分，达到了废弃物资源化利用目的。

本发明解决了五倍子加工厂中废弃物的处理问题，利于环保，又提升了五倍子加工筛下物的利用价值，减少了五倍子加工企业的环保负荷，实现了可持续发展。

附图说明

图1为3种粉碎方式处理筛下物获得的粉末形貌图；其中，a为对照例5；b为实施例1；c为实施例2；

图2为3种粉碎方式处理筛下物获得的粉末的粒径分布图；其中a为对照例5；b为实施例1；c为实施例2；

图3为鞣酸蛋白、原料筛下物、单宁酸的红外光谱图；

图4a为鞣酸蛋白、筛下物、单宁酸的dsc分析曲线图；

图4b为鞣酸蛋白、筛下物、单宁酸的tg分析曲线图；

图5a为鞣酸蛋白和单宁酸在模拟唾液中的消化曲线图；

图5b为鞣酸蛋白和单宁酸在纯水中的消化曲线图

图6为鞣酸蛋白和单宁酸在模拟胃液和小肠液中的消化曲线图；

图7为小鼠大便分级标准图；

图8为小鼠结肠he染色切片图；其中，a为阳性药物组；b为单宁酸高剂量组；c为鞣酸蛋白高剂量组；d为空白对照组；e为模型组。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料与试剂

五倍子加工筛下物为五倍子蚜虫的干虫体、分泌物及残留的棓粉，呈灰黑色，为五倍子破碎后过筛分离后得到，由湖北五峰赤诚生物科技有限公司提供。

五倍子单宁酸(ta，质量分数(纯度)为92.07％)，食用级，五峰赤诚生物科技股份有限公司；石油醚、硫酸、盐酸、氢氧化钾广东光华科技股份有限公司；大豆分离蛋白北京索莱宝科技有限公司；胃蛋白酶阿拉丁试剂上海有限公司；盐酸洛哌丁胺(胶囊，2mg/粒)西安杨森制药有限公司；蓖麻油麦克林公司；0.9％生理盐水广西裕源药业有限公司；4％多聚甲醛南京化学试剂股份有限公司；固体石蜡德国leica公司；he染色试剂盒北京索莱宝科技有限公司。

仪器设备

hr3865飞利浦高速破壁料理机；bilon99-ⅱdl超声波细胞粉碎机(φ25号超声变幅杆)上海比朗仪器有限公司；bp2215分析天平德国赛多利斯集团；101a-2电热鼓风干燥箱上海实验仪器厂；tristarii3020多通道全自动比表面积分析仪美国麦克仪器公司；dsc200f3差示扫描量热仪德国耐驰科学仪器有限公司；tenson27傅里叶变换红外光谱仪德国布鲁克公司；sta2500同步热分析仪德国耐驰科学仪器有限公司；l-8900高速氨基酸分析仪日立高新技术那珂事业所；s3500激光粒度仪美国microtrac公司；凯氏定氮仪；脂肪抽提器。

常规成分分析

水分参照国标gb/t6435-2006《饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定》；粗蛋白质参照gb/t6432-2018《饲料中粗蛋白的测定方法》；粗脂肪参照gb/t6433-2006《饲料中粗脂肪的测定》；粗纤维参照gb/t6434-2006《饲料中粗纤维的含量测定过滤法》；氨基酸参照gb/t18246-2000《饲料中氨基酸的测定》；

本发明实施例中原料五倍子加工筛下物为五倍子破碎后过筛(过20-40目筛)分离后得到筛下物，由湖北五峰赤诚生物科技有限公司提供，五倍子加工筛下物包括五倍子蚜虫的干虫体、分泌物及残留的棓粉，呈灰黑色。

五倍子加工筛下物中单宁酸的含量检测结合标准方法ly/t1083-2008《栲胶原料分析试验方法》、日本食品添加剂标准及文献方法，采用液相色谱法(外标法)进行测定。即参照标准方法ly/t1083-2008《栲胶原料分析试验方法》对五倍子加工筛下物中的单宁酸进行提取，再参照日本食品添加剂标准(即日本食品添加物公定书第八版，2007年，409-410页)及文献(verzelem.anddelahayep..analysisoftannicacidsbyhigh-performanceliquidchromatography[j].j.chromatogr.,1983,268:469-476)中的液相色谱法(外标法)对提取液中的单宁酸含量进行检测。五倍子加工筛下物的单宁酸含量w0为5-10％。

实施例1(连续破壁，cb)

1、超微粉碎处理

将20g筛下物加入200ml水中，其中五倍子筛下物的质量与水的体积之比为1:10(m/v，通常为1：(8-12))，置于破壁料理机中，进行超微粉碎处理，处理时间为3min(通常为2-5min)；破壁料理机功率为1500w(通常为1500-2000w)，转速为20000rpm(通常为15000-25000rpm)，制得五倍子匀浆液(220ml)，其中，五倍子匀浆液中五倍子筛下物粉的粒度为60-100μm，备用；

超微粉碎处理是将五倍子蚜虫干虫体破碎，破坏其虫体表面的甲壳素，让虫体组织表现出来，尤其是使五倍子蚜虫的蛋白质显露出来；同时为后续对棓粉进行进一步破碎，以便其中单宁溶出。

2、超声波处理

将五倍子匀浆液置于超声波细胞粉碎机中，进行超声波处理，获得五倍子破壁匀浆液，其中控制超声波处理的超声波频率20khz(通常为15-25khz)；超声波脉冲(on/off)为4s/9s(通常为3～5s/8～10s)；超声波功率为120w/100ml(通常为100～150w/100ml)；超声时间为25min(通常为20～30min)；超声波处理是利用超声波在样品液中产生的空化效应和机械效应将细胞膜破碎，利于细胞裂解，增加虫体蛋白的溶出和分散性，同时强化棓粉中单宁溶出。

3、结合反应

将五倍子破壁匀浆液置于恒温培养箱中，在搅拌状态下，分4个反应阶段进行五倍子单宁与蛋白的结合反应，其中4个反应阶段的温度分别保持恒定，且后一阶段的反应温度高于前一阶段的反应温度，并且4个反应阶段的温度等梯度升高，其中第一、二、三、四阶段的反应温度分别为25、30、35、40℃，其中搅拌处理的速度为150rpm(通常为100-250rpm)，每个阶段的反应时间为5h(每个阶段的反应时间至少4h，优选为4-6h，进一步优选为5-6h)，即五倍子筛下物中的虫体蛋白质与五倍子单宁酸结合，结合反应20h，生成鞣酸蛋白；

本发明方法中分阶段逐级升温进行结合反应，逐级升温以保证五倍子筛下物原料中的单宁酸和蛋白质逐步溶出，然后再结合，逐级升温可以在一定程度上控制单宁、蛋白成分的溶出速率以及单宁与蛋白的结合速率。

单宁酸与蛋白质的结合有两种情况：1)当单宁酸过量时，单宁酸会逐渐占据蛋白质中的反应位点，通过与蛋白链上的极性基团，如羟基、羧基和肽基等发生氢键结合，在蛋白质表面形成单分子层；2)当蛋白质含量高，与单宁酸结合的位点增多，就会出现一个单宁分子与两个蛋白质结合，形成“蛋白质二聚体”，直至游离单宁酸结合完成，产生的单宁-蛋白粒子更稳定。本发明的五倍子筛下物原料进行鞣酸蛋白结合过程中，单宁与蛋白的溶出和结合是一个动态过程，结合反应温度从低到高，逐级升高，控制单宁酸和蛋白质的溶出过程，使二者的结合更完全。而且结合反应到最后阶段，温度升高，使得蛋白质发生变性，结束蛋白与单宁的结合。

4、过滤、干燥处理

对搅拌处理结束后的混合液进行减压抽滤，并用自来水洗涤滤饼至少3次(通常为3-5次)，至洗涤流出液中不含游离单宁酸(在洗涤流出液中滴入2滴氯化铁(ⅲ)试液，液体无蓝黑色生成，也可以参照ly/t1082-2008在流出液中加入1％明胶-氯化钠溶液，以在60℃加热不产生沉淀为准)；抽滤的滤液与洗涤流出液合并，合并液的体积(v1)为300ml；然后测定合并液中的单宁酸含量(即单宁酸浓度c1)；滤饼置于烘箱中进行干燥处理，干燥温度为60℃(通常为50-100℃)；干燥至滤饼含水率为5％(含水率通常低于10％，优选为4-6％)，制得五倍子鞣酸蛋白(17.1g)。

按照日本食品添加剂标准中液相色谱检测方法测定合并液中单宁酸的浓度，测定结果c1为1.8×10^-4g/ml；

按照公式(1)计算制备的产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率；按照公式(2)计算制备的产品鞣酸蛋白中单宁酸含量；

式(1)中：m1为原料五倍子筛下物的质量(g)；w0为原料筛下物中单宁酸的质量分数(％)；c1为滤液中单宁酸的浓度(g/ml)；v1为滤液的体积(ml)；

式(2)中：m1为原料五倍子筛下物的质量(g)；w0为原料筛下物中单宁酸的质量分数(％)；c1为滤液中单宁酸的浓度(g/ml)；v1为滤液的体积(ml)；m2为制备所得的鞣酸蛋白产品的质量(g)。

产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率为94.6％；鞣酸蛋白中单宁酸含量为7.3％

实施例1a(连续破壁，cb)

1、超微粉碎处理

除了20g五倍子筛下物加入到240ml水中，五倍子筛下物的质量与水的体积之比为1:12(m/v)，超微粉碎处理时间为2min，制得五倍子匀浆液(260ml)之外，其余与实施例1的步骤1相同。

2、超声波处理

除了超声波处理时间为30min，超声波脉冲时间(on/off)为3s/10s(通常为3～5s/8～10s)之外，其余与实施例1的步骤2相同。

3、结合反应

除了结合反应过程中搅拌速度为250rpm；分2个阶段进行，且第一、二阶段反应温度分别为25、40℃；第1、2阶段反应时间为6h之外，其余与实施例1的步骤3相同。

4、过滤、干燥处理

与实施例1的步骤4相同。

制得五倍子鞣酸蛋白(16.1g)；合并液中单宁酸浓度c1为2.7×10^-4g/ml；产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率为93.7％；鞣酸蛋白中单宁酸含量为7.4％。

实施例1b(连续破壁，cb)

1、超微粉碎处理

除了20g五倍子筛下物加入到160ml水中，五倍子筛下物的质量与水的体积之比为1:8(m/v)，超微粉碎处理时间为5min，制得五倍子匀浆液(180ml)之外，其余与实施例1的步骤1相同。

2、超声波处理

除了超声波处理时间为20min，超声波脉冲时间(on/off)为5s/8s(通常为3～5s/8～10s)之外，其余与实施例1的步骤2相同。

3、结合反应

除了结合反应过程中搅拌速度为100rpm；分5个阶段进行，且第1、2、3、4、5阶段的反应温度分别为20、25、30、35、40℃；第1、2、3、4、5阶段反应时间分别为4h、4h、5h、5h、5h之外，其余与实施例1的步骤3相同。

4、过滤、干燥处理

与实施例1的步骤4相同。

制得五倍子鞣酸蛋白(16.9g)；合并液中单宁酸浓度c1为2.4×10^-4g/ml；产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率为95.6％；鞣酸蛋白中单宁酸含量为7.1％。

实施例2(间歇破壁，ib)

1、超微粉碎处理

将20g筛下物加入200ml水中，其中五倍子筛下物的质量与水的体积之比为1:10(m/v，通常为1：(8-12)，置于破壁料理机中，进行间歇式超微粉碎处理，即进行至少2次(通常为2-4次，优选为2-3次)超微粉碎，且相邻两次超微粉碎处理之间间隔2min(通常为间隔1min以上，优选为1-3min)，其中，超微粉碎处理3次，每次处理时间为1min(通常为0.5-2min)；相邻两次处理之间间隔时间为2min(通常为1-3min)，破壁料理机功率为1500w，转速为20000rpm(通常为15000-25000rpm)，制得五倍子匀浆液(220ml)，其中，五倍子匀浆液中五倍子筛下物粉的粒度为40-70μm，备用；

连续破壁过程中物料短时间内达到与剪切转子同步的转速，并始终保持该速度运动。而间歇破壁是一种脉冲过程，物料短时间内达到与剪切转子同步的转速；停止工作后，物料从运动状态慢慢回到静止状态；当转子再次启动时因与物料巨大速度差，转子会对物料产生更大的剪切作用力，使物料破碎更充分。所以与连续破壁处理相比，间歇破壁可以使物料破碎更均匀，从而降低整个匀浆液的粒径范围。另外，破壁料理机在使用过程中要保持高转速，连续运转会造成自身发热量较大，升高匀浆液的温度；间歇破壁有助于控制匀浆液的温度，同时也有助于保护破壁料理机的电机。

2、超声波处理

与实施例1步骤2)“超声波处理”相同。

3、结合反应

与实施例1步骤3)“结合反应”相同。

4、过滤、干燥处理

除了合并液中单宁酸的浓度c1为0.5×10^-4g/ml之外，其余与实施例1步骤3)“过滤、干燥处理”相同。

制得五倍子鞣酸蛋白(16.1g)；合并液中单宁酸浓度c1为0.7×10^-4g/ml；产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率为98.3％；鞣酸蛋白中单宁酸含量为7.5％。

实施例2a(间歇破壁，ib)

1、超微粉碎处理

除了20g五倍子筛下物加入到240ml水中，五倍子筛下物的质量与水的体积之比为1:12(m/v)，间歇式超微粉碎处理的次数为2次，超微粉碎处理时间为2min/次，制得五倍子匀浆液(260ml)之外，其余与实施例2的步骤1“超微粉碎处理”相同。

2、超声波处理

与实施例2的步骤2“超声波处理”相同。

3、结合反应

除了结合反应过程中搅拌速度为250rpm；分2个阶段进行，且第一、二阶段反应温度分别为25、40℃；第1、2阶段反应时间为6h之外，其余与实施例1步骤3相同。

4、过滤、干燥处理

与实施例2的步骤4相同。

制得五倍子鞣酸蛋白(17.5g)；滤液中单宁酸浓度c1为1.0×10^-4g/ml；产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率为97.6％；鞣酸蛋白中单宁酸含量为7.0％。

实施例2b(间歇破壁，ib)

1、超微粉碎处理

除了20g五倍子筛下物加入到160ml水中，五倍子筛下物的质量与水的体积之比为1:8(m/v)，间歇式超微粉碎处理的次数为3次，超微粉碎处理时间为0.5min/次，制得五倍子匀浆液(180ml)之外，其余与实施例2的步骤1“超微粉碎处理”相同。

2、超声波处理

除了控制超声波处理的超声波频率为15khz，超声波处理时间为20min，超声波脉冲时间(on/off)为5s/8s之外，其余与实施例2的步骤2相同。

3、结合反应

除了结合反应过程中搅拌速度为100rpm；分5个阶段进行，且第1、2、3、4、5阶段的反应温度分别为20、25、30、35、40℃；第1、2、3、4、5阶段反应时间分别为4h之外，其余与实施例2的步骤3相同。

4、过滤、干燥处理

与实施例2的步骤4相同。

制得五倍子鞣酸蛋白(16.5g)；滤液中单宁酸浓度c1为0.5×10^-4g/ml；产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率为98.7％；鞣酸蛋白中单宁酸含量为7.6％。

对照例1(连续破壁，cb)

除了步骤3)结合反应过程中，五倍子破壁匀浆液在温度保持恒定为25℃的条件下，反应30h之外，其余与实施例1相同。

对照例2(连续破壁，cb)

除了步骤3)结合反应过程中，五倍子破壁匀浆液在温度保持恒定为40℃的条件下，反应20h之外，其余与实施例1相同。

对照例3(间歇破壁，ib)

除了步骤3)结合反应过程中，五倍子破壁匀浆液在温度保持恒定为20℃的条件下，反应30h之外，其余与实施例2相同。

制得五倍子鞣酸蛋白(16.8g)；滤液中单宁酸浓度c1为0.4×10^-4g/ml；产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率为99.0％；鞣酸蛋白中单宁酸含量为7.7％。

对照例4(间歇破壁，ib)

除了步骤3)结合反应过程中，五倍子破壁匀浆液在温度保持恒定为40℃的条件下，反应20h之外，其余与实施例2相同。

制得五倍子鞣酸蛋白(16.3g)；滤液中单宁酸浓度c1为0.7×10^-4g/ml；产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率为98.1％；鞣酸蛋白中单宁酸含量为7.3％。

对照例5(机械破碎，ma)

1、机械粉碎处理

将20g筛下物加入200ml水中，其中五倍子筛下物的质量与水的体积之比为1:10(m/v)，置于烧杯中，采用电动搅拌器进行机械搅拌粉碎处理，机械搅拌处理时间为2h(通常为1-3h)；搅拌机功率为250w，转速为1000rpm(通常为500-1500rpm)，制得粉碎五倍子液，其中粉碎五倍子液中五倍子筛下物破壁粉的粒度为250-400μm，备用；

2、超声波处理

与实施例1步骤2)“超声波处理”相同。

3、结合反应

与实施例1步骤3)“结合反应”相同。

4、过滤、干燥处理

除了滤液中单宁酸的浓度c1为7.5×10^-4g/ml之外，其余与实施例1步骤4)“过滤、干燥处理”相同。

产品鞣酸蛋白中单宁酸结合率为82.2％；鞣酸蛋白中单宁酸含量为5.9％。

试验例1五倍子筛下物粉碎处理后的粒径、比表面积分析

1、粒径检测

采用美国microtrac公司s3500激光粒度仪对实施例1、2；对照例5中步骤1制备的五倍子匀浆液中筛下物粉末的粒径分布进行表征。设定仪器参数，分散液折射率设定为1.33，样品折射率设置为1.6，间隔时间为10s，循环测定三次，将五倍子加工筛下物匀浆液滴加至样品池，输出样品的形貌图(图1)及筛下物粉末粒径分布(如图2)。

2、比表面积测定：

将实施例1、2；对照例5中步骤1制备五倍子匀浆液冻干后的样品在60℃脱气预处理24h后，采用美国麦克tristarii3020比表面积测定仪测定样品的比表面积，测定结果如表1。

由图1可知，ib(间歇破壁处理)破碎后的样品中球形微粒的数目明显多于其他两个样品；由图1和表1可知，ib可以获得更小更均匀的粒径，具有更大的接触面积，一方面有利于水溶性单宁酸的溶出，另一方面也增大了虫尸筛下物中蛋白与单宁酸的结合位点，更有利于二者的反应。

表13种粉碎方式样品的粒径及比表面积

试验例2鞣酸蛋白的成分含量分析

1、单宁酸提取及含量检测方法：

称取25g(干基)五倍子加工筛下物，过20目筛，参照标准方法ly/t1083-2008《栲胶原料分析试验方法》中总抽出物的方法制备样品溶液：在抽提器中用水将五倍子加工筛下物中的单宁酸浸提出来，定容后作为样品测试溶液，采用液相色谱法(外标法)测定单宁酸含量，具体条件如下：

美国安捷伦公司的aglient1200lc系统，zorbax5sb-c18(250x4.6mm，5μm)，流动相为(a)0.1w/v％磷酸水溶液+(b)0.1w/v％磷酸甲醇溶液，a:b(80:20)-a:b(0:100)梯度洗脱30min，流速1.8ml/min，检测波长280nm，进样体积10μl，柱温25℃。记录8-20min时间段内出现的所有峰面积，作为单宁酸的峰，绘制单宁酸标准曲线，采用外标法计算样品中单宁酸的含量，标准曲线方程为：y＝29504x-7961.54，r²＝0.9987，测定结果如表2。

2、蛋白质含量检测方法：

五倍子加工筛下物原料、制备的鞣酸蛋白产品中蛋白质的含量采用瑞典foss公司2300凯氏定氮仪进行测定，测定结果如表2。

3、样品得率：

称量干燥后所得鞣酸蛋白的质量，以干基五倍子加工筛下物为基准，计算样品得率。单宁酸结合率，测定结果如表2：

参照前面所述液相色谱方法测定实施例1、2；对照例5步骤4)“过滤、干燥处理”的合并液中单宁酸的浓度，计算合并液中单宁酸的总量，以五倍子加工筛下物原料中单宁酸的含量为基准，计算单宁酸的结合率，测定结果如表2。

表2不同粉碎方法的鞣酸蛋白产品的单宁酸、蛋白含量、得率测试结果

经过不同破碎方式处理后所得鞣酸蛋白样品得率及样品中单宁酸、蛋白含量如表2所示。原料五倍子筛下物中蛋白质的含量为21.4％，经过超微粉碎、超声波处理后，筛下物中的单宁酸被浸提出来，并与蛋白质结合，其他水溶物的溶出导致最终所得鞣酸蛋白样品的质量低于初始原料质量，同时导致鞣酸蛋白样品中蛋白质含量的增加。

试验例3红外分析

将实施例2制备的鞣酸蛋白、原料五倍子筛下物、五倍子单宁酸样品研磨后经kbr压片，采用tenson27傅里叶变换红外光谱仪进行红外分析，ftir分析条件为：扫描范围为4000～400cm^-1，分辨率为4cm^-1；分析结果如图3。

从图3可以看出，原料筛下物和产品鞣酸蛋白在2923cm^-1和2856cm^-1处有-c-(ch2)-c-中的c-h键伸缩振动，在1711cm^-1处有c＝o伸缩振动，判断是筛下物原料中五倍子蚜虫所含的脂肪碳。筛下物原料和鞣酸蛋白中都含有一定量的蛋白质，所以，红外谱图在3296cm^-1(蛋白酰胺i带的n-h拉伸)、1659cm^-1(蛋白酰胺i带c＝o拉伸)、1533cm^-1处(蛋白酰胺ii带c-n拉伸，加上n-h弯曲模式)和716cm^-1处(酰胺n-h面外变形振动)均有吸收，比较筛下物原料和鞣酸蛋白的红外谱图，蛋白质与单宁酸作用后在1659cm^-1、1533cm^-1和716cm^-1波长下均有吸收强度的变化。1620cm^-1处为单宁酸中芳香c＝o的吸收，筛下物原料在该波长下也有吸收，与蛋白质结合后的鞣酸蛋白中这个峰与1659cm^-1处合并为一个峰，预示着单宁和蛋白质之间氢键的形成。

试验例4dsc和tg分析

采用sta2500同步热分析仪对实施例2制备的鞣酸蛋白、原料五倍子筛下物、五倍子单宁酸进行热重分析，吹扫和保护气氛均为高纯氮(体积分数≥99.99％)，流速分别为50和20ml/min，差示扫描量热(dsc)分析：以10k/min的速率从0℃升至400℃；热重(tg)分析：以10k/min的速率从35℃升至800℃；分析结果如图4a、4b。由图4a可知：筛下物在43.7℃有熔融峰，鞣酸蛋白样品的dsc曲线中在39.9℃也有熔融峰，应该是五倍子蚜虫中的生物脂质。单宁酸的熔融峰值温度为91.3℃，鞣酸蛋白样品在该温度下也有吸热，因为鞣酸蛋白是游离单宁酸与蛋白质以氢键等方式结合后的样品，仍保留部分单宁酸的性质。在热重曲线(图4b)中，鞣酸蛋白的热失重起始温度在200℃左右，高于原料筛下物的热失重起始温度189.4℃，低于单宁酸的热失重起始温度251.3℃，也可以证明上述推断。

试验例5鞣酸蛋白在模拟唾液中的释放

1药物与试剂

单宁酸(含量＞92％)，食用级，五峰赤诚生物科技股份有限公司，批号：20200808；实施例2、对照例3、4制备的鞣酸蛋白；α-淀粉酶，氯化钙

2试验方法与结果

2.1模拟唾液中单宁酸的释放方法

分别精确称取实施例2、对照例3、4制备的鞣酸蛋白各2g，单宁酸0.16g分别置于锥形瓶中，接着加入40ml去离子水，随后加入溶解在0.25mlcacl2(1mmol/l，ph7.0)溶液中的α-淀粉酶2.00mg，37℃恒温摇床中反应，分别在反应0min、1min、3min、5min、10min、20min和30min取出2ml消化液，并补充2ml空白消化液，测溶液中单宁酸的浓度，按照公式(3)计算单宁酸释放率。以同样的方法测定了以上样品在不加消化酶的水溶液中的变化。

2.2试验结果

由图5a和图5b可以看出，单宁酸在纯水中的浓度保持不变，而在模拟唾液中的含量呈明显下降趋势，这与文献报道一致，游离单宁酸与唾液淀粉酶结合，这也是单宁酸具有涩口性的原因。3种鞣酸蛋白在纯水中均无释放，实施例2和对照例4制备的鞣酸蛋白中的单宁酸在模拟唾液中也基本无释放，而对照例3制备的鞣酸蛋白中的单宁酸在模拟唾液中有小部分释放，影响畜禽饲用的适口性，推测是因为结合过程中未升温，导致单宁酸与蛋白的结合不如另外两个样品稳定。但从整体结果可以看出，制得的鞣酸蛋白产品可以占据单宁酸的反应位点，同时鞣酸蛋白中的单宁酸在模拟唾液中30min基本不会释放，从而避免了单宁酸与唾液中的淀粉酶结合导致的涩口性，减小了对动物取食量的影响。

试验例6鞣酸蛋白在模拟小肠液中的释放

1药物与试剂

单宁酸(含量＞92％)，食用级，五峰赤诚生物科技股份有限公司，批号：20200808；实施例2、对照例3、4制备的鞣酸蛋白；胃蛋白酶，胰蛋白酶，浓盐酸、碳酸氢钠。

2试验方法与结果

2.1模拟胃肠液中单宁酸的释放方法

分别精确称取实施例2、对照例3、4制备的鞣酸蛋白各2g，单宁酸0.16g，分别各自置于100毫升锥形瓶中，加入40ml去离子水，用6mol/lhcl溶液将溶液ph值调节至2.00，加入溶解在1mlhcl溶液(0.1mol/l)中的胃蛋白酶48mg，37℃恒温水浴摇床中反应，分别在模拟胃液消化的0min、30min、60min、90min和120min取出2ml消化液，测定单宁酸浓度，并补充2ml空白消化液；然后用6mol/l的naoh将以上消化液的ph值调节至6.80，随后加入溶解在nahco3溶液(0.5mol/l，2ml)中的胰蛋白酶(20mg)，37℃恒温水浴摇床中反应，在模拟肠液消化的30min、60min、120min和180min取出2ml的消化液，测定单宁酸浓度，参照试验例5中的公式(3)计算单宁酸释放率。

2.2试验结果

由图6可以看出，在模拟胃液中3个鞣酸蛋白样品中的单宁酸均有释放，对照例3的释放率比实施例2和对照例4高，这与模拟唾液中的测定结果基本一致。在模拟肠液中，鞣酸蛋白被逐渐消化分解，单宁酸的释放量逐渐增大，并且本发明方法制备的鞣酸蛋白，即实施例2在模拟胃液中保持较低的释放率，在模拟肠液中大量释放，保证鞣酸蛋白的营养成分均能被饲用的畜禽利用。而保持低温结合的对照例3，由于单宁酸的溶出较慢，降低了单宁酸与蛋白质的结合率和结合强度，所得到的鞣酸蛋白的稳定性较低，在模拟胃液及肠液中的释放速率都较快；保持较高结合温度的对照例4，单宁酸就会更快溶出，并与蛋白质形成稳定的单宁-蛋白粒子，结合强度高，不利于单宁酸与蛋白质粒子分解与释放，影响畜禽对饲料的吸收。另外由于在较高结合温度下，蛋白质部分变性，导致其与单宁酸结合的活性部位失活，降低了与单宁酸的结合率；同时蛋白质变性将单宁酸包裹在其内部，影响了单宁酸的释放。由此可见，单宁酸和蛋白的结合温度对最终产品的稳定性有较大的影响。

试验例7鞣酸蛋白抗腹泻作用

1.1药物与试剂

单宁酸(含量＞92％)，食用级，五峰赤诚生物科技股份有限公司，批号：20200808；以中国药品生物制品检定所提供的五倍子单宁酸标准品对照并进行hplc标定，含量为92.07％；

实施例2制备的鞣酸蛋白；

阳性对照药：盐酸洛哌丁胺，杭州胡庆余堂药业有限公司，批号111231。

1.2动物

雄性健康清洁级icr小鼠45只，体重20±2g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

置于温度20-25℃，相对湿度为55±5％的环境中，12h光照/12h黑暗，通风，自由采食饮水，饲养一周，无异常反应后开始实验。

小鼠使用遵守国家动物福利法规《关于善待动物的指导性意见》，小鼠使用方案经中国林业科学研究院资源昆虫研究所伦理委员会批准进行，且所有动物实验均是按照《实验动物的护理和使用指南》进行。

2试验方法与结果

2.1腹泻影响

实验前将小鼠随机分为9组，即为：空白对照组；腹泻模型组；阳性药物(盐酸洛哌丁胺)对照组(0.01g/kg)；单宁酸高、中、低剂量组(0.75、0.5、0.25g/kg)；鞣酸蛋白高、中、低剂量组(9.00、6.00、3.00g/kg)，每组5只。

实验前将各组小鼠禁食不禁水8h，随后称取小鼠体重，并给予空白对照组，模型组灌服生理盐水(10ml/kg)，其余各组按照表5中的剂量分别灌服等体积对应浓度药液，上述预处理1小时后，除空白对照组灌服0.5ml生理盐水外，所有动物均灌服0.5ml蓖麻油，随后小鼠单笼饲养，笼下铺洁净滤纸，每1h更换一次滤纸，记录小鼠初始排便的时间、6小时内排便次数及湿粪便数量。小鼠大便可分为4种(图7)：正常便；外形正常但含水分多；外形不正常的软便及水样便，将前2种视为正常便，后2种视为腹泻便，同时参照公式(3)计算小鼠腹泻抑制率。

试验数据均平行处理3次，结果以平均值±标准偏差表示。

试验数据均平行处理3次，结果以平均值±标准偏差表示。测定结果如表3所示。

表3鞣酸蛋白对蓖麻油诱导的小鼠腹泻的影响

如表3所示，在蓖麻油致泻模型中，单宁酸和鞣酸蛋白的所有剂量组均可不同程度延迟腹泻发作时间，对蓖麻油诱导小鼠腹泻有抵抗作用。其中，单宁酸和鞣酸蛋白的高剂量组有较高的腹泻抑制率，略低于阳性药物组。本研究中鞣酸蛋白的添加量是按照其中所含单宁酸的量与游离单宁酸的添加量相等来选取的，但二者的抗腹泻作用却有一定的差异。同样是中剂量组，游离单宁酸的腹泻抑制率低于鞣酸蛋白，而低剂量组鞣酸蛋白腹泻抑制率却低于游离单宁酸。分析是与单宁酸和蛋白之间的结合有关，游离单宁酸在到达肠部之前，会与体内的蛋白质产生一定的结合，当单宁酸相对于蛋白是过量的时候，单宁酸会逐渐占据蛋白质中的反应位点，通过与蛋白链上的极性基团，如羟基、羧基和肽基等发生氢键结合，在蛋白质表面形成单分子层，到达肠部后单宁酸不容易被释放出来。相反，若单宁酸浓度较小，此时蛋白质是过量的，可以与单宁酸结合的位点也逐渐增多，就会出现一个单宁分子与两个蛋白质结合，形成“蛋白质二聚体”，该单宁-蛋白粒子中蛋白含量更高，到达肠部后随着蛋白的消化，单宁酸更容易被释放出来。

2.2肠道he染色切片

取各组小鼠结肠组织，用生理盐水漂洗去肠道内容物，用滤纸吸去多余水分，置于固定液中固定。随后采用石蜡包埋、切片、he染色后，在光学显微镜下观察，如图8。

由图8可知，空白对照组大鼠结肠组织正常，黏膜完整，杯状细胞排列整齐，无明显水肿及炎性细胞浸润，肌层厚薄均匀适中，肌层无异常。模型组结肠组织结构明显异常破损，杯状细胞减少，且有大量的炎性细胞浸润。阳性药物组、单宁酸高剂量组与鞣酸蛋白高剂量组结肠组织结构较为完整，杯状细胞排列均匀，无明显的炎性细胞浸润，肌层基本无异常，与小鼠腹泻试验结果保持一致。

本发明采用简单的破碎、超声和控温搅拌操作制备了一种鞣酸蛋白，充分利用了五倍子加工筛下物中的营养成分和单宁酸，通过测定反应液中残留的单宁酸发现，原料中96％以上的单宁酸被结合到鞣酸蛋白产品中。通过蓖麻油诱导小鼠抗腹泻模型试验结果表明，该鞣酸蛋白对蓖麻油诱导的小鼠腹泻有明显的抑制作用。本发明既解决了五倍子加工厂中废弃物的利用问题，又提高了五倍子加工筛下物的价值，同时也为该鞣酸蛋白产品在畜禽饲料中的应用提供了方法。

本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。